針刀對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型兔的實(shí)驗(yàn)研究

劉廣宇 張曉峰

摘要 目的：觀察小針刀對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型組織形態(tài)及其關(guān)節(jié)軟骨MMP-9及COX-2的變化。方法：將30只新西蘭兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刀組，各10只。其中模型組及針刀組接受KOA模型制作，假手術(shù)組及模型組不接受任何干預(yù)措施，針刀組在造模第2天起利用針刀以縱疏、橫剝法為手法對(duì)膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)副韌帶及髕尖下正中點(diǎn)進(jìn)行松解，每周1次，共治療4周，每周每只兔子右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射丹參注射液0.6 mL，連用4周（增加丹參注射液的使用）。治療結(jié)束后光鏡下觀察3組兔膝關(guān)組織形態(tài)變化，并用Western blotting法關(guān)節(jié)軟骨MMP-9及COX-2濃度變化。結(jié)果：1）HE染色后模型組、針刀組新西蘭兔膝關(guān)節(jié)均有不同程度的水腫、增生，其中針刀組較模型組改善；此外模型組膝關(guān)節(jié)軟骨還可見一定程度退行性改變。2）與假手術(shù)組比較，模型組及針刀組兔膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-9及COX-2濃度均升高，其中模型組升高的趨勢(shì)更明顯（P<0.05），針刀干預(yù)后針刀組上述兩指標(biāo)水平較模型組下降（P<0.05）。3）使用Pearson法進(jìn)行MMP-9、COX-2濃度變化的相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)關(guān)系，結(jié)論：針刀松解術(shù)可明顯改善膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨退變，其機(jī)制可能與降低MMP-9及COX-2有關(guān)。

關(guān)鍵詞 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎；KOA；針刀；MMP-9；COX-2

Abstract Objective：To observe acupotomy on the morphology of knee osteoarthritis rabbits model and the changes of MMP-9 and COX-2 in the articular cartilage. Methods： Thirty New Zealand rabbits were randomly divided into a sham-operate group， a model group and an acupotomy group， 10 models in each. The model group and the acupotomy group were made into KOA model， while the sham-operate group and then model group didn′t accept any interventions. The acupotomy group released the lateral collateral ligament and the patellar ligament on the second day of molding by acupotomy with vertical and horizontal strip method， once a week， for 4 weeks′ treatment. After the treatment， knee histomorphology changes under light microscope of the three groups of rabbits were observed， and concentration changes of articular cartilage MMP-9 and COX-2 were tested by Western blotting. Results： 1） After HE dyeing， the model group， the acupotomy group of New Zealand rabbits′ knees all have different degrees of edema and hyperplasia， and the improvements in the acupotomy group was better than that in the model group； a certain degree degenerative changes were also visible in the knee joint cartilage of the model group. 2） Compared with the sham-operate group， MMP-9 and COX-2 concentration of articular cartilage increased in both of the model group and the acupotomy group， but the increasing trend of the model group was more obvious （P<0.05）. After acupotomy intervention， the above two index levels in the acupotomy group dropped more than those in the model group （P<0.05）. 3）Using Pearson method to analyze MMP-9 and COX-2 correlation， the results showed that MMP-9 levels was positively correlated with COX-2 （P<0.05）. Conclusion： Acupotomy can improve cartilage degeneration of the knee osteoarthritis of model rabbits obviously， and the mechanism maybe related to the reduction of MMP-9 and COX-2.

Key Words Knee osteoarthritis； KOA；Acupotomy； MMP-9；COX-2

中圖分類號(hào)：R245文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.050

膝骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是中老年人常見骨關(guān)節(jié)疾患，以關(guān)節(jié)軟骨退變及骨贅生成為主要病理特征[1]。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來，OA患者日趨增多，目前針對(duì)OA的療法有保守治療及手術(shù)治療2大類，其中藥物為主的保守治療雖可達(dá)到一定療效，但西藥的易耐受及中藥的療程長(zhǎng)均影響患者的依從性，手術(shù)療法易出現(xiàn)手術(shù)殘留，對(duì)患者身心創(chuàng)傷較大，故一種療效持續(xù)、不易耐受、安全性高的治療手段呼之欲出。小針刀結(jié)合中醫(yī)的“針”及西醫(yī)的“刀”，對(duì)膝關(guān)節(jié)周圍的肌腱韌帶等軟組織的粘連、攣縮和瘢痕等可行橫向剝離和縱向疏通，沒有嚴(yán)格適應(yīng)癥，費(fèi)用較手術(shù)費(fèi)用低。因此本研究以KOA模型新西蘭兔為研究對(duì)象，旨在觀察小針刀對(duì)OA的療效及作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 取30只新西蘭兔，平均體重（2.2±0.18）kg，所有動(dòng)物均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置：室溫23～25 ℃，相對(duì)濕度（56±6）%。

1.1.2 試劑與儀器 針刀（0.4×0.4 mm漢章醫(yī)療器械有限公司），樹脂繃帶（安平縣康利醫(yī)療器械有限公司），乙醇（岳陽(yáng)市君華化工有限公司），蘇木素（上海生工生物有限公司），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰公司），PI3K、AKT、β-acting抗體、鼠抗兔HRP-二抗（CST公司），二甲苯（上海泰正化工有限公司），石蠟（濟(jì)南鑫厚商貿(mào)有限公司），切片機(jī)（FS/FAS5030石蠟切片機(jī)，德國(guó)LETIZ公司），電泳液（碧云天公司），轉(zhuǎn)膜液（碧云天公司），配膠試劑盒（碧云天公司），酶標(biāo)定量測(cè)定儀（Thermo Multiskan AsCant公司），可調(diào)控溫度離心機(jī)（Eppendorf公司）。水合氯醛（武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司），丹參注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 30只新西蘭兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及針刀組，各10只。模型組及針刀組兔接受Vidman法進(jìn)行KOA模型的制作，將動(dòng)物用10%水合氯醛以0.3 mL/kg進(jìn)行麻醉固定牽拉，使動(dòng)物處于完全伸直狀態(tài)，將樹脂繃帶置于（70±5）℃環(huán)境下進(jìn)行浸泡軟化，固定于動(dòng)物腹股溝至腳踝處，使膝關(guān)節(jié)保持伸直180°狀態(tài)，從動(dòng)物足趾處觀察血供情況，共制動(dòng)4周，制動(dòng)結(jié)束后從模型組及針刀組隨機(jī)選取2只動(dòng)物進(jìn)行影像學(xué)及形態(tài)學(xué)評(píng)估，提示造模成功后拆除動(dòng)物樹脂繃帶。造模過程中若動(dòng)物出現(xiàn)皮膚感染、肢體潰爛壞死等均予剔除。所有動(dòng)物置12/12晝夜交替燈光周期。

1.2.2 干預(yù)方法 假手術(shù)組及模型組兔不接受任何干預(yù)手段，回籠飼養(yǎng)。針刀組兔接受小針刀松解術(shù)，具體操作如下：造模成功后1周對(duì)兔進(jìn)行針刀松解術(shù)，先將兔麻醉后利用龍膽紫藥水標(biāo)注進(jìn)針點(diǎn)，以內(nèi)外側(cè)副韌帶及髕尖下正中點(diǎn)為進(jìn)針點(diǎn)，1）內(nèi)外側(cè)副韌帶：刀口線平行于韌帶，并以韌帶中點(diǎn)為進(jìn)針處，刀體垂直于皮膚迅速刺入直達(dá)韌帶，分別向韌帶起止點(diǎn)方向進(jìn)行松解；2）髕尖下正中點(diǎn)：刀口線平行于髕韌帶，刀體垂直快速刺入皮膚，直入脂肪墊，縱向、橫向疏通剝離1～3刀，然后將刀體呈45°向下傾斜，刀口深入直達(dá)髕骨下極，縱向、橫向剝離1-3刀，將脂肪墊與髕骨下緣的粘連徹底松解，刀下有松動(dòng)感后出刀。在內(nèi)外側(cè)副韌帶及髕尖下正中點(diǎn)進(jìn)針時(shí)均采用縱疏橫剝離等手法，治療結(jié)束出針時(shí)即刻按壓數(shù)分鐘，每周治療1次，共治療4周。每周每只兔子右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射丹參注射液0.6 mL，注射后屈伸膝關(guān)節(jié)20次，連用4周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 一般情況觀察評(píng)定 干預(yù)結(jié)束后對(duì)各組新西蘭兔一般情況進(jìn)行觀察，主要包括動(dòng)物的反應(yīng)性、攝食及攝水量，皮毛生長(zhǎng)情況及光澤度，肢體活動(dòng)度，步態(tài)。見表1。

1.2.3.2 取材固定 所有動(dòng)物在治療結(jié)束1周采用空氣栓塞法處死，處死后將動(dòng)物置于超凈工作臺(tái)冰面上，快速取出造模側(cè)股股外側(cè)髁處新鮮軟骨2塊，大小均約1×1 cm，標(biāo)本A快速置于福爾馬林中進(jìn)行固定，標(biāo)本B置于5%硝酸溶液。標(biāo)本A固定一周后取出進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，染色，后在光鏡子下觀察形態(tài)學(xué)情況。標(biāo)本B脫鈣15 d后取出，用PBS沖洗2次，10 min/次，后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.3.3 Western-blot檢測(cè)MMP-9及COX-2的表達(dá) 將收集的EPCs細(xì)胞收集加入100 μL裂解液進(jìn)行細(xì)胞分裂，放入4 ℃振蕩器中持續(xù)震蕩30 min，并將液體用移液槍轉(zhuǎn)移至事先預(yù)冷離心管，再次置于4 ℃離心機(jī)中以5 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心15 min，用移液槍將上清液抽取至新的離心管中備用。利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，并在100 ℃水浴中進(jìn)行蛋白變性7 min，并計(jì)算上樣量。事先配制好SDS-PAGE膠體，用移液槍將蛋白加之膠體中進(jìn)行電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，隨后用脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h，用PBS清洗2次，10 min/次，加加1∶500稀釋的一抗（MMP-9及COX-2）及內(nèi)參抗體（β-acting，1∶3 000）室溫孵育2 h，用PBS清洗2次，10 min/次，隨后加入辣根過氧化酶HRP-二抗，室溫下輕搖2 h取出繼續(xù)PBS清洗2次，10 min/次，最后利用ECL顯影，拍照，統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)采用t檢驗(yàn)，兩等級(jí)資料進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組兔一般情況比較 造模后假手術(shù)組動(dòng)物精神情況良好，攝食正常，四肢活動(dòng)度及反應(yīng)性較靈敏，且皮毛旺盛有光澤。模型組及針刀組動(dòng)物造模后均出現(xiàn)不同程度精神疲乏，對(duì)外界的刺激反應(yīng)較造模前減弱，膝關(guān)節(jié)僵硬活動(dòng)度差，皮毛較亂且光澤減弱，經(jīng)過為期4周的針刀干預(yù)后針刀組實(shí)驗(yàn)兔上述情況有明顯改善，但與假手術(shù)組比較仍存在膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度較差，步行稍跛行的現(xiàn)象。

2.2 各組組織形態(tài)學(xué)變化情況 假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)未發(fā)生變化，軟骨表面結(jié)構(gòu)及厚度均正常，軟骨細(xì)胞排列均勻有序，潮線清晰可見。模型組膝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，厚薄不均，完整性受破壞，軟骨細(xì)胞不同程度壞死，細(xì)胞排列錯(cuò)亂，潮線扭曲斷裂甚至重疊。針刀組形態(tài)學(xué)較模型組有明顯改善，但仍可見軟骨表面些許破壞，軟骨細(xì)胞存在一部分排序紊亂，血管數(shù)量較模型組增加，偶可見潮線重疊。見圖1。

2.3 各組MMP-9及COX-2蛋白表達(dá)的變化 與假手術(shù)組比較，模型組及針刀組兔膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-9及COX-2濃度均升高，其中模型組升高的趨勢(shì)更明顯（P<0.05），針刀干預(yù)后針刀組上述兩指標(biāo)水平較模型組下降（P<0.05）。見表2、圖2。

2.4 相關(guān)性分析 使用Pearson法進(jìn)行MMP-9、COX-2濃度變化的相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)I兩者呈正相關(guān)關(guān)系。見表3。

3 討論

20世紀(jì)30年代美國(guó)研究者Bennett等利用狗髕骨脫位法復(fù)制出OA模型，之后Pond及Nuki將實(shí)驗(yàn)狗前交叉韌帶切斷，制備出著名的Pond Nuki OA模型，隨后不斷有研究人員改進(jìn)OA動(dòng)物模型，但多數(shù)OA模型需手術(shù)實(shí)現(xiàn)，關(guān)節(jié)打開后易對(duì)關(guān)節(jié)軟骨及滑膜產(chǎn)生創(chuàng)傷，影響其生化代謝，此外手術(shù)可能誘發(fā)感染導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部發(fā)生一系列病理變化，最終影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[2-4]。關(guān)節(jié)制動(dòng)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生破壞，這為現(xiàn)代研究人員提供了造模新思路。動(dòng)物關(guān)節(jié)制動(dòng)5～6周可出現(xiàn)OA明顯的特征，實(shí)現(xiàn)了最大程度還原疾病情況的目的，同時(shí)此造模方法規(guī)避了麻醉或手術(shù)導(dǎo)致的混雜因素，紀(jì)斌平等研究人員均制動(dòng)動(dòng)物膝關(guān)節(jié)理想地模擬了OA的發(fā)病過程，基于此本研究亦采用制動(dòng)新西蘭兔膝關(guān)節(jié)造模，最大程度避免人為損傷。

小針刀結(jié)合中醫(yī)理論及西醫(yī)外科手術(shù)原理，是中醫(yī)在現(xiàn)代發(fā)展道路上的新產(chǎn)品，中醫(yī)“陰平陽(yáng)秘、精神乃治”的陰陽(yáng)平衡理論及西醫(yī)閉合性松解術(shù)是指導(dǎo)小針刀臨床操作的首要方法學(xué)。膝關(guān)節(jié)生理解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生理動(dòng)作及關(guān)節(jié)穩(wěn)定性主要靠股骨、脛骨、髕骨及其韌帶、肌肉實(shí)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)是人體承受重量最大的關(guān)節(jié)，其運(yùn)動(dòng)姿勢(shì)多樣，勢(shì)必導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)受損的可能性最大，日久耗損膝關(guān)節(jié)軟骨變性，甚至壞死，贅骨生成等，其屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”“痹證”范疇，脈絡(luò)瘀阻是其主要病機(jī)，因此松解黏連、疏通經(jīng)絡(luò)是其主要治療原則[5]。小針刀的治療點(diǎn)，主要通過觸診，根據(jù)中醫(yī)治法“病在筋，調(diào)之筋”，主要是“以痛為腧”，結(jié)合臨床常見治療點(diǎn)，確定內(nèi)外側(cè)副韌帶、髕上正中點(diǎn)為治療點(diǎn)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)KOA造模后實(shí)驗(yàn)兔均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，經(jīng)過針刀干預(yù)后癥狀較模型組明顯改善，這說明針刀以“以痛為腧”理念下有效改善了模型實(shí)驗(yàn)兔的OA的癥狀。我們?cè)谶M(jìn)一步形態(tài)學(xué)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，OA模型動(dòng)物膝關(guān)節(jié)的軟骨及其滑囊等結(jié)果均出現(xiàn)不同程度的病理變化，在光鏡下可見軟骨表面粗糙，厚薄不均，完整性受破壞，軟骨細(xì)胞不同程度壞死，細(xì)胞排列錯(cuò)亂，潮線扭曲斷裂甚至重疊，小針刀療法明顯改善了OA的病理學(xué)表現(xiàn)，發(fā)揮了保護(hù)軟骨的效應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)與國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)結(jié)果一致[6-11]。

在對(duì)針刀作用機(jī)制的進(jìn)一步探析中我們對(duì)各組實(shí)驗(yàn)兔關(guān)節(jié)軟骨的MMP-9及COX-2進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過發(fā)現(xiàn)MMP-9及COX-2在OA發(fā)生后濃度均上調(diào)。MMP家族在細(xì)胞外基質(zhì)降解系統(tǒng)中占據(jù)重要位置，MMP-9是該家族主要成員，承擔(dān)基質(zhì)溶解的角色，不但對(duì)蛋白多糖、層粘連蛋白、纖維結(jié)合素等有溶解效應(yīng)，還可通過原膠原酶作用而滅除I、II、III型膠原的N、C末端肽。此外MMP-9還可激活其家族另一個(gè)成員MMP-1，導(dǎo)致膠原病理性降解。本研究中我們發(fā)現(xiàn)MMP-9在OA模型中濃度上調(diào)，這說明在關(guān)節(jié)軟骨的高表達(dá)導(dǎo)致其周圍細(xì)胞外基質(zhì)降解明顯，從而出現(xiàn)了一系列病理變化[12-14]，而小針刀可一定程度通過松解關(guān)節(jié)粘連促使MMP-9趨于正常水平，糾正病理改變。我們還檢測(cè)了COX-2，其乃一類環(huán)氧化酶，與疼痛密切相關(guān)，當(dāng)COX-2被激活后合成增加，進(jìn)一步參與了機(jī)體炎性反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)，加劇了疼痛癥狀，在研究中我們亦發(fā)現(xiàn)COX-2在OA模型動(dòng)物中有高表達(dá)，而隨著針刀治療的繼續(xù)，其濃度隨之降低，我們還發(fā)現(xiàn)MMP-9及COX-2存在一定相關(guān)性，說明小針刀可明顯改善OA，這個(gè)可能與通過抑制MMP-9及COX-2表達(dá)有關(guān)。

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（2017-03-06收稿 責(zé)任編輯：徐穎）