羅漢果祛痰作用譜效關(guān)系研究

王勤 肖喜泉 董威 唐慧勤 盧鳳來(lái) 李耀華 李典鵬 王劍 林吳

摘要： 為了研究羅漢果祛痰作用與活性成分的相關(guān)性，該研究首先測(cè)定了19批羅漢果提取物高效液相（HPLC）指紋圖譜和小鼠氣管酚紅排泌量，找出了指紋圖譜共有峰，采用灰色關(guān)聯(lián)度法確定各共有峰對(duì)祛痰效果貢獻(xiàn)度，利用偏最小二乘法（PLS）得出了各共有峰的正負(fù)相關(guān)及貢獻(xiàn)度。結(jié)果表明：共有峰為14個(gè)，其中關(guān)聯(lián)度在0.8以上的有12個(gè)峰（正相關(guān)峰為3、11、12、13號(hào)峰，負(fù)相關(guān)峰為1、2、4-10、14號(hào)峰）；11、12號(hào)峰分別為氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ。因此，羅漢果祛痰作用不是單一成分起作用，而是多種成分綜合作用的結(jié)果。其中，氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ有祛痰作用，貢獻(xiàn)率較大。

關(guān)鍵詞： 羅漢果， 祛痰作用， 譜效關(guān)系

中圖分類(lèi)號(hào)： Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）05060604

Abstract： In order to investigate the relationship between expectorant efficacy and active components of Siraitia grosvenorii， the phenol red secretion of trachea in mice and the HPLC fingerprint of S. grosvenorii extract were determined. Grey relational analysis was applied to confirm the contribution degree of each common peak from HPLC fingerprints for expectoration efficacy， while partial leastsquares regression （PLS） was utilized to confirm either positive or negative relationship， and to identify the contribution degree of S. grosvenorii extract. The results indicated that fourteen common peaks were chosen in HPLC fingerprints， including twelve peaks with relation rate higher than 0.8 （No.3， 11， 12， 13 peaks were positive correlation peaks， and No.1， 2， 4-10， 14 peaks were negative correlation peaks）， No.11 and 12 peaks were Oxomogroside V and Mogroside V respectively. Therefore， expectorant efficacy of S. grosvenorii is contributed by a combined action of multicomponents rather than one component. Oxomogroside V and Mogroside V have an expectorant efficacy and high contribution degree.

Key words： Siraitia grosvenorii， expectorant efficacy， spectrumefficacy relationship

羅漢果（ Siraitia grosvenorii） 是廣西道地中藥材，具有止咳、祛痰、通便、解痙、保肝（王勤等，1999； 張宏等，2011）、抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞（夏星等，2012； 何超文等，2012b） 等廣泛的藥理活性。而與藥理作用相關(guān)的活性成分大多指向羅漢果甜苷Ⅴ（王霆等，1999；劉婷等，2007），其他化學(xué)成分對(duì)藥理作用是否有貢獻(xiàn)，尚不明確。

2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中羅漢果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有定性鑒別及規(guī)定羅漢果皂苷Ⅴ的含量測(cè)定不得少于0.50%（國(guó)家藥典委員會(huì)，2015）?，F(xiàn)行的羅漢果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)保障羅漢果的基本質(zhì)量起了肯定的作用，但它忽略了中藥的藥效是多成分的協(xié)同作用，難以對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行較全面的評(píng)價(jià)。而中藥譜效關(guān)系是將中藥的藥效與指紋圖譜很好地結(jié)合起來(lái)評(píng)價(jià)中藥內(nèi)在質(zhì)量及其成分與其活性間關(guān)系的新方法（國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì)，1999）。本研究通過(guò)建立羅漢果指紋圖譜獲得化學(xué)數(shù)據(jù)，同時(shí)采用小鼠酚紅排泌法獲得祛痰藥效數(shù)據(jù)，運(yùn)用灰度關(guān)聯(lián)法與最小偏二乘法將化學(xué)數(shù)據(jù)與藥效數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，建立羅漢果祛痰的譜效關(guān)系模型。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑羅漢果藥材19批，均為青皮果，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥物鑒定教研室田慧教授鑒定為羅漢果（Momordica grosvenori）的果實(shí)。藥材編號(hào)及產(chǎn)地：永福龍江（S1-11，育苗方式、采摘時(shí)間、果形大小等有差異，下同）、湖南衡陽(yáng)（S12-13）、南寧壇洛（S14-15）、永福堡里（S16-17）、永福百壽（S18-19）。對(duì)照品羅漢果苷Ⅴ為本實(shí)驗(yàn)小組自制，遠(yuǎn)志購(gòu)自柳州市神農(nóng)中藥飲片廠，批號(hào)20130305。酚紅，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20130725。碳酸氫鈉，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20130409。氫氧化鈉，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2013102101。分析純甲醇、乙醇、磷酸，廣東汕頭市西隴化工廠。色譜純乙腈，美國(guó)TEDIA公司。水為重蒸蒸餾水，自制。

1.1.2 儀器1100分析型高效液相色譜儀（包括二極管列陣多波長(zhǎng)DVD檢測(cè)器、四元梯度泵、在線(xiàn)真空脫氣機(jī)、7725i手動(dòng)進(jìn)樣器、HP化學(xué)工作站），美國(guó)Agilent公司；B3500SMT超聲波清洗器，必能信超聲（上海）有限公司；雙光束紫外可見(jiàn)光光度計(jì)TU1901，北京普析通用儀器有限公司；L600臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MATLAB R2013數(shù)學(xué)軟件，美國(guó)MathWorks公司。

1.1.3 動(dòng)物昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～24 g，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)： SCXK桂2009-0002。

1.2 方法

1.2.1 羅漢果提取物制備稱(chēng)取羅漢果藥材1 000 g，先后用10倍量、8倍量、5倍量的水提取，時(shí)間分別為1.5、1、1 h，合并濾液，加熱濃縮至1 000 mL，加入1倍量的95%乙醇，混勻，封口，-4 ℃靜置48 h，抽濾，得濾液回收乙醇濃縮成浸膏備用。

1.2.2 小鼠氣管酚紅法420只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為19個(gè)羅漢果組、空白組與陽(yáng)性遠(yuǎn)志組，每組20只。Ig分別給予羅漢果提取物每公斤40 g生藥量（每公斤體重給羅漢果藥材量），純凈水與遠(yuǎn)志提取物20 g·kg1（每公斤體重給遠(yuǎn)志藥材量），給藥體積為0.2 mL·10 g1，每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d。第2天給藥后禁食不禁水10 h。末次給藥45 min后腹腔注射0.5%酚紅溶液0.5 mL，15 min后悶死，用5% NaHCO3溶液1 mL灌洗呼吸道，重復(fù)3次，合并洗出液，離心，取上清液用紫外分光光度計(jì)（波長(zhǎng)546 nm）比色。通過(guò)酚紅溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算酚紅排泌量以及祛痰率。

祛痰率=（實(shí)驗(yàn)組平均酚紅排泌量-空白組酚紅排泌量）/ 空白組酚紅排泌量

表1結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志組和19個(gè)羅漢果組對(duì)小鼠均有一定的祛痰作用。因此，對(duì)19批羅漢果提取物進(jìn)行小鼠祛痰作用的譜效關(guān)系研究。

1.2.3 羅漢果提取物的HPLC指紋圖譜

1.2.3.1 色譜條件色譜柱：ZORBAXSBC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：20 ℃；流動(dòng)相：0.05%磷酸（A）- 乙腈（B）（梯度洗脫：0～8 min，3%～13.5% B；8～35 min，13.5%～35%B；35～45 min：35% B）；檢測(cè)時(shí)間：45 min；流速：0.8 mL·min1；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；進(jìn)樣量：10 μL（盧風(fēng)來(lái)等，2010）。

1.2.3.2 對(duì)照品溶液制備稱(chēng)取羅漢果苷Ⅴ、氧化羅漢果苷Ⅴ適量，用甲醇溶解到5 mL的容量瓶中，超聲使其充分溶解，并用甲醇定容至刻度，以0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為對(duì)照品溶液。

1.2.3.3 供試品溶液制備取羅漢果浸膏2 g，精密稱(chēng)量，置25 mL容量瓶中，加入純凈水定容至刻度，溶解，搖勻，以0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

1.2.3.4 HPLC圖譜峰的歸屬精密吸取羅漢果苷Ⅴ及氧化羅漢果苷Ⅴ對(duì)照品溶液以及19批羅漢果供試藥品溶液進(jìn)樣，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。19批羅漢果共確定有14個(gè)共有峰，其中11號(hào)和12號(hào)峰分別與對(duì)照品氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ的保留時(shí)間與紫外光譜圖相同，鑒定為氧化羅漢果苷Ⅴ和羅漢果苷Ⅴ（圖1）。

2結(jié)果與分析

2.1 譜效關(guān)系的灰色關(guān)聯(lián)度和關(guān)聯(lián)順序分析

將各共有峰原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換（即首先分別求出各個(gè)序列數(shù)據(jù)的平均值，再用平均值去除以對(duì)應(yīng)序列中的各個(gè)原始數(shù)據(jù)，所得到的商為新的數(shù)據(jù)列，即均值化數(shù)列，又叫規(guī)格化數(shù)據(jù)）。根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)度分析法計(jì)算關(guān)聯(lián)度，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，各個(gè)共有峰所代表的化學(xué)成分與祛痰作用均具有一定的關(guān)聯(lián)（關(guān)聯(lián)度>0.60），表明羅漢果提取物的祛痰作用是其多個(gè)化學(xué)成分共同作用的結(jié)果。在羅漢果提取物HPLC指紋圖譜中，1-4號(hào)峰、6號(hào)峰以及8-14號(hào)峰所代表的化學(xué)成分與祛痰作用具有高度關(guān)聯(lián)（關(guān)聯(lián)度>0.80）。依據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小，確定各成分（P）對(duì)祛痰作用貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镻11>P12>P1>P14>P8>P3>P13>P9>P6>P2>P4>P10>P7>P5。其中11號(hào)峰為氧化羅漢果苷Ⅴ，12號(hào)峰為羅漢果苷Ⅴ。

2.2 譜效關(guān)系的偏最小二乘法分析

使用MATLAB R2013軟件，依據(jù)偏最小二乘分析方法，計(jì)算出上述指紋圖譜中各個(gè)共有峰的峰面積與祛痰藥效間的數(shù)理關(guān)系。表2結(jié)果表明，根據(jù)19批羅漢果提取物的圖譜數(shù)據(jù)，得出各峰（P）對(duì)祛痰作用的貢獻(xiàn)大小依次為P12>P11>P13>P3>P4>P10>P8>P7>P1>P2>P9>P14>P5>P6，其中P12、P11、P13、P3與祛痰效果呈正相關(guān)，P4、P10、P8、P7、P1、P2、P9、P14、P5、P6與祛痰效果呈負(fù)相關(guān)。

3討論與結(jié)論

本研究使用經(jīng)典的酚紅排泌法來(lái)測(cè)定不同產(chǎn)地、不同采收期、不同加工方法的羅漢果共19批次的祛痰作用，結(jié)果羅漢果的祛痰作用明顯。同時(shí)使用HPLC建立了羅漢果提取物的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)了其中14個(gè)共有特征峰，并確定了其中2個(gè)指紋峰，分別為羅漢果苷Ⅴ與氧化羅漢果苷Ⅴ。用灰色關(guān)聯(lián)度法進(jìn)行譜效關(guān)系分析，結(jié)果表明在HPLC指紋圖譜中，P11、P12、P1、P14、P8與祛痰作用的關(guān)聯(lián)度較大，其中P11為氧化羅漢果苷Ⅴ，P12為羅漢果苷Ⅴ。王霆等（1999）報(bào)道羅漢果甜苷有祛痰作用，劉婷等（2007）也報(bào)道羅漢果皂苷Ⅴ有祛痰作用。本研究使用偏最小二乘法分析譜效關(guān)系，結(jié)果表明P12、P11、P13與祛痰作用呈正相關(guān)且貢獻(xiàn)較大，P1、P14、P8則呈負(fù)相關(guān)，提示羅漢果提取物的祛痰作用可能是多種成分共同作用的結(jié)果，這與我們的預(yù)期相符。而羅漢果苷Ⅴ是羅漢果甜苷主要組成成分之一，本研究結(jié)果提示羅漢果苷Ⅴ對(duì)祛痰作用的貢獻(xiàn)率較大，與王霆等（1999）和劉婷等（2007）的研究結(jié)果相吻合。

本研究中，由于通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)和對(duì)照品等因素，除了P11和P12外，其他峰是何化學(xué)成分還無(wú)法鑒定。而將這些化合成分分離出來(lái)，采用波譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，并測(cè)定其藥理活性，將是本課題今后的研究方向之一。

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