利用ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)空間誘導(dǎo)羅漢果DNA突變

向巧彥 黃夕洋 李虹 甘金佳 梁勇詩(shī) 蔣水元

摘要： 為探究太空環(huán)境對(duì)羅漢果造成的誘變效應(yīng)，篩選羅漢果新品種培育優(yōu)異種質(zhì)，該研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)28個(gè)航天誘變羅漢果及主栽品種進(jìn)行了全基因組多態(tài)性檢測(cè)和聚類(lèi)分析。結(jié)果表明：從100個(gè)ISSR引物中篩選得到17個(gè)引物，共擴(kuò)增出157個(gè)條帶，其中83條具有多態(tài)性，多態(tài)條帶百分率為52.87%，遺傳相似系數(shù)范圍為0.707～0.987。根據(jù)UPGMA聚類(lèi)圖，28個(gè)羅漢果樣本可以分為3類(lèi)：聚類(lèi)Ⅰ為航天種質(zhì)B6和B3♀；聚類(lèi)Ⅱ?yàn)楹教旆N質(zhì)A1♀、A14、A18與主栽品種；聚類(lèi)Ⅲ中都為航天羅漢果種質(zhì)。上述結(jié)果暗示A1♀、A14、A18與其他航天種質(zhì)已經(jīng)產(chǎn)生了一定的遺傳分化，具有與主栽品種相似的遺傳背景，可能獲得了有益突變。該研究結(jié)果為羅漢果新品種培育和雜交親本選配提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 羅漢果， 空間誘變育種， ISSR， 分子標(biāo)記輔助選擇

中圖分類(lèi)號(hào)： Q949.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）05058107

Abstract： In order to investigate genetic variation of Siraitia grosvenorii after space flight， and to create elite germplasms， ISSR （intersimple sequence repeats） molecular markers were used to detect the genomewide DNA polymorphism and to make cluster analysis of 28 S. grosvenorii samples including spaceflight accessions and main cultivars. Seventeen primers which had clear polymorphic bands were selected from 100 primers. A total of 157 bands were detected， of which 83 bands were polymorphic with a polymorphic rate of 52.87%. Genetic similarity coefficient ranged from 0.707 to 0.987. UPGMA cluster analysis revealed that 28 samples formed three primary distinct clusters： Cluster I included two space mutation germplasms B6 and B3♀； Cluster Ⅱ contained space mutation germplasm A1♀， A14， A18 and all the main cultivars； The remaining space mutation germplasm belonged to cluster Ⅲ. These results were as follows： （1） Space mutation could result in genetic variation of S. grosvenorii. （2） A1♀， A14 and A18 might gain positive mutation because their genetic backgrounds were similar with the main cultivars， which could provide useful information for creating new elite germplasms in S. grosvenorii.

Key words： Siraitia grosvenorii， space mutation breeding， ISSR， molecular markerassisted selection

羅漢果（Siraitia grosvenorii ）是我國(guó)特有的葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物，以果實(shí)入藥，為我國(guó)常用大宗中藥材之一，具有止咳祛痰、潤(rùn)腸通便等功效（中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì)，2015）。羅漢果果實(shí)中的甜苷Ⅴ為世界上最強(qiáng)的非糖甜味物質(zhì)之一（李典鵬和張厚瑞，2000），在天然藥物和甜味劑開(kāi)發(fā)方面受到廣泛關(guān)注。羅漢果分布于一個(gè)相對(duì)狹小的區(qū)域，資源匱乏已成為不爭(zhēng)的事實(shí)。羅漢果藥用和甜苷提取需求量的增加，推動(dòng)了羅漢果種植業(yè)的空前發(fā)展，原產(chǎn)地被大量開(kāi)墾發(fā)展羅漢果種植，導(dǎo)致野生資源儲(chǔ)備銳減；而人工栽培組培苗的推廣，使栽培方式由多年生變?yōu)橐荒晟岣弋a(chǎn)量的同時(shí)，卻導(dǎo)致栽培品種單一，品種退化嚴(yán)重。羅漢果在種植方面最突出的是品種問(wèn)題，農(nóng)學(xué)和生物學(xué)工作者在羅漢果的高產(chǎn)栽培技術(shù)（陳繼富等，2012）、組織培養(yǎng)（付長(zhǎng)亮等，2005）、多倍體育種（蔣水元等，2009）、新品種選育（馬小軍等，2008）、遺傳轉(zhuǎn)化研究（朱英芝，2012；邢愛(ài)佳等，2013；曾雯雯，2015）等方面已開(kāi)展大量工作，并且選育出一系列優(yōu)良高產(chǎn)的新品種。到目前為止，利用雜交育種、誘變育種與優(yōu)良品種選育等常規(guī)方法還沒(méi)有取得突破性進(jìn)展（閆海鋒等，2011）。當(dāng)前所采用的栽培品種依然為20世紀(jì)70年代形成的青皮果、紅毛果等農(nóng)家品種。

航天育種具有誘變效率高、育種周期短、變異方向不定、可出現(xiàn)常規(guī)育種不易出現(xiàn)的變異等特點(diǎn)，近年來(lái)已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，并取得了令人矚目的研究成果（劉錄祥等，2007；梁劍平，2010）。運(yùn)用航天育種，可以提高羅漢果變異率，擴(kuò)大種質(zhì)資源庫(kù)，創(chuàng)造更多供選擇的優(yōu)異種質(zhì)。2011年，一批羅漢果種子搭載“神舟八號(hào)”進(jìn)行太空育種；2012年，這批種子在廣西桂林永?？h進(jìn)行試種。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性（Zietkiewicz et al，1994）。本研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，首次在DNA層面，對(duì)航天羅漢果種質(zhì)進(jìn)行遺傳變異檢測(cè)，探究太空環(huán)境對(duì)羅漢果造成的誘變效應(yīng)，為羅漢果新品種的培育提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1 材料

2014年春，將航天羅漢果種質(zhì)與主栽品種種植于廣西植物研究所本課題組試驗(yàn)地，當(dāng)年秋天采集葉片，共計(jì)28個(gè)樣本（表1），硅膠干燥保存。航天羅漢果標(biāo)號(hào)以A和B開(kāi)頭。主栽品種都為青皮果，航天種質(zhì)品種為冬瓜果。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取采用改良CTAB法（Doyle JJ & Doyle JL，1987），提取干燥葉片總DNA。提取步驟：稱(chēng)取干燥葉片0.1 g，放入研缽中，加適量液氮，快速研磨成粉；在研缽中加入2 mL 預(yù)熱65 ℃ 2% CTAB（含2% β-巰基乙醇），研磨混合均勻；將溶液從研缽轉(zhuǎn)入2 mL 離心管中，65 ℃ 水浴1 h，期間每隔15 min上下顛倒混勻一次；12 000 r·min1離心10 min，上清液倒入新離心管；加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），上下顛倒混勻7 min。12 000 r·min1離心10 min，上清吸入新離心管；重復(fù)氯仿抽提一次； 加入1/10體積NaAc （pH 5.2）， 等體積異丙醇 （-20 ℃預(yù)冷），混勻，-20 ℃冰箱中靜置20 min；5 000 r·min1，5 min，倒上清液；加入1 mL 70%乙醇洗滌一次；5 000 r·min1，5 min，倒上清液，1 mL 無(wú)水乙醇洗滌2次；自然風(fēng)干，加50 μL 1 × TE溶解；-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 DNA檢測(cè)運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA完整性，用NanoDropTM/ND2000C檢測(cè)DNA濃度和純度。

1.2.3 ISSR引物及退火溫度篩選隨機(jī)選取8個(gè)樣本，對(duì)100個(gè)引物進(jìn)行篩選。PCR試劑為T(mén)aKaRa Ex Taq DNA Polymerase （Mg2+ free buffer）。25 μL PCR反應(yīng)體系中含DNA模板50 ng，其余成分終濃度：1×buffer（不含Mg2+），MgCl2 2.0 mmol·L1，4種dNTPs 各0.2 mmol·L1，引物0.5 μmmol·L1，Tag酶1 U。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min（周俊亞等，2004）。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)顯影、拍照。選擇條帶多、清晰、亮度強(qiáng)的引物進(jìn)行引物退火溫度篩選。設(shè)置50～55 ℃溫度梯度，篩選退火溫度，用于28個(gè)樣本的ISSR分析。

1.2.4 ISSR數(shù)據(jù)分析ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫(kù)。在相同的遷移位置上，有帶存在賦值為“1”，無(wú)此帶賦值為“0”，用GenAlEx 6.5軟件（Peakall

& Smouse，2006；PE，2012）計(jì)算Neis （Nei & Li，1979）遺傳相似系數(shù)，采用NTSYSpc Version 2.10 e 軟件構(gòu)建UPGMA聚類(lèi)圖。

2結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測(cè)

從圖1可以看出，DNA條帶亮度高、集中、清晰、無(wú)降解。DNA的濃度值在1 765.3～5 186.4 ng·μL1之間，λ260/280 在2.05～2.16之間，λ260/230在1.80～2.21之間。純DNA 的λ260/280 比值約為1.8，該比值受測(cè)量時(shí)空白樣品和DNA樣品所用溶劑的pH和例子強(qiáng)度影響：酸性溶劑的比值會(huì)低0.2～0.3，而堿性溶液比值會(huì)高0.2～0.3。如果偏差太大，則是蛋白、酚或其他污染在280 nm區(qū)域附近具有吸收峰；純DNA的λ260/230 比值為1.8～2.2。比值太低說(shuō)明DNA提取技術(shù)需要優(yōu)化（Desjardins & Conklin，2010）。本研究中，溶解DNA所用試劑TE（pH8.0）為堿性，λ260/280值在正常范圍。因此，本研究所獲得的羅漢果DNA濃度高、質(zhì)量好，可以滿(mǎn)足ISSR分析的需要。

2.2 ISSR引物篩選及引物退火溫度篩選

從100個(gè)ISSR引物中篩選出17個(gè)引物，篩選的退火溫度見(jiàn)表2和圖2。

2.3 遺傳多樣性分析

17條引物在28個(gè)樣本中共擴(kuò)增得到157條條帶，其中83條具有多態(tài)性，多態(tài)條帶百分率為52.87%；各引物擴(kuò)增的條帶數(shù)最多為13條（U881），最少為6條（U808），平均為9.2條；各引物擴(kuò)增的多態(tài)條帶最多為9條（U857），最少為3條（U808，U834，U835，U845，U889），平均為4.9條（表2）。

Neis遺傳相似系數(shù)范圍0.987～0.707，最大的為A1♀和BL2（0.987），最小的為B6和LG2。根據(jù)UPGMA聚類(lèi)圖，28個(gè)羅漢果樣本可以分為3類(lèi)，聚類(lèi)Ⅰ為航天種質(zhì)B6和B3♀；聚類(lèi)Ⅱ?yàn)楹教旆N質(zhì)A1♀，A14，A18與主栽品種；聚類(lèi)Ⅲ中都為航天羅漢果種質(zhì)（圖3）。

3討論與結(jié)論

我國(guó)通過(guò)航天育種已培育出一批具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病新品種（系），但相應(yīng)的基礎(chǔ)理論研究較薄弱，需要加強(qiáng)航天誘變的分子基礎(chǔ)研究，解析誘變的分子機(jī)制，提高誘變的預(yù)見(jiàn)性和誘變后代選擇效率。本研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，從DNA層面，對(duì)航天羅漢果的變異進(jìn)行解析。從100個(gè)ISSR引物中篩選得到17個(gè)引物，對(duì)28個(gè)羅漢果樣本進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出157個(gè)條帶，其中83條具有多態(tài)性，多態(tài)條帶百分率為52.87%；各引物擴(kuò)增的條帶數(shù)最多為13條（U881），最少為6條（U808），平均為9.2條；各引物擴(kuò)增的多態(tài)條帶最多為9條（U857），最少為

3條（U808，U834，U835，U845，U889），平均為4.9條；Neis遺傳相似系數(shù)范圍0.987～0.707，最大的為A1♀和BL2（0.987），最小的為B6和LG2；根據(jù)UPGMA聚類(lèi)圖，28個(gè)羅漢果樣本可以分為3類(lèi)，聚類(lèi)Ⅰ為航天種質(zhì)B6和B3♀；聚類(lèi)Ⅱ?yàn)楹教旆N質(zhì)A1♀，A14，A18與主栽品種；聚類(lèi)Ⅲ中都為航天羅漢果種質(zhì)。

航天誘變育種產(chǎn)生的變異率一般為5%～10%，往往從這些突變體中可以篩選到2%～3%的有益突變體材料（潘光輝等，2005）。本研究中，航天種質(zhì)品種為冬瓜果，主栽品種屬于青皮果，運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，可以從DNA層面區(qū)分這兩個(gè)品種，與周俊亞等（2005）的研究結(jié)果一致。青皮果是目前栽培面積最大的羅漢果品種（周俊亞和唐紹清，2006），具有甜苷含量高，大、中果占比高、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)（孫宗喜等，2006；白隆華等，2007）。本研究中，根據(jù)Neis遺傳相似系數(shù)構(gòu)建的UPMG聚類(lèi)圖表明，所有主栽品種聚為一類(lèi)，與其品種分類(lèi)一致，大多數(shù)航天羅漢果聚為一類(lèi)，也與其品種來(lái)源一致；航天羅漢果A1♀，A14，A18與主栽品種聚為一類(lèi)，暗示這3個(gè)種質(zhì)與其他航天種質(zhì)已產(chǎn)生了一定的遺傳分化，而具有與主栽品種更為相似的遺傳背景，可能獲得了有益突變。本研究結(jié)果可以指導(dǎo)航天育種后代的篩選，重點(diǎn)關(guān)注A1♀，A14，A18，結(jié)合農(nóng)藝性狀和化學(xué)成分方面的研究，從中篩選出優(yōu)良品系。

在雜交育種中，親本選擇的原則之一是親緣關(guān)系上存在一定差異，親本間差異越大，后代的雜交優(yōu)勢(shì)可能越明顯。根據(jù)Nei遺傳相似系數(shù)，可以獲得兩兩品種間的最大及最小相似度，指導(dǎo)后續(xù)的雜交育種工作，充分利用航天種質(zhì)，為羅漢果的遺傳改良引入新的優(yōu)良種質(zhì)。

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