鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

秦緒偉　吳昊　王蕾　刁有祥

摘要：2017年3月，山東濰坊某養(yǎng)殖場養(yǎng)殖肉鴨15000X，發(fā)生急性死亡、神經(jīng)癥狀、厭食為主要特征的疾病，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室解剖化驗(yàn)、細(xì)菌的分離鑒定、分子生物學(xué)的鑒定，最終確診為鴨里默氏桿菌病，經(jīng)藥敏試驗(yàn)，選擇敏感性高的藥物治療，最終控制了病情。

關(guān)鍵詞：鴨里默氏桿菌病；鑒定；毒力；藥敏

中圖分類號：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號：2096-3637（2017）05-0002-03

鴨里氏桿菌病又稱為鴨傳染性漿膜炎，是由鴨疫里默氏桿菌引起的幼鴨的一種急性傳染病，主要侵害1～8周齡的小鴨，是造成幼鴨死亡的主要傳染病之一。鴨疫里默氏桿菌，菌體呈現(xiàn)桿狀或者橢圓，菌體大小為0.3～0.5×0.7～6.5um，也有的呈現(xiàn)長絲狀，可以達(dá)到11～24um。細(xì)菌少數(shù)呈現(xiàn)短鏈排列或者成雙排列，多數(shù)呈現(xiàn)單個(gè)存在，可形成莢膜，無鞭毛，革蘭氏染色呈現(xiàn)陰性，瑞氏染色可見細(xì)菌呈現(xiàn)兩極濃染。鴨疫里默氏桿菌的生長營養(yǎng)要求比較高，普通的瓊脂平板、麥康凱平板、SS瓊脂平板不生長，細(xì)菌分離時(shí)需要在5%二氧化碳環(huán)境中分離，37℃培養(yǎng)24h以上。

鴨疫里氏桿菌發(fā)病主要是發(fā)生在2～3周齡的小鴨，一年四季都有發(fā)生，各種應(yīng)激都會(huì)促進(jìn)疾病的發(fā)生，飼養(yǎng)密度大、環(huán)境衛(wèi)生差、飼養(yǎng)管理不善、維生素缺乏等原因都會(huì)造成疾病的發(fā)生，剖檢明顯癥狀以纖維素性心包炎、肝周炎，嚴(yán)重的引起氣囊炎以及有的發(fā)病鴨可以出現(xiàn)干酪性輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎，死亡率高，耐過的鴨生長遲緩、飼料報(bào)酬低，該病成為養(yǎng)殖場養(yǎng)鴨業(yè)影響比較大疫病。

2017年3月，山東濰坊某肉鴨養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖15日齡的肉鴨15000只，開始有少量死亡，每天死亡10只左右，未引起重視，以為環(huán)境變化、天氣原因引起的發(fā)病，發(fā)病都為急性死亡，3d后死亡率開始增加，每天死亡50多只、100多只，嚴(yán)重的死亡每天300只，發(fā)病表現(xiàn)有的精神萎靡、神經(jīng)癥狀、厭食、嗜睡、縮頸，部分發(fā)病的鴨子表現(xiàn)眼睛漿液性或者粘液性的分泌物，眼睛周圍羽毛脫落，鼻孔有粘液或者漿液性的分泌物，糞便稀薄，兩腿伸直或者尾部搖擺，不久后抽搐死亡。解剖可見急性病例心包液嚴(yán)重增多，心包外膜可見纖維素的滲出物，嚴(yán)重的整個(gè)心包都是纖維素包裹，纖維素滲出物呈現(xiàn)干酪樣。肝臟表面包裹一層灰白色黃色的纖維素膜，容易剝離，肝臟嚴(yán)重的腫大，質(zhì)地較脆易碎。氣囊全部渾濁，有纖維素膜。脾臟有的腫大，嚴(yán)重的有纖維素膜包裹，質(zhì)地易碎。養(yǎng)殖場發(fā)病后開始死亡較少未引起重視，后來發(fā)病增多，來實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)，最終經(jīng)細(xì)菌的分離鑒定、確診為鴨疫里默氏桿菌引起的鴨漿膜炎病，經(jīng)藥敏試驗(yàn)選擇敏感的藥物，最終治療效果良好。后期還進(jìn)行的鴨疫里默氏桿菌的生化試驗(yàn)、PCR鑒定，細(xì)菌血清型的鑒定、細(xì)菌的毒力試驗(yàn)，了解鴨疫里默氏桿菌的基本特性。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)菌株

山東某肉鴨養(yǎng)殖場，發(fā)生死亡的病例，臨床上急性發(fā)病，解剖可見嚴(yán)重的心包炎、肝周炎，疑似鴨疫里氏桿菌病，留取病料，細(xì)菌分離，作為實(shí)驗(yàn)菌株。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物

14日齡櫻桃谷鴨，購自德州臨邑某養(yǎng)殖場。

1.3器材

生物安全柜，購白蘇凈安泰；全自動(dòng)樣品快速研磨儀，購自上海凈信科技；基因擴(kuò)增儀，購自杭州博日科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，購自三洋；顯微鏡，購自奧林巴斯。

營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂，馬丁肉湯粉，購自青島海博試劑公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)小管，購自北京路橋試劑公司；微量藥敏片，購自杭州天和生物試劑有限司；犢牛血清，購自內(nèi)蒙古金源康試劑公司；革蘭氏染色液、瑞氏染色液，按照規(guī)程在實(shí)驗(yàn)室自行配制；1型、2型、7型鴨疫里默氏桿菌陽性定型鑒定血清，齊魯動(dòng)保研究所制備，已與標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證；解剖臺(tái)、解剖刀、剪刀、酒精燈、接種環(huán)、試管、高壓鍋、超聲波清洗機(jī)，實(shí)驗(yàn)室常備物品。

1.4細(xì)菌分離與鑒定

養(yǎng)殖場鴨子發(fā)生神經(jīng)癥狀、急性死亡的病例，解剖可見嚴(yán)重的包心包肝，無菌條件下進(jìn)行肝臟的細(xì)菌分離，接種環(huán)挑取肝臟組織分別接種10%血清營養(yǎng)瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板、ss瓊脂平板，放置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h-48h，觀察有無細(xì)菌生長，若有細(xì)菌生長則記錄細(xì)菌菌落的生長情況，進(jìn)行細(xì)菌的革蘭氏染色、瑞氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5生化試驗(yàn)

將分離的疑似鴨疫里默氏桿菌從血清營養(yǎng)瓊脂平板挑取單個(gè)菌落，接種10%血清馬丁肉湯培養(yǎng)基，接種后37℃溫箱振蕩培養(yǎng)24h，取樣接種微量生化反應(yīng)小管，接種后24h～48h觀察記錄結(jié)果。糖發(fā)酵試驗(yàn)是將菌液接種糖發(fā)酵小管，每只管0.2ml，觀察7d；硫化氫試驗(yàn)是將細(xì)菌穿刺接種醋酸鉛培養(yǎng)基，觀察培養(yǎng)基是否變黑；過氧化氫酶試驗(yàn)，是用接種環(huán)取固體培養(yǎng)基上的菌落，置于潔凈的試管內(nèi)，滴加2m13%過氧化氫，觀察是否有氣泡產(chǎn)生；甲基紅試驗(yàn)是將細(xì)菌接種到蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)24h，觀察顏色的變化。

1.6血清型鑒定

方法是使用平板凝集試驗(yàn)，接種環(huán)挑取血清平板的單個(gè)菌落，與一滴血清1型、2型、7型陽性定型血清在玻璃平板上混合，混合后1min觀察有無凝集現(xiàn)象，如果與血清1型血清凝集則判定為1型鴨疫里默氏桿菌，如果與血清2型血清凝集則判定為2型鴨疫里默氏桿菌，血清7型血清凝集則判定為7型鴨疫里默氏桿菌。

1.7藥敏試驗(yàn)

挑取血清瓊脂平板上的菌落，使用接種環(huán)挑取菌落在另外一個(gè)血清平板上均勻涂布，將有各種藥物的藥敏片貼于瓊脂上，置37%溫箱放置24h～48h，觀察抑菌圈的大小，確定藥物的敏感性。

1.8PCR病毒檢測

將發(fā)病鴨的肺臟、脾臟、肝臟適量研磨，凍融后進(jìn)行基因擴(kuò)增PCR檢測，檢測流感、腺病毒、黃病毒、鴨肝炎病毒。

1.9細(xì)菌16SrRNA

將血清平板分離的單個(gè)細(xì)菌接種加血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基，溫箱37℃震蕩培養(yǎng)36h，取1ml，加熱煮沸7min，冰浴5min，離心取上清作為基因擴(kuò)增的模板，設(shè)計(jì)引物：F1-5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3.R1-5ACGGCTACCTTG TTG TTA CGA CTT-3，PCR反應(yīng)體系（50u1）：10*PCRBuffer（含MgC1215mmol/L，KC1500mmol/L）5ul，2.5mmol/LdNTP 4ul，引物（20umol/10各1ul，模板2ul，ddH2036.8ul，Taq酶（5U/u1）0.25ul。PCR反應(yīng)條件：94℃5rain；94℃lmin，56℃30s，72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，測序公司檢測，根據(jù)測序結(jié)果Genbank比對，確定細(xì)菌為何種細(xì)菌。

1.10毒力試驗(yàn)

將分離的1型鴨疫里默氏桿菌接種含有10%血清的營養(yǎng)瓊脂平板，放置37℃溫箱培養(yǎng)48h后，接種加血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基，37～C溫箱搖床培養(yǎng)36h，取菌液將菌液稀釋成1X108CFU/ml，5X107CFU/ml，2X107CFU/ml，1X107CFU/ml，進(jìn)行肌肉注射14日齡的幼鴨5只，1ml/只，攻毒后觀察7d，記錄發(fā)病死亡情況，同時(shí)飼養(yǎng)5只同日齡幼鴨作為對照，若發(fā)現(xiàn)有扭頸、角弓反張的神經(jīng)癥狀則判定發(fā)病。

2結(jié)果

2.1細(xì)菌分離和培養(yǎng)特性結(jié)果

發(fā)生鴨子急性死亡病例，肝臟涂片革蘭氏染色鏡檢，可見陰性小桿菌。肝臟病料無菌接種血清營養(yǎng)瓊脂平板，在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)約36h可見細(xì)小的菌落生長，透明露珠樣菌落，平板上菌落圓形、凸起，瑞氏染色可見兩極濃染，革蘭氏染色呈現(xiàn)陰性菌落，普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱、ss瓊脂平板不生長。

2.2生化試驗(yàn)結(jié)果

血清平板挑取單個(gè)細(xì)菌，接種加血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基，取適量接種微量生化反應(yīng)小管，接種后24h～48h觀察結(jié)果，不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖，硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、尿素分解陰性，氧化酶、觸酶試驗(yàn)陽性。（具體結(jié)果見表1）

2.3血清型鑒定結(jié)果

分離的細(xì)菌與血清1型的定型血清凝集，與血清2型、血清7型的定型血清不凝集，確定分離的細(xì)菌為1型鴨疫里默氏桿菌。

2.4細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將鴨疫里默氏桿菌的均勻涂布于含10%血清的營養(yǎng)瓊脂平板，將含有相應(yīng)藥物的藥敏片貼于瓊脂上，37"C溫箱培養(yǎng)36h，可見明顯的抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小判定分離細(xì)菌對藥物的敏感程度，頭孢噻肟鈉、頭孢噻呋鈉、磷霉素、阿莫西林、青霉素高敏，氧氟沙星、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素中敏，林可霉素、壯觀霉素低敏，紅霉素、慶大霉素、鏈霉素不敏感。（具體藥敏結(jié)果見表2）

2.5PCR病毒檢測結(jié)果

病料研磨處理后，PCR檢測最終流感、腺病毒、黃病毒、鴨肝炎病毒全部為陰性，發(fā)病鴨子沒有感染這4種病毒。

2.6細(xì)菌16SrRNA檢測結(jié)果

分離的細(xì)菌處理后，PcR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，最后進(jìn)行結(jié)果確定為鴨疫里默氏桿菌。

2.7毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離的1型鴨疫里默氏桿菌，分別按照1X108CFU/ml，5X107CFU/ml，2X107CFU/ml，1X107CFU/ml稀釋劑量進(jìn)行攻毒，腹腔注射1ml，每組5只，攻毒后觀察7d，其中IX108CFU/ml攻毒劑量組開始精神沉郁、食欲減退，第3d、第4d全部死亡，死亡前鴨子扭頸、角弓反張、癱瘓等神經(jīng)癥狀，解剖可見心臟、肝臟輕度的纖維素滲出；5X107CFU/ml攻毒劑量組開始精神沉郁、食欲減退，慢慢開始發(fā)病，第4d、第5d全部死亡，死亡的鴨子有鴨子扭頸、角弓反張、癱瘓等神經(jīng)癥狀，解剖可見心臟、肝臟的纖維素滲出；2X107CFU/ml攻毒劑量組開始精神沉郁、食欲減退，慢慢開始發(fā)病，第4d、第5d死亡2只，死亡的鴨子有鴨子扭頸、角弓反張、癱瘓等神經(jīng)癥狀，解剖可見心臟、肝臟的嚴(yán)重纖維素滲出，另外3只有適當(dāng)?shù)木癯劣?、食欲減退，觀察7d見活；1X107CFU/ml攻毒劑量組，，有1只第4d開始精神沉郁、食欲減退，第2d恢復(fù)，其他4只觀察7d精神、食欲未見明顯的變化，分離的鴨疫里默氏桿菌對櫻桃谷肉鴨的最小致死量為5X107CFU，最小發(fā)病劑量是2X107CFU，1X107CFU劑量不能引起14日齡的櫻桃谷鴨發(fā)病。對照組5只觀察7d，未見精神食欲有任何變化。（具體藥敏結(jié)果見表3）

3小結(jié)與討論

3.1鴨疫里默氏桿菌屬于環(huán)境致病菌

是鴨養(yǎng)殖過程中的一種常見的疾病，一般的發(fā)病群體是幼鴨，一年四季都可以發(fā)生，發(fā)病的誘因是各種應(yīng)激因素，飼養(yǎng)密度過大、環(huán)境通風(fēng)不良、墊草潮濕、飼料品質(zhì)不良、環(huán)境溫度忽高忽低、維生素缺乏等等因素都會(huì)造成疾病的發(fā)生，另外一些疾病大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、鴨病毒性肝炎等疾病也會(huì)與鴨疫里默氏桿菌的一起發(fā)生，形成繼發(fā)感染。鴨疫里默氏桿菌傳染源主要是污染的飼料、墊草等，可以通過呼吸道、消化道傳播，養(yǎng)殖場發(fā)病一般有明顯的疫點(diǎn)，從一個(gè)點(diǎn)爆發(fā)，向周邊發(fā)生蔓延。

3.2鴨疫里默氏桿菌的發(fā)病臨床主要癥狀

是神經(jīng)癥狀、角弓反張、癱瘓，解剖癥狀主要是心包炎和肝周炎，在疾病診斷時(shí)需要鑒別診斷。其中引起臨床神經(jīng)癥狀的疾病有流感、巴氏桿菌、鴨肝炎、維生素B1缺乏等，引起心包炎肝周炎的疾病有大腸桿菌、沙門氏菌等，僅僅依靠臨床的觀察和解剖很難確診，需要仔細(xì)的結(jié)合臨床癥狀、發(fā)病情況區(qū)別診斷，必要時(shí)需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌分離和病毒檢測才能確診。一旦發(fā)生疾病，結(jié)合神經(jīng)癥狀和心包炎肝周炎可以初步診斷為鴨疫里默氏桿菌病，進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增病毒的檢測流感和鴨肝炎檢測可以區(qū)別，細(xì)菌性的大腸桿菌和沙門氏菌卻別需要進(jìn)行細(xì)菌的分離，通過細(xì)菌分離鑒定可以區(qū)別這幾種細(xì)菌。

3.3養(yǎng)殖場一旦發(fā)生疾病

一般開始時(shí)癥狀不明顯，容易別忽略，一旦發(fā)生起來，死亡率較高，若不能確診是何種疾病，盲目地投藥更會(huì)加重病情。因此一旦發(fā)生疾病，需要及時(shí)診斷，必要時(shí)需要實(shí)驗(yàn)室的化驗(yàn)，確診疾病，針對性的治療，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感性高的藥物，及時(shí)準(zhǔn)確地治療疾病，這樣才能控制疾病。對于發(fā)病較多的疫區(qū)，可以選擇使用疫苗進(jìn)行防疫，鴨疫里默氏桿菌有21個(gè)血清型，但是國內(nèi)報(bào)道的主要發(fā)病血清型是1型、2型和7型，在發(fā)病較多的養(yǎng)殖場可以適當(dāng)?shù)倪x擇，有必要可以將發(fā)病的鴨子送有資質(zhì)的單位檢測，是否是國內(nèi)常見的發(fā)病血清型。

3.4該病的預(yù)防關(guān)鍵

是減少應(yīng)激，不要促進(jìn)疾病的發(fā)生，可以選擇使用藥物預(yù)防，疫苗也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，不同的養(yǎng)殖場可以根據(jù)自己的實(shí)際情況，綜合管理，飼料品質(zhì)優(yōu)良，適當(dāng)添加各種維生素，減少疾病的發(fā)生，減少損失。