江蘇省漁源性嗜水氣單胞菌耐藥性分析

劉訓(xùn)猛 方蘋 陳靜 袁銳 吳亞鋒 習(xí)丙文

摘要[目的]對江蘇省漁源性嗜水氣單胞菌進行耐藥性分析。[方法] 2014—2015年，對江蘇地區(qū)漁源性嗜水氣單胞菌進行流行病學(xué)調(diào)查，用API20E試劑條檢測嗜水氣單胞菌，采用紙片擴散法進行耐藥性分析。[結(jié)果]共檢測到嗜水氣單胞菌陽性菌株92份，陽性率為17.79%。對92株嗜水氣單胞菌的藥敏試驗結(jié)果表明，在耐藥率方面，利福平、新霉素的耐藥率>36%，羅紅霉素的耐藥率>23%，諾氟沙星、慶大霉素、恩諾沙星的耐藥率>10%，卡那霉素、氧氟沙星、紅霉素的耐藥率<9%。在高敏性方面，氧氟沙星>90%，卡那霉素、鏈霉素>80%，諾氟沙星、利福平、慶大霉素、恩諾沙星>70%，紅霉素<30%，新霉素<10%。[結(jié)論]在江蘇地區(qū)嗜水氣單胞菌的藥物防控中，首選藥物為氧氟沙星、卡那霉素和鏈霉素，應(yīng)盡量避免使用利福平、新霉素和羅紅霉素。

關(guān)鍵詞嗜水氣單胞菌；抗生素；耐藥性

中圖分類號S941文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）08-0110-05

Analysis on Drug Resistance of Fisherysource Aeromonas hydrophila in Jiangsu Province

LIU Xunmeng1，F(xiàn)ANG Ping1，CHEN Jing1，XI Bingwen2* et al

（1.Jiangsu Center for Control and Prevention of Aquatic Animal Infectious Disease in Jiangsu Province，Nanjing，Jiangsu 210036；2.Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuxi，Jiangsu 214081）

Abstract[Objective] To analyze the drug resistance of fisherysource Aeromonas hydrophila in Jiangsu Province. [Method] The epidemiological investigation was made on fisherysource A. hydrophila in Jiangsu Province during 2014-2015. A. hydrophila was detected by using API20E reagent strip. And their drug resistance was detected by using disc diffusion method. [Result] 92 positive strains of A. hydrophila were detected，the positive rate was 17.79%. The results of drug sensitivity test of 92 strains of A. hydrophila showed that the drug resistant rate of rifampin and neomycin were over 36%. The drug resistant rate of roxithromycin was more than 23%. The drug resistance rate of norfloxacin， gentamycin， enrofloxacin were lower than 10%. The drug resistant rate of kanamycin， ofloxacin， erythromycin were lower than 9%. From the hypersensibility，the hypersensibility of ofloxacin was more than 90%，the hypersensibility of kanamycin and streptomycin were more than 80%，the hypersensibility of norfloxacin， rifampicin， gentamycin and enrofloxacin were more than 70%，the hypersensibility of erythromycin was lower than 30%，and the hypersensibility of neomycin was lower than 10%. [Conclusion] In drug prevention and control of A. hydrophila in Jiangsu Province，the preferred drugs were ofloxacin， kanamycin and streptomycin. Rifampin， neomycin and roxithromycin should be avoided to use.

Key wordsAermomnas hydrophila；Antibiotics；Drug resistance

嗜水氣單胞菌（Aermomnas hydrophila）為革蘭氏陰性桿菌，在世界各地自然環(huán)境中分布較為廣泛[1-3]。嗜水氣單胞菌在被分離發(fā)現(xiàn)的初期，因其非主要致病菌而被忽略。近幾十年，嗜水氣單胞菌引起人、畜、魚致病的案例屢見報道，因而受到人類醫(yī)學(xué)、畜牧醫(yī)學(xué)和水產(chǎn)醫(yī)學(xué)界的重視。在人類醫(yī)學(xué)臨床上，嗜水氣單胞菌可以導(dǎo)致肝膽疾病及惡性腫瘤等免疫功能低者感染發(fā)病，且病死率很高[4-5]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，嗜水氣單胞菌可引起多種水生動物的傳染病。國內(nèi)外已有學(xué)者做了相關(guān)研究報道，從發(fā)病的鳊魚體[6]、急性發(fā)病的斑點叉尾鮰[7]、發(fā)病的羅非魚[8]、發(fā)病的歐鰻[9]、發(fā)病的黃鱔[10]等體內(nèi)分離的病原均被鑒定為嗜水氣單胞菌。其他國內(nèi)主要魚類養(yǎng)殖品種，包括兩棲類的牛蛙[11]、觀賞類的金錢魚[12]、甲殼類的小龍蝦[13]等亦均有報道。筆者以2014—2015年江蘇地區(qū)養(yǎng)殖漁源性嗜水氣單胞菌的流行病學(xué)調(diào)查為基礎(chǔ)，進行分離菌株的藥敏試驗，分析分離菌株的耐藥性和高敏藥物，以期為江蘇漁源性嗜水氣單胞菌的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、堿性胨水培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、藥敏紙片，均購自杭州天和生物試劑公司；API20E細菌生化鑒定試劑條由法國梅里埃公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1采樣。

2014—2015年從江蘇省12個縣（市、區(qū)）每個縣（市、區(qū)）各選取2個重點養(yǎng)殖廠或養(yǎng)殖戶（養(yǎng)殖廠、養(yǎng)殖戶的選擇以典型品種、養(yǎng)殖面積及品種差異化等原則為主）。每年的3—10月中旬在樣品點進行活體采樣，未發(fā)病的樣品點每個樣品采樣5～10尾，發(fā)病樣品每個樣品采樣3～5尾，在發(fā)病期將每30 d 1次的采樣頻次增加到每10～15 d采樣1次。共采集樣品517份，調(diào)查的主要養(yǎng)殖品種有異育銀鯽（103份）、草魚（77份）、鳙魚（36份）、鰱魚（31份）、鯉魚（8份）、鳊魚（39份）、鱸魚（12份）、斑點叉尾鮰（15份）、河蟹（83份）、小龍蝦（37份）、青蝦（26份）、南美白對蝦（24份）和羅氏沼蝦（26份）。調(diào)查的主要采樣地點有金壇（40份）、江寧（40份）、通州（39份）、泗洪（35份）、句容（34份）、寶應(yīng)（43份）、江都（47份）、姜堰（35份）、興化（49份）、常熟（54份）、大豐（52份）和新沂（49份）。

1.2.2病原分離與鑒定。

將采樣樣品用75%乙醇體表消毒后進行解剖，無菌采集肝、脾、腎（約0.1 g）及血液和腹腔積液0.1 mL，置于堿性胨水培養(yǎng)液，30 ℃恒溫下24 h培養(yǎng)后，各取1接種環(huán)培養(yǎng)液置于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，劃線，30 ℃恒溫下24 h培養(yǎng)，挑選表面光滑微凸、無色或淡黃色菌落進行純化。將純化的菌株轉(zhuǎn)接至普通營養(yǎng)瓊脂斜面，4 ℃下保存?zhèn)溆?。然后，用API20試劑條進行細菌鑒定。

1.2.3藥敏試驗。

采用Kirby-Bauer紙片擴散法，對分離并鑒定的嗜水氣單胞菌開展10種漁業(yè)常用抗菌類藥物的敏感性測定，藥敏試驗具體操作按照抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI/NCCLS-M100-S22 ）[14]方法操作。

從普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑取已純化的菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中30 ℃過夜培養(yǎng)后，用生理鹽水將其濃度校正至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。然后，用無菌棉蘸取菌液，將管內(nèi)壁多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后，在瓊脂表面均勻涂布接種3次，最后沿平板內(nèi)緣涂抹。將平板在37 ℃下放置5～10 min后，用鑷子將藥敏紙片緊貼于瓊脂表面上，各紙片的距離不小于24 mm，每個平板貼3片，培養(yǎng)24 h后記錄藥敏圈直徑。1.2.4溶血試驗。

將92株嗜水氣單胞菌，用普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行復(fù)蘇培養(yǎng)，劃線于血瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察各陽性菌株對血瓊脂培養(yǎng)基的溶血狀況。

2結(jié)果與分析

2.1病原分離和鑒定

采用API20E細菌生化鑒定試劑條對采集樣品進行鑒定，共分離并純化嗜水氣單胞菌目標(biāo)菌株92份。檢測結(jié)果表明，陽性樣品92份，陽性率為17.79%。從采樣地分布來看，92株陽性菌株分別來源于金壇（4份）、江寧（6份）、通州（6份）、泗洪（4份）、句容（5份）、寶應(yīng)（7份）、江都（7份）、姜堰（9份）、興化（14份）、常熟（6份）、大豐（16份）和新沂（8份）。從圖1可以看出，各采樣地區(qū)分離菌株的陽性率為10.00%～30.77%，其中姜堰、興化和大豐地區(qū)分離菌株的陽性率較高，均大于25.00%。

從采樣品種來看，92株陽性菌株分別來源于異育銀鯽（35份）、草魚（17份）、鳙魚（1份）、鰱魚（6份）、鯉魚（1份）、鳊魚（2份）、鱸魚（2份）、斑點叉尾鮰（4份）、河蟹（12份）、小龍蝦（3份）、青蝦（4份）、南美白對蝦（2份）和羅氏沼蝦（3份）。從圖2可以看出，各采樣品種分菌菌株的陽性率

2.3藥敏試驗

試驗選用10種藥敏紙片，測定分離菌株對其藥物敏感性和耐藥性。由表2可知，92株嗜水氣單胞菌對氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類都有耐藥株。在耐藥性方面，諾氟沙星、卡那霉素、利福平、羅紅霉素、慶大霉素、氧氟沙星、鏈霉素、紅霉素、恩諾沙星、新霉素的耐藥率分別為

13.04%、8.69%、45.65%、23.91%、10.87%、6.52%、10.87%、5.43%、11.96%和36.96%，其中利福平和新霉素的耐藥率大于36%，羅紅霉素的耐藥率大于23%，諾氟沙星、慶大霉素、恩諾沙星的耐藥率大于10%，卡那霉素、氧氟沙星、紅霉素的耐藥率小于9%（圖3）。

在高度敏感藥物篩選方面，10種抗生素對92株嗜水氣單胞菌的高敏性為：諾氟沙星77.17%、卡那霉素81.52%、利福平73.91%、羅紅霉素50.01%、慶大霉素79.34%、氧氟沙星93.48%、鏈霉素80.43%、紅霉素28.27%、恩諾沙星78.25%、新霉素9.79%。

3討論與結(jié)論

抗生素產(chǎn)生耐藥性主要有以下危害：①抗生素療效下降，導(dǎo)致后續(xù)劑量加大和用藥期延長的惡性循環(huán)；②產(chǎn)生耐藥性轉(zhuǎn)移，這些殘留的抗生素通過農(nóng)產(chǎn)品，發(fā)生藥物轉(zhuǎn)移到最終的消費者，日積月累地蓄積在消費者體內(nèi)，造成對人體病原菌的慢性刺激，誘發(fā)人類病原菌對某些抗生素的耐受性；③另一種耐藥性轉(zhuǎn)移，消費者食用含有耐藥菌的農(nóng)產(chǎn)品，這些細菌（即使是已經(jīng)烹飪殺死的耐藥細菌），所攜帶的β-質(zhì)粒，可以將對某種抗生素的耐藥性傳遞和轉(zhuǎn)移給人類體內(nèi)的某些致病菌群，從而導(dǎo)致人類被耐藥現(xiàn)象，這就是耐藥性的種間轉(zhuǎn)移。藥物敏感性檢測，可以指導(dǎo)漁民精準(zhǔn)用藥，有效解決水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素濫用問題，減緩抗生素耐藥性產(chǎn)生的進程。

對不同地區(qū)、同屬不同種的細菌進行藥敏試驗，可以指導(dǎo)地區(qū)從業(yè)者有針對性地使用抗生素。筆者對江蘇省重點漁業(yè)養(yǎng)殖地區(qū)、養(yǎng)殖品種中檢測到嗜水氣單胞菌進行藥敏試驗，結(jié)果表明2014—2015年分離的嗜水氣單胞菌對氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類均有耐藥株。對卡那霉素、氧氟沙星、紅霉素耐藥率<9%，可作為治療水產(chǎn)養(yǎng)殖嗜水氣單胞菌病害的防治用抗生素。利福平、新霉素、對羅紅霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、慶霉素的耐藥率>10%，其中對利福平和新霉素的耐藥率>36%。10種抗生素耐藥性檢測中有70%的抗生素耐藥率大于7%，耐藥率高于國外文獻報道[15]結(jié)果，與國內(nèi)人類醫(yī)學(xué)臨床檢驗報道結(jié)果[16]基本吻合，可能與抗菌藥的廣泛應(yīng)用有關(guān)，應(yīng)引起國內(nèi)研究者的重視。在高敏藥物篩選方面，氧氟沙星>90%，卡那霉素、鏈霉素>80%，諾氟沙星、利福平、慶大霉素、恩諾沙星>70%，紅霉素<30%，新霉素<10%。在江蘇地區(qū)嗜水氣單胞菌的藥物防控中，首選藥物為氧氟沙星、卡那霉素和鏈霉素，應(yīng)避免利福平、新霉素和羅紅霉素的使用。

嗜水氣單胞菌分泌的外毒素（Aer）具有細胞裂解性，能引起大多數(shù)嗜水氣單胞菌產(chǎn)α或β溶血。龔暉等[17]對嗜水氣單胞菌Aer溶血特性進行了分析，證實了在單因子條件下嗜水氣單胞菌的溶血特性存在一定的差異，嗜水氣單胞菌中存在多種溶血性毒素，這些毒素對不同宿主的溶血能力存在差異，同一嗜水氣單胞菌菌株對不同宿主起主要作用的溶血性毒素不同。嗜水氣單胞菌引發(fā)的許多暴發(fā)性病害，多伴有敗血癥，嗜水氣單胞菌溶血性毒素的產(chǎn)生，導(dǎo)致了溶血、敗血癥狀。是否產(chǎn)生溶血素是嗜水氣單胞菌是否具有毒力及致病性的重要參考依據(jù)之一。嗜水氣單胞菌為條件致病菌，產(chǎn)生溶血素的嗜水氣單胞菌出現(xiàn)在機體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中，有時并不能立即致病。在外界環(huán)境出現(xiàn)劇烈變化的狀況下，一旦機體的免疫力下降達到臨界值，該菌產(chǎn)生的溶血毒素會成為暴發(fā)疾病的主要因子。該研究結(jié)果表明，此次分離的92株嗜水氣單胞菌有75%都可產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。從江蘇地區(qū)分離的嗜水氣單胞菌，有很高的比例都可以產(chǎn)生溶血素，存在很高的致病風(fēng)險。這就要求該地區(qū)一線養(yǎng)殖管理者，要切實做好池塘管理工作，通過提高環(huán)境質(zhì)量、培育健壯魚種、投喂免疫增強劑等措施，提高養(yǎng)殖水產(chǎn)品的個體抗性。

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