云南自然發(fā)酵酸菜液中乳酸菌的分離鑒定及其發(fā)酵性能研究

奎夢(mèng)漪 薛橋麗 康嬌 胡永金

摘要[目的]對(duì)云南自然發(fā)酵酸菜液中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌進(jìn)行分離、鑒定及發(fā)酵性能研究。[方法]從云南自然發(fā)酵酸菜液中分離出12株乳酸菌，經(jīng)優(yōu)選篩選出4株性狀優(yōu)良的乳酸菌（S-3、S-6、S-8和S-10），通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察及生理生化試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并研究其發(fā)酵性能。[結(jié)果]經(jīng)鑒定，S-3和S-6為植物乳桿菌（Lactobacilllus plantarum），S-8為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），S-10為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。菌株S-6的發(fā)酵性能優(yōu)良，產(chǎn)酸快，產(chǎn)酸量多，耐酸性較好，亞硝酸鹽降解性能高，pH 3時(shí)仍能較好地生長(zhǎng)。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為了解云南傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵機(jī)制和控制酸菜發(fā)酵質(zhì)量提供參考。

關(guān)鍵詞酸菜；乳酸菌；分離；鑒定；發(fā)酵性能

中圖分類(lèi)號(hào)TS205.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）08-0107-03

Isolation，Identification and Fermentation Performance of Lactic Acid Bacteria from Natural Fermented Sauerkraut Broth in Yunnan

KUI Mengyi1，XUE Qiaoli2，KANG Jiao3，HU Yongjin3*（1.School of Life Sciences，Yunnan University，Kunming，Yunnan 650500； 2.Library of Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201； 3.College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201）

Abstract[Objective] The isolation and identification of the dominant lactic acid bacteria in natural fermented sauerkraut in Yunnan were investigated，and the fermentation performance of the isolated strains was measured.[Method] 12 strains from the natural fermented sauerkraut broth in Yunnan were isolated，and four strains of lactic acid bacteria （S-3，S-6，S-8 and S-10） with the fine fermentation were screening out.According to their colony morphology，staining property and biochemical reaction characteristics，S-3 and S-6 are Lactobacilllus plantarum，S-8 is Leuconostoc mesenteroides and S-10 is Lactobacillus brevis. The strain S-6 has very good performance，such as fast acidforming，large acidoutput and high nitrite degradation capacity.At the same time，acid fastness of the strain S-6 shows the best among the 4 strains，which could grow very well under the condition of pH 3.[Conclusion] The results provide a reference for the fermentation mechanism of traditional sauerkraut and control the quality of the natural fermented sauerkraut in Yunnan.

Key wordsSauerkraut；Lactic acid bacteria；Isolation；Identification；Fermentation performance

酸菜是我國(guó)傳統(tǒng)的大眾型蔬菜發(fā)酵食品，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富、質(zhì)感脆嫩、味道酸爽、色澤鮮亮、開(kāi)胃提神、醒酒去膩，不但能增進(jìn)食欲、幫助消化，還可以促進(jìn)人體對(duì)鐵元素的吸收[1]，其汁液中也富含乳酸菌活菌，賦予酸菜多種營(yíng)養(yǎng)保健功效[2-4]。酸菜也是云南蔬菜腌漬品中最主要的產(chǎn)品，但云南酸菜的生產(chǎn)依然是采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵方法，發(fā)酵周期相對(duì)較長(zhǎng)，發(fā)酵過(guò)程中容易污染，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，生產(chǎn)效率低下，并且亞硝酸鹽、食鹽的含量高，對(duì)人體存在潛在危害[5]。筆者從云南傳統(tǒng)發(fā)酵優(yōu)良的酸菜中分離培養(yǎng)出優(yōu)勢(shì)乳酸菌，采用形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定手段對(duì)篩選到的優(yōu)勢(shì)乳酸菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生理特性和發(fā)酵性能進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，從中篩選出產(chǎn)酸快、同型乳酸發(fā)酵、具有特殊功能特性的優(yōu)良乳酸菌菌株，旨在為促進(jìn)云南酸菜這一傳統(tǒng)食品的現(xiàn)代化生產(chǎn)，縮短酸菜生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，提高酸菜的產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)品生產(chǎn)的技術(shù)含量和經(jīng)濟(jì)效益奠定了理論基礎(chǔ)，為制備更優(yōu)良、安全性高的云南發(fā)酵蔬菜制品提供更豐富的菌種資源和科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。酸菜：從云南通海普通家庭腌制酸菜中隨機(jī)采集20份成熟酸菜樣品；

培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。主要試劑：蛋白胨、酵母膏、吐溫-80、牛肉膏、瓊脂、乳酸。

1.1.2主要儀器設(shè)備。

精密pH計(jì)、AE100S電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱、HWS24D恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；ZHJH-C1115B超凈工作臺(tái)，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；MLS-3750立式壓力蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司。

1.2乳酸菌的分離與鑒定

1.2.1乳酸菌的分離篩選。

初篩：將不同酸菜樣品汁液分別用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)捎?0倍梯度稀釋法，選擇適宜的稀釋度，涂布在乳酸菌初篩平板上，37 ℃下培養(yǎng)48 h，挑取碳酸鈣圈較大、培養(yǎng)基變黃的菌落。復(fù)篩：將初篩得到的菌株用接種針轉(zhuǎn)接到復(fù)篩試管內(nèi)斜面培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)36 h，將斜面培養(yǎng)基顏色變化較大的菌株轉(zhuǎn)到平板培養(yǎng)基上純化，分離出單菌落。純化后的菌株于MRS斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2乳酸菌的鑒定。

①形態(tài)特征鑒定。菌落形態(tài)：觀(guān)察MRS平板培養(yǎng)基上單菌落形態(tài)，菌株革蘭氏染色。②產(chǎn)酸量測(cè)定。以酚酞作指示劑，采用氫氧化鈉堿液滴定法進(jìn)行測(cè)定[6]。③產(chǎn)乳酸鑒定。采用紙層析乳酸定性試驗(yàn)確定乳酸細(xì)菌[7]。④生理生化特性鑒定。參照《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行鑒定[8]。

1.3乳酸菌發(fā)酵性能分析

1.3.1乳酸菌生長(zhǎng)特性測(cè)定。

供試菌株分別在無(wú)菌MRS培養(yǎng)液中活化2代，使菌株濃度達(dá)108 CFU/mL，以2%接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基（蔬菜汁）中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液2 mL 加入玻璃比色皿中，使用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值，分析比較菌株的生長(zhǎng)速率（μmax）和最大生長(zhǎng)量（OD600）。

1.3.2產(chǎn)酸速率與產(chǎn)酸量測(cè)定。將

供試菌株分別在無(wú)菌MRS培養(yǎng)液中活化2代，使菌株濃度達(dá)108 CFU/mL，以2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（蔬菜汁），在37 ℃下培養(yǎng)24 h，分析比較菌株的最大產(chǎn)酸量（°T）。

1.3.3亞硝酸鹽降解率的測(cè)定。

將經(jīng)活化2次的供試菌株按菌株濃度108 CFU /mL、2%的接種量接入10 mL 已滅菌的含有10 mg/kg NaNO2（分析純）的發(fā)酵培養(yǎng)基（蔬菜汁）中，在最適條件下培養(yǎng)24 h，采用鹽酸萘乙二胺法（GB 5009.33—2016）測(cè)定NaNO2含量，同時(shí)以未接種乳酸菌的蔬菜汁作為空白對(duì)照，重復(fù)3次。

1.3.4耐酸性能測(cè)定。

將經(jīng)活化2次的供試菌株按菌株濃度108 CFU /mL、2%的接種量分別接種至pH 2.0、2.5、3.0和3.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2 h，分別取0和2 h的菌液傾注平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算酸作用2 h的存活率。

2結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的分離篩選經(jīng)分離優(yōu)選得到12株菌株，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，菌株透明圈大小與產(chǎn)酸量呈正相關(guān)。在S-1～S-12各菌株中，以S-6菌株的透明圈直徑最大，達(dá)3.8 mm，產(chǎn)酸量最多，達(dá)2.98%；其次分別為S-3、S-10、S-8菌株，透明圈直徑均超過(guò)3.0 mm，分別為3.6、3.5和3.1 mm，產(chǎn)酸量分別為2.68%、2.58%和2.24%；S-1菌株透明圈和產(chǎn)酸量均最低。根據(jù)菌株透明圈大小與產(chǎn)酸量，以S-3、S-6、S-8和S-10菌株作為優(yōu)選出的4個(gè)高產(chǎn)酸菌株開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2乳酸菌的鑒定

2.2.1紙層析乳酸定性比較。

對(duì)乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和S-3、S-6、S-8、S-10 4株菌株的發(fā)酵液進(jìn)行比較，結(jié)果得發(fā)酵液的Rf值依次為0.736±0.002、0.729±0.004、

0.732±0.006、0.735±0.007、0.727±0.005。結(jié)果表明，S-3、S-6、S-8和S-

10菌株的發(fā)酵液中均含有乳酸，說(shuō)明4個(gè)菌株均為產(chǎn)乳

酸菌株。

2.3菌株發(fā)酵性能研究

2.3.1生長(zhǎng)速率與生長(zhǎng)量。

對(duì)菌株生長(zhǎng)量和生長(zhǎng)性能進(jìn)行測(cè)定以了解其生長(zhǎng)周期及生長(zhǎng)情況，S-3、S-6、S-8和S-10菌株的生長(zhǎng)速率與生長(zhǎng)量見(jiàn)表4。

可知，菌株S-3、S-6和S-10生長(zhǎng)速率快，在蔬菜發(fā)酵前期其可以快速繁殖并成為發(fā)酵體系優(yōu)勢(shì)菌群，這可抑制發(fā)酵過(guò)程中的雜菌生長(zhǎng)，從而減少其有害代謝產(chǎn)物的積累。

2.3.2產(chǎn)酸量。各菌株的產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量大小見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，各菌株產(chǎn)酸量不斷增加，在生長(zhǎng)過(guò)程中，乳酸菌快速繁殖產(chǎn)酸，使發(fā)酵液的pH 迅速下降。發(fā)酵過(guò)程中，酸度大小是

影響發(fā)酵蔬菜質(zhì)量的重要因素之一，也是衡量乳酸菌性能優(yōu)劣的重要參考依據(jù)。發(fā)酵48 h，S-6菌株具有最大的產(chǎn)酸量，其次分別為S-3和S-10菌株，產(chǎn)酸量最小的是S-8菌株。

2.3.3亞硝酸鹽降解能力。

不同種類(lèi)乳酸菌降解亞硝酸鹽能力不同，即使同一種類(lèi)的不同菌株之間降解亞硝酸鹽的能力也會(huì)有所差異，篩選降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)的菌株，對(duì)于保證泡菜質(zhì)量安全十分必要。S-3、S-6、S-8和S-10菌株降解亞硝酸鹽的能力見(jiàn)圖2。

可以看出，各供試菌株對(duì)亞硝酸鹽均有一定的降解能力。亞硝酸鹽降解率最高的為S-6菌株，降解率可以達(dá)85.8%；亞硝酸鹽降解率最低的菌株為S-8，降解率只有64.2%。

2.3.4耐酸性能。S-3、S-6、S-8和S-10菌株在不同酸性環(huán)境下的存活率如圖3所示。

由圖3可知，供試菌株在pH 3.5均具有較高的存活率，S-6菌株 2 h后存活率42.32%。但隨著pH的降低，各菌株存活率逐漸下降。在pH 2.0環(huán)境2 h后，存活率最高的仍是S-6菌株，為8.78%；存活率最低的菌株為S-8，為2.32%。

3結(jié)論

從云南自然發(fā)酵酸菜汁中分離得到12株產(chǎn)酸菌株。采用形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)合生理生化特性分析對(duì)S-3、S-6、S-8和S-10這4個(gè)高產(chǎn)酸菌株進(jìn)行鑒定，S-3和S-6菌株為植物乳桿菌，S-8為腸膜明串珠菌，S-10為短乳桿菌。最終得出，S-6菌株具有優(yōu)良的發(fā)酵性能。

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