短短芽胞桿菌FJAT—0809—GLX超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表達(dá)

車建美 馬桂美 劉波 劉國(guó)紅 陳倩倩

摘 要 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX具有抑菌、抗褐變和保鮮功能。以短短芽胞桿菌菌株FJAT-0809-GLX總DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增超氧化物歧化酶（Supseroxide dismutase，SOD）基因，將該片段純化回收后與pMD18-T連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示SOD基因序列長(zhǎng)度為609 bp（GenBank登錄號(hào)：KM255665），編碼202個(gè)氨基酸殘基。將SOD基因片段與同樣酶切的表達(dá)載體pET-28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-SOD，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21，采用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，在菌體中存在約25 ku的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，與該基因ORF預(yù)期大小接近。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究該酶的生理生化特性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 短短芽胞桿菌；超氧化物歧化酶；基因；克??；表達(dá)

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Expression of Superoxide Dismutase Gene from

Brevibacillus brevis Strain FJAT-0809-GLX

in Escherichia coli

CHE Jianmei， MA Guimei， LIU Bo*， LIU Guohong， CHEN Qianqian

Agricultural Bio-resources Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract The gene（GenBank No. KM255665）encoding superoxide dismutase（SOD）in the strain of Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX was cloned by PCR with total DNA extracted from this strain as a template. The PCR product was purified and ligated with pMD18 and then transformed into Escherichia coli DH5α. The recombinant plasmid DNA was used for nucleotide sequencing. The results indicated that the gene was 609 bp and it encoded 202 amino acid residues. The DNA product was purified and then inserted into the expression vector pET-28a to generate the recombinant expression vector pET-28a-SOD. Both the inserted fragment and its reading frame were confirmed by BamHⅠ/XhoⅠdigestion. Vector pET-28a-SOD was transformed into E. coli BL-21 and induced with Isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside（IPTG）. SDS-PAGE showed that the relative molecular weight of the expressed protein was about 25 ku in cells， which was close to the ORF of SOD. The data laid a foundation for the further study on the biochemical and physiological characteristics of this enzyme.

Key words Brevibacillus brevis； superoxide dismutase； gene； clone； express

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.020

短短芽胞桿菌[Brevibacillus brevis（Migula 1900）Shida et al. 1996]呈桿狀，革蘭氏陽性，產(chǎn)芽胞，不產(chǎn)生毒素，對(duì)環(huán)境安全友好[1-2]，在生物防治[3-6]、分泌表達(dá)外源蛋白[7-8]、微生物保鮮[9]、微生物降解[10-11]和工業(yè)生產(chǎn)[12]等方面應(yīng)用廣泛。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)短短芽胞桿菌部分生防或代謝相關(guān)功能基因進(jìn)行了研究，主要包括巰基-二硫化物氧化還原酶基因bdb[13]、α-乙酰乳酸脫羧酶基因ald[14]、耐堿性木聚糖酶基因xylB[15]、短桿菌酪肽生物合成相關(guān)基因tycA與tycB[16]、短短芽胞桿菌細(xì)胞壁基因[17]、dnaK基因[18]、編碼3-己酮糖-6-磷酸合成酶和6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶hps和phi基因[19]等。隨著短短芽胞桿菌全基因組序列測(cè)序的完成，該菌株中與生防相關(guān)的功能基因正逐步被挖掘出來。

短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX為本課題組篩選得到的菌株，該菌株對(duì)不同植物和動(dòng)物病原菌具有很好的抑制作用[19]，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)[20]，對(duì)龍眼、枇杷等果實(shí)具有較好的保鮮效果[21-22]?；谠摼耆蚪M序列測(cè)序的完成和數(shù)據(jù)分析[23]，本研究前期以其基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增首次得到幾丁質(zhì)酶基因chiD序列，并進(jìn)行了原核表達(dá)，獲得的幾丁質(zhì)酶基因chiD序列片段為1 524 bp，編碼507個(gè)氨基酸，理論蛋白質(zhì)分子量約54.55 ku，其等電點(diǎn)在5.77左右，表明該幾丁質(zhì)酶為酸性幾丁質(zhì)酶[24]。

超氧化物歧化酶（superoxiede dismutase，SOD）分為Mn-SOD、Fe-SOD和Cu/Zn-SOD等不同類型[25-26]，其中，Mn-SOD為誘導(dǎo)型表達(dá)，在應(yīng)對(duì)環(huán)境變化或脅迫方面具有重要作用，尤其是在內(nèi)生菌的定殖和生防方面，與抗病、促生作用相關(guān)[27]。目前，有關(guān)學(xué)者已經(jīng)從蠟樣芽胞桿菌[27]、枯草芽胞桿菌[28]、土壤環(huán)酸芽胞桿菌[29]等中克隆了Mn-SOD，并進(jìn)行了原核表達(dá)，但國(guó)內(nèi)外對(duì)短短芽胞桿菌Mn-SOD基因的研究較少。本研究以短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX為材料，利用PCR克隆超氧化物歧化酶基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行基因的原核表達(dá)，將有助于深入研究SOD在短短芽胞桿菌生防應(yīng)用中的功能及探討其對(duì)植物促長(zhǎng)和生防的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX和大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)保存；大腸桿菌BL-21（DE3）為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所饋贈(zèng)；載體pMD18-T購(gòu)于Takara生物科技有限公司；pET-28a由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與XhoⅠ購(gòu)自Takara生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自BioTeke公司；dNTP購(gòu)自北京天根生物有限公司；3 000 bp Marker購(gòu)自Ferments生物有限公司；Mini Plasmid extraction kit購(gòu)自O(shè)MEGA生物有限公司。LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸粉，0.5% NaCl，添加1.7%瓊脂為固體培養(yǎng)基；在LB固體培養(yǎng)基中添加40 μL 2% X-Gal、7 μL 20%異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）和50 μg/mL氨芐青霉素作為陽性克隆篩選培養(yǎng)基，添加50 μg/mL卡那霉素作為陽性轉(zhuǎn)化子篩選培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX全基因組分析，獲得超氧化物歧化酶開放閱讀框，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，在引物2端添加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，對(duì)SOD基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，用于SOD基因PCR擴(kuò)增的上下游引物分別為SODORF_F（5′-CGCGGATCCATGGCACATCAA

CTTCCTGCATTGC-3′）和（SODORF_R 5′-CCGCTC

GAGTTACTTCGCTGCTGCGAAACGCTTGC-3′），委托上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 超氧化物歧化酶基因的克隆 以短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX總DNA為模板進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板DNA（20 ng/μL）1 μL，上下游引物各1 μL，dNTP混合液0.5 μL，Taq酶0.3 μL，Buffer 2.5 μL，ddH2O 18.7 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃變性5 min；接著94 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物回收，與克隆載體pMD18-T連接，于16 ℃反應(yīng)過夜；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用LB平板（添加40 μL 2% X-Gal、7 μL 20% IPTG和50 μg/mL氨芐青霉素）進(jìn)行陽性克隆子篩選；提取pMD18-T-SOD/DH5α陽性克隆子菌株質(zhì)粒用于測(cè)序，并利用ProtParam tool和ScanProsite在線軟件對(duì)相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行分析。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與XhoⅠ分別對(duì)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD18-T-SOD和表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行雙酶切，其中重組質(zhì)粒雙酶切體系為20 μL（BamHⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，10×K Buffer 2 μL，重組質(zhì)粒DNA 2 μL，無菌水14 μL）；表達(dá)載體雙酶切體系為20 μL（BamHⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，10×K buffer 2 μL，表達(dá)載體質(zhì)粒DNA 7 μL，無菌水9 μL）。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下進(jìn)行割膠回收；采用T4連接酶進(jìn)行連接，連接體系為25 μL（10×T4連接酶Buffer 2.5 μL，T4連接酶1 μL，DNA片段0.3 pmol，載體DNA 0.03 pmol，加水至25 μL），于16 ℃連接16 h后，加入2.5 μL 3 mol/L醋酸鈉（pH5.2）和62.5 μL預(yù)冷的無水乙醇，置于-20 ℃ 30～60 min；以12 000 r/min離心2 min，棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇，以12 000 r/min離心2 min，棄上清后吹干獲得連接產(chǎn)物pET-28a-SOD。

1.2.4 超氧化物歧化酶基因的原核表達(dá)及活性測(cè)定

將連接產(chǎn)物pET-28a-SOD轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑選陽性克隆子于LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，以37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16～24 h；利用Omega質(zhì)粒提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，采用雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證，酶切體系及程序同上；挑取驗(yàn)證正確的陽性克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，以37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h（OD600=0.6），加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，以37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h；離心收集菌體，加入200 μL 2×電泳上樣緩沖液懸浮菌體，置于沸水中水浴20 min，以12 000 r/min離心15 min，收集上清液直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳（方法參照Takara商品參考目錄）。將pET-28a直接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑取轉(zhuǎn)化子，以37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h；離心收集菌體，加入200 μL 2×電泳上樣緩沖液懸浮菌體，置于沸水中水浴20 min，以12 000 r/min 離心15 min，收集上清液作為對(duì)照。采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定離心收集的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)過夜的重組菌菌體裂解液中的SOD酶活性，重復(fù)3次。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定菌體中的蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX超氧化物歧化酶基因的克隆和序列測(cè)定

以短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX總DNA為模板，對(duì)SOD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約600 bp處有一條擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，與預(yù)期相符合（圖1）?；厥誗OD基因片段，與pMD18-T克隆載體連接后，獲得連接產(chǎn)物，采用熱擊法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中；隨機(jī)挑取陽性克隆子轉(zhuǎn)接至含有氨芐青霉素抗性的液體培養(yǎng)基，以200 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 h，采用水煮法提取質(zhì)粒DNA，利用pMD18-T的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，經(jīng)通用引物擴(kuò)增后片段約為750 bp（圖2），初步判斷已成功克隆SOD基因；將其序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)為KM255665；采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因的ORF序列長(zhǎng)度為609 bp；經(jīng)與NCBI上相關(guān)序列比較發(fā)現(xiàn)，該SOD核苷酸序列僅與目前完成全基因組測(cè)序的短短芽胞桿菌NBRC 100599的SOD基因核苷酸相似度為99%。

利用DNAMAN翻譯SOD基因得到202個(gè)氨基酸序列，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與目前完成全基因組測(cè)序的短短芽胞桿菌NBRC 100599的SOD氨基酸序列相似度為99%，與側(cè)胞芽胞桿菌、專性嗜堿芽胞桿菌、類芽胞桿菌的SOD氨基酸序列相似度分別為87%、78%、77%，表明短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX中的SOD基因具有種屬特性。采用Protparam對(duì)該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該SOD蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為22 045.5，等電點(diǎn)為5.71。ScanProsite分析顯示，該SOD是一個(gè)MnSOD，其不僅具有錳離子結(jié)合位點(diǎn)，還存在鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，而且還有一個(gè)天冬氨酸和組氨酸配體區(qū)域的短的保守區(qū)域。進(jìn)一步進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有螺旋、β-折疊和卷曲，如圖3所示，其中H代表螺旋區(qū)，E代表β-折疊，C代表卷曲。

2.2 重組表達(dá)載體pET-28a-SOD的構(gòu)建

將經(jīng)雙酶切后的SOD基因片段和同樣處理的表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行連接，采用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，對(duì)獲得的重組表達(dá)載體pET-28a-SOD進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，在約600 bp處有清晰條帶（圖4），將其初步鑒定為陽性轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步對(duì)陽性克隆中的重組質(zhì)粒進(jìn)行提純，采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切，電泳后在約600 bp處出現(xiàn)清晰條帶（圖5），確定其為陽性轉(zhuǎn)化子。將獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，序列匹配率為100%，說明在重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，SOD基因并沒有發(fā)生突變，且正確連接到表達(dá)載體pET-28a。

2.3 重組SOD的誘導(dǎo)表達(dá)及活性測(cè)定

將驗(yàn)證后的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果如圖6所示。pET-28a-SOD菌體裂解液上清在25 ku處具有清晰條帶，而菌液上清液和含有pET-28a質(zhì)粒的菌體裂解液在25 ku處條帶差異不明顯，軟件預(yù)測(cè)SOD蛋白大小約為22 ku，表明短短芽胞桿菌中SOD在大腸桿菌BL-21中順利表達(dá)。采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的pET-28a-SOD菌體裂解上清液中的SOD酶活性，結(jié)果顯示其酶比活為3 435.23 U/mg，表明從短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX中克隆的Mn-SOD在大腸桿菌中得到了高效的表達(dá)。

3 討論

超氧化物歧化酶（SOD）在動(dòng)植物和微生物中普遍存在，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，SOD的過量表達(dá)可明顯提高植物的抗逆能力，增強(qiáng)植物對(duì)氧化脅迫的耐受性，利于轉(zhuǎn)基因植物更好地適應(yīng)逆境[31]，因而對(duì)SOD的研究也越來越深入[32]。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX的SOD基因在線比對(duì)結(jié)果顯示，其具有種屬特性，基因序列僅與完成全基因組測(cè)序的短短芽胞桿菌NBRC 100599中SOD基因相似度為99%，與其他種屬的相似度均較低，該結(jié)果與蠟狀芽胞桿菌SOD基因序列比對(duì)相同，蠟狀芽胞桿菌905銅鋅超氧化物歧化酶基因片段為537 bp，Blast結(jié)果顯示其與其它幾株蠟狀芽胞桿菌的SOD基因同源性在90%以上[33]。

微生物的需氧情況會(huì)影響SOD的含量、種類和分布[34]。好氧微生物中SOD的含量顯著高于厭氧微生物，嚴(yán)格厭氧微生物則基本不含SOD[32]。此外，隨著所處環(huán)境的不同，厭氧微生物中SOD也有所不同，無氧條件下，在脆壁芽胞桿菌、多形擬桿菌和大腸桿菌中可檢測(cè)到FeSOD，而其在有氧條件下則具有較高的MnSOD活性[35]。本研究中獲得的SOD類型為MnSOD，其蛋白中含有Fe離子和Mn離子配位區(qū)域，因此推測(cè)在有氧條件和無氧條件下，該菌株均可表現(xiàn)出SOD活性。

大腸桿菌pET表達(dá)系統(tǒng)是目前表達(dá)外源基因效率最高的表達(dá)系統(tǒng)之一，很多SOD基因均在該表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。孟玲等[36]構(gòu)建了耐輻射奇球菌Mn-SOD基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-SOD，并進(jìn)行了原核高效表達(dá)，蛋白活性可達(dá)51 800 U/g濕菌體。將蠟樣芽胞桿菌中的M22銅鋅超氧化物歧化酶基因編碼區(qū)插入表達(dá)載體pET-22b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白占菌體裂解液總蛋白的21.3%[37]。本研究將短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX的SOD基因進(jìn)行克隆，與含有組氨酸標(biāo)簽的pET-28a質(zhì)粒連接，并將其在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，為該菌株SOD酶的研究和應(yīng)用提供有利條件。

通過SOD酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，SOD酶主要存在于菌體裂解液上清液中，其酶比活最高為3 435.23 U/mg，該菌株SOD酶比活性明顯高于其它菌株，如枯草芽胞桿菌MnSOD在原核表達(dá)中的酶比活為2 553.211 U/mg[28]；蠟狀芽胞桿菌M22中的MnSOD在原核表達(dá)中的酶比活僅為156.65 U/mg[27]。短短芽胞桿菌SOD基因的成功克隆及原核表達(dá)對(duì)了解其生防機(jī)理具有重要作用，同時(shí)，為進(jìn)一步研究芽胞桿菌SOD基因的酶學(xué)特性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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