燕麥蛋白質(zhì)近紅外定量模型的創(chuàng)建及其在育種中的應(yīng)用

張麗君 劉龍龍 馬名川 崔林 周建萍

摘要[目的]研究利用近紅外光譜分析法定量分析燕麥完整籽粒粗蛋白含量的可行性，探討不同地區(qū)種植的同一燕麥品種蛋白質(zhì)含量的變化，以期為燕麥的營養(yǎng)品質(zhì)育種提供參考依據(jù)。[方法]收集蛋白質(zhì)含量變幅較大的124份代表性燕麥樣品，利用近紅外谷物品質(zhì)分析儀進行光譜掃描，采用常規(guī)化學(xué)分析方法（GB/T 5009.5—2010）測定樣品蛋白質(zhì)含量，借助近紅外定標(biāo)軟件WinISI，采用偏最小二乘法（PLS）建立燕麥粗蛋白含量的定標(biāo)模型。利用定標(biāo)模型對14個地區(qū)219份（17個品種）燕麥完整籽粒粗蛋白含量進行測定，分析不同地區(qū)、不同類型燕麥樣本間的差異。[結(jié)果]124份燕麥籽粒樣品的粗蛋白含量為15.49%～23.77%，分布范圍較廣，具有較好的代表性。成功建立了燕麥蛋白質(zhì)含量的定標(biāo)模型，決定系數(shù)較高，標(biāo)準(zhǔn)誤差較小，回歸方程具有較高的準(zhǔn)確性。因此，利用近紅外光譜分析技術(shù)檢測燕麥籽粒中粗蛋白含量是可行且可靠的，可替代化學(xué)測定方法。[結(jié)論]近紅外光譜分析技術(shù)為檢測燕麥籽粒粗蛋白質(zhì)含量提供了一種新方法。

關(guān)鍵詞燕麥；近紅外光譜；粗蛋白

中圖分類號S503文獻標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）08-0010-04

Establishment of Nearinfrared Quantitative Model for Protein in Oat and Its Application in the Breeding

ZHANG Lijun，LIU Longlong，MA Mingchuan，ZHOU Jianping* et al（Institute of Crop Germplasm Resources，Shanxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of Agriculture/Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops，Taiyuan，Shanxi 030031）

Abstract[Objective] To study the feasibility of quantitatively analyzing protein content in oat by using nearinfrared spectroscopy （NIRS） and discuss the changes of crude protein content in the same oat variety planted in different regions，to provide reference basis for improving the nutritional quality in the oats breeding.[Method] 124 representative oat samples with a broad range of crude protein content were collected to make spectral scanning by using nearinfrared grain quality analyzer.The contents of crude protein in samples were determined using traditional chemical method （GB/T 5009.5—2010）.By the aid of nearinfrared calibration software WinISI，the calibration model was established by using partial least square （PLS）method.The content of crude protein in 219 oat samples （17 varieties） was determined by using calibration model.The differences among different regions and different types were analyzed.[Result] The content of crude protein in 124 oat grain samples was 15.49%-23.77%，which had broader distribution range and good representativeness.The calibration model was successfully established with larger coefficient of determination and smaller standard error.The regression equation had a higher accuracy.Therefore，it was feasible and reliable to determine the content of crude protein in oat grains by using nearinfrared spectroscopy technique.Nearinfrared spectroscopy technique can replace chemical measurement method.[Conclusion]Nearinfrared spectroscopy technique provides a new method for determining the content of crude protein in oat grains.

Key wordsOat；Nearinfrared spectroscopy；Crude protein

燕麥起源于地中海、非洲以及中國，隸屬禾本科燕麥屬（Avena.L）一年生草本，集食用、飼用、藥用于一體，具有一定的醫(yī)療價值和保健作用，對于提高人類健康水平具有重要作用[1-2]。燕麥在我國已有2 100年的栽培歷史，是我國西南高寒山區(qū)和北方農(nóng)牧地區(qū)的特色農(nóng)作物。燕麥對自然條件惡劣、生態(tài)環(huán)境脆弱、土壤鹽堿化嚴(yán)重地區(qū)的適應(yīng)能力較強，具有抗干旱、耐鹽堿的特性，對于改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義[3]。與其他谷物相比，燕麥的蛋白質(zhì)含量為13%～22%，脂肪含量為4%～16%，含有大量的不飽和脂肪酸[4-5]。燕麥已成為制作面包、點心、餅干的優(yōu)質(zhì)原料。隨著市場多樣化需求的不斷增加，燕麥在食品加工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、畜牧業(yè)等行業(yè)越來越顯示出重要作用。

蛋白質(zhì)含量測定的常規(guī)方法主要是凱氏法（Kjeldahl），它是一個繁瑣、耗時、費力的破壞性分析法，在育種中難以及時準(zhǔn)確地提供分析數(shù)據(jù)，一定程度上阻礙了燕麥蛋白質(zhì)育種的研究進程。近紅外光譜（Near infrared spectroscopy，NIRS）分析技術(shù)是新近發(fā)展起來的農(nóng)產(chǎn)品高效分析法，是利用有機物質(zhì)在近紅外譜區(qū)的振動吸收而快速測定樣品中多種化學(xué)成分含量的一項技術(shù)，其中透射譜區(qū)的近紅外光在樣品的穿透能力可達30 mm，適合整粒或原樣樣品分析[6-7]。近紅外光譜分析技術(shù)有常規(guī)分析法所難以比擬的許多優(yōu)越性，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的水分[8]、蛋白質(zhì)[9]、脂肪[10]、淀粉[11]、糖[12]等含量的測定，其中水稻[13]、大豆[14]、玉米[15]等大宗作物品種分析的報道較多。近紅外光譜技術(shù)能有效改變燕麥蛋白質(zhì)育種進展緩慢的不利局面，目前利用完整燕麥籽粒的研究報道卻很少。陳龍等[16]、趙秀芳等[17]通過近紅外光譜對燕麥干草蛋白質(zhì)進行分析。筆者采用近紅外透射技術(shù)，利用全息數(shù)字光柵進行全譜掃描，對燕麥粗蛋白含量進行了測定，并分析不同地區(qū)燕麥蛋白質(zhì)與產(chǎn)地之間的關(guān)系，旨在為燕麥種質(zhì)資源的篩選、鑒定及收集、利用尋找一種準(zhǔn)確、簡便、有效的分析手段。

1材料與方法

1.1材料試驗材料包括2個部分，分別用于蛋白質(zhì)含量預(yù)測模型建立和育種材料的預(yù)測篩選。一部分來自山西種質(zhì)資源中期庫保存蛋白質(zhì)含量變幅較大的124份代表性燕麥樣品（來源地信息見表1），這些材料的蛋白質(zhì)含量和11個農(nóng)藝性狀（單株粒重、千粒重、生育期、株高、幼苗習(xí)性、幼苗顏色、有效分蘗、旗葉葉相、穗形、小穗形、內(nèi)稃色）均有較大差異，因此具有較好的代表性； 另一部分來自燕蕎麥現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系2011年全國燕麥新品種展示試驗的14個區(qū)試點（地名、經(jīng)緯度、海拔、降水量見表2）的219份燕麥籽粒17個燕麥品種（白燕2號、蒙燕833-1-1、冀張莜12號、冀品1號、寧莜1號、壩莜12號、壩莜13號、燕2009、白燕11號、冀張燕5號、定燕1號、壩燕5號、冀鑒001、V9、冀張燕3號、壩燕6號、9642-4），用于蛋白質(zhì)含量的檢測。

1.2方法

1.2.1樣品制備。

選取適量的樣品，去除雜質(zhì)以及病、霉籽粒，用于樣品光譜的采集；用FOSS的旋風(fēng)磨（Cyclotec1093）將已經(jīng)掃過光譜的樣品（建模材料）制成粉狀，用于常規(guī)粗蛋白的測定。

1.2.2光譜測定。樣本經(jīng)風(fēng)選除雜，在瑞典 FOSS-Tecator的InfratecTM 1241型近紅外光譜儀上進行光譜掃描，將燕麥籽粒置于樣品池中。在光程18 mm下掃描光譜，采集樣品的吸收光譜；為了克服樣品粒度差異引起的光譜漂移[18]，減少誤差，每份樣品重復(fù)取樣2次，每次取樣掃描2個光譜（重復(fù)裝樣獲得光譜），2次重復(fù)4個光譜，得到 1 條平均近紅外光譜圖，通過分析儀適配器轉(zhuǎn)換，把每個光譜數(shù)據(jù)儲存于計算機內(nèi)，并使用 FOSS 公司提供的近紅外專業(yè)定標(biāo)軟件（WinISI）對光譜進行分析。

1.2.3燕麥籽粒粗蛋白含量的測定。

粗蛋白含量測定按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5009.5—2010）中凱氏法[19]進行。標(biāo)準(zhǔn)樣品是用全麥粉粗蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW（E）100126]，利用FOSS的全自動凱氏定氮儀（Kjeltec8400）測定粗蛋白含量；每個樣品重復(fù)測定 2 次，求出2次重復(fù)測定結(jié)果的平均值。常規(guī)分析數(shù)據(jù)為化學(xué)值，近紅外分析數(shù)據(jù)為預(yù)測值。

1.2.4建立NIRS模型。

利用WINSIⅢ軟件，對采集的光譜數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)正?；腿ド⑸涮幚?，導(dǎo)數(shù)光譜分別采取一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)處理，利用主成分分析（PCA） 技術(shù)自動剔除超常樣品，并選擇具有代表性的樣品，采用最小二乘法回歸（Partial least square，PLS）法建立燕麥粗蛋白的定標(biāo)模型。

1.2.5定標(biāo)模型在育種中的應(yīng)用。

使用近紅外分析儀對14個地區(qū)219份燕麥籽粒17個燕麥品種籽粒粗蛋白含量進行測定。所有樣品重復(fù)測定3次，取其平均值。

2結(jié)果與分析

2.1燕麥籽粒中蛋白質(zhì)含量的化學(xué)測定

采用國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5009.5—2010）凱氏法測定124份燕麥籽粒樣品的粗蛋白含量，結(jié)果表明粗蛋白含量為15.49%～23.77%，平均值為18.93%。這表明試驗選取燕麥品種的粗蛋白含量分布范圍較廣，具有較好的代表性，可用于近紅外光譜定標(biāo)預(yù)測。

2.2校正模型的建立與檢驗結(jié)果分析

利用WinISI軟件具備的“標(biāo)準(zhǔn)正?；幚砗蜕⑸涮幚?，參數(shù)選擇為0.0.1.1”對原始光譜數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)正?；幚?，去除樣品間因散射而引起的光譜誤差，消除由光散射產(chǎn)生的線性基線和背景的影響，然后選擇參數(shù)求一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)，每隔 4點求導(dǎo)，每隔 4點進行平滑處理，對光譜進行優(yōu)化，剔除異常光譜。一階導(dǎo)數(shù)如圖1所示。運用偏最小二乘法（PLS），建立燕麥蛋白質(zhì)的定標(biāo)模型。

2.3燕麥中蛋白質(zhì)含量的近紅外分析校正模型通過主要參數(shù) RSQ、1-VR、SEC、SECV來衡量近紅外模型。

124份樣品中燕麥粗蛋白含量的RSQ和1-VR分別為0.950 3和0.957 7，SEC和SECV分別為0.285 7和0.382 1。粗蛋白含量模型的決定系數(shù)較高，而標(biāo)準(zhǔn)誤差較小，近紅外回歸方程具有較高的準(zhǔn)確性，因此利用近紅外光譜分析技術(shù)檢測燕麥籽粒中粗蛋白含量是可行且可靠的，可以替代化學(xué)測定方法進行粗蛋

白含量測定。

2.4定標(biāo)模型在育種中的應(yīng)用

燕麥樣品來自全國10個

省份的14個試點。根據(jù)行政區(qū)劃，將各試點劃分為3個生態(tài)區(qū)，分別為華北生態(tài)區(qū)（內(nèi)蒙古、山西、河北）、西北生態(tài)區(qū)（新疆、青海、甘肅、寧夏）和西南生態(tài)區(qū)（西藏、云南、四川）。由表3可知，山西陽高縣、山西右玉縣、山西大同市3個試點的經(jīng)緯度、海拔以及降水量等不同，同一品種粗蛋白含量存在差異，山西右玉縣17個燕麥樣品的粗蛋白含量低于山西陽高縣和山西大同市。14個試點的219份燕麥籽粒17個燕麥樣品的平均粗蛋白含量均存在明顯差異（表3），其中甘肅試點粗蛋白含量最高，其次是寧夏試點，四川試點粗蛋白含量最低。由表4可知，3個生態(tài)區(qū)燕麥的粗蛋白含量由高到低依次為西北（15.33%）、華北（15.16%）、西南（11.32%）。

3討論與結(jié)論

由于NIRS具有強大的分析能力，NIRS克服了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)等鑒定方法的弊端，實現(xiàn)了品種的快速準(zhǔn)確鑒定，有效保證了被測樣品的完整性，做到無損檢測[20]。 目前，利用NIRS技術(shù)鑒定的植物品種已涵蓋多種植物，包括糧食作物、經(jīng)濟作物和藥用植物等。由于近紅外光譜信息是重疊、復(fù)雜的信息，受到測定環(huán)境、測量技術(shù)、背景成分、樣品待測成分的影響[21]，

使得光譜模型參數(shù)構(gòu)成復(fù)雜，其準(zhǔn)確性成為自身最大的缺陷。取樣的科學(xué)性，減少試驗誤差，提高光譜分析模型的準(zhǔn)確性是工作重點。近紅外分析模型的建立需要擁

有典型的種質(zhì)資源，樣品按不同時間、地點、批次均勻選取，使得樣品具有代表性。該研究中為了使模型達到理想的分析效果，參與定標(biāo)的124份樣本粗蛋白含量為15.49%～23.77%，盡量減少試驗誤差，注意選擇種質(zhì)產(chǎn)地

來源的代表性，以提高模型的穩(wěn)健性，拓寬模型的適用范圍，采用平均化學(xué)值、平均光譜為基礎(chǔ)參數(shù)的方法，在進行建模軟件的優(yōu)化、對異常值剔除等選用了合適的預(yù)處理方法以盡量扣除干擾信息。該研究中使用定標(biāo)樣品124份，對我國的復(fù)雜多樣、品種繁多的燕麥種質(zhì)及地域、氣候條件不同的品種而言，不具有普遍代表性，因此定標(biāo)模型的升級優(yōu)化工作還在進行。

近紅外光譜分析技術(shù)最早應(yīng)用在農(nóng)產(chǎn)品方面[22]，在作物育種中常常利用單個籽粒的差異來進行相關(guān)性狀的選擇。改變了在燕麥品質(zhì)育種中，利用傳統(tǒng)化學(xué)方法分析測定籽粒品質(zhì)，破壞籽粒性狀，測定值是剩余樣品的參考值，加快了育種的效率和進程。目前，農(nóng)作物品質(zhì)研究涉及籽粒不同成分之間的關(guān)系，在品質(zhì)改良中要針對不同的育種目標(biāo)和加工用途分別進行選擇。我國燕麥生產(chǎn)主要推廣育成品種，因此籽粒品質(zhì)性狀的優(yōu)勢也是主要研究內(nèi)容。歐陽韶暉等[23]對2013年現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系13個區(qū)試點燕麥的主要營養(yǎng)品質(zhì)進行了研究，分析不同生態(tài)區(qū)燕麥籽粒品質(zhì)性狀的優(yōu)勢，探討不同生態(tài)區(qū)的優(yōu)勢品種。鄭建梅等[24]通過對內(nèi)蒙古和河北種植的10個裸燕麥品種進行淀粉品質(zhì)分析，比較品種的變異性和地區(qū)之間的差異性。趙世鋒等[25] 、張智勇等[26]進行了燕麥品種產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的差異分析，通過品質(zhì)與產(chǎn)量的綜合表現(xiàn)篩選優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強的品種。筆者使用近紅外分析儀對不同生態(tài)區(qū)不同試點的燕麥品種材料進行測定，花費時間短，操作簡單，結(jié)果可靠，同時利用近紅外光譜

分析儀可以實現(xiàn)對整粒進行非破壞性測定，對于達到要求的樣品還可以應(yīng)用于育種實踐中。通過對國內(nèi)14個燕麥主產(chǎn)區(qū)燕麥品種展示的樣品進行粗蛋白含量分析，在不同種植地區(qū)以及華北、西北、西南等不同生態(tài)區(qū)之間，燕麥粗蛋白含量差異明顯。燕麥營養(yǎng)品質(zhì)在不同品種、不同地區(qū)及不同年份之間存在差異[23]，營養(yǎng)成分的含量會受產(chǎn)地地理坐標(biāo)（經(jīng)度、緯度、海拔和降水量）的影響，但不同燕麥?zhǔn)苡绊懙姆绞娇赡懿煌?，緯度對蛋白質(zhì)含量的影響顯著[18]。選育優(yōu)良的燕麥品種和適宜的推廣種植產(chǎn)地，需要進行連續(xù)多年的栽培種植和觀察，并結(jié)合各種植區(qū)的氣候、生態(tài)、海拔、經(jīng)緯度、水土等條件，深入探究營養(yǎng)品質(zhì)、燕麥產(chǎn)量變化和生態(tài)環(huán)境之間的關(guān)系。

該研究采用種質(zhì)資源庫中的124份資源建立燕麥近紅外模型，并對2011年現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系新品種展示試驗的14個地區(qū)17個品種的蛋白質(zhì)進行分析。結(jié)果表明，利用近紅外光譜技術(shù)對燕麥種質(zhì)資源的主要品質(zhì)性狀進行鑒定評價可以獲得理想的結(jié)果，在今后的燕麥蛋白質(zhì)育種工作中加強高蛋白種質(zhì)的篩選和利用，通過蛋白質(zhì)含量高的燕麥資源與生產(chǎn)上具有廣泛利用價值、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的燕麥品種雜

交，在育種分離的低世代，利用近紅外分析技術(shù)輔助，定向增加選擇壓可能是燕麥高蛋白質(zhì)育種的一條有效途徑，該技術(shù)與常規(guī)的化學(xué)分析方法相比是有效、簡便、環(huán)保、實用的快速鑒定方法；對燕麥種質(zhì)資源主要品質(zhì)性狀及其不同產(chǎn)地的影響進行分析，為燕麥優(yōu)良品質(zhì)資源的選擇、收集提供了新途徑。

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