干旱脅迫下桑樹(shù)葉片中超氧陰離子的變化規(guī)律

任迎虹 劉松青 祁偉亮 羅翠華 龔壁燃 歐莉萍

摘要： 該研究以6個(gè)四川桑樹(shù)品種為對(duì)象，對(duì)供試桑樹(shù)品種進(jìn)行連續(xù)的人工干旱處理，利用生理方法明確保護(hù)酶系（SOD）的變化規(guī)律，并采用硝基四氮唑藍(lán)（NBT）還原試驗(yàn)進(jìn)行超氧陰離子O-2·組織化學(xué)的可視化檢測(cè)。結(jié)果表明：隨著干旱脅迫的加劇，SOD的含量明顯高于對(duì)照組，其中SOD活性呈先升后降的變化趨勢(shì)，而超氧陰離子一直呈加重的趨勢(shì)。6個(gè)桑樹(shù)品種的SOD 含量從正常到中度脅迫都呈現(xiàn)不同程度的上升趨勢(shì)，上升趨勢(shì)明顯的品種是九龍拐和湖桑32，上幅分別為62.7%和60.1%，其次是云桑1號(hào)和荷葉白一號(hào)上幅，分別為52.2%、58.2%，油桑和充桑的上幅為50.8%和47.4%，說(shuō)明SOD正發(fā)揮著積極的作用。在中度脅迫之后SOD 的含量與活性氧的水平表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，原因可能是隨著干旱脅迫的加劇，O-2·達(dá)到最大值且超出一定域值，從而導(dǎo)致SOD活性的降低。通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，超氧陰離子由葉脈向周圍擴(kuò)散，同時(shí)面積逐漸增大。其中，抗旱性強(qiáng)的品種湖桑32葉片表面茸毛比較長(zhǎng)，且基部膨大，端部有明顯的刺狀突起，而抗旱性弱的品種荷葉白1號(hào)葉片表面茸毛比較細(xì)短且端部的刺狀突起不明顯，因此推測(cè)葉片表面茸毛的特性與抗旱性存在一定關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 桑樹(shù)， 干旱脅迫， 超氧化物歧化酶， 超氧陰離子， 葉片表面茸毛

中圖分類號(hào)： Q945.78， S888.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 10003142（2017）09112208

Abstract： We used six mulberry varieties in Sichuan Province as the research object， by using physiological method and used NBT test to determine the activities of SOD and to study the changes of super oxygen anion （O-2·） in the leaf blade tissues under different drought conditions. The results showed that the SOD content of six mulberry varieties were significantly higher than those of the controls. The change trend of SOD activity was raised and then fell later， and super oxide anion grew steadily. Possible reasons were that reactive oxygen beyond a certain threshold， which led to SOD activity decreased. Under different drought conditions， from normal stress treatment to middle stress， the SOD content of six mulberry varieties also demonstrated rapid growth. Jiulonggui and Husang 32 showed a rising trend and increased by 62.7% and 60.1% obviously； followed by Yunsang 1 and Heyebai 1 raised to 52.2% and 58.2%； Yousang and Chongsang were increased to 50.8% and 47.4%， respectively. This showed that the SOD played an active and effective role to reduce O-2·. After moderate stress level of SOD and active oxygen showed the opposite trend， which showed significant degradation effect， and had a mechanism of active oxygen injury. Super oxide anion spread around the veins， area of super oxide anion gradually increased， which were observed by transmission electron microscope. It is obeserved that Husang 32 has its ability to eliminate the superoxide free radical， and its drought resistance abilities and leaf blade surface hairs were higher than that of Heyebai 1. Hence， it can be inferred that the length of leaf blade surface hairs has a certain relationship with drought resistance.

Key words： mulberry， drought stress， superoxide dismutas， super oxygen anion， leaf blade surface hairs

桑樹(shù)屬桑屬（Morus L.）?？疲∕oraceae），我國(guó)約15個(gè)種，分布于北溫帶，屬于多年生的雙子葉落葉喬木，具有食用、藥用、材用及觀賞等多種利用價(jià)值，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物（秦儉等，2010）。蠶桑產(chǎn)業(yè)是四川傳統(tǒng)特色產(chǎn)業(yè)，是四川省重點(diǎn)發(fā)展的“十大”農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一。而干旱是桑樹(shù)種植最主要的非生物脅迫因素，嚴(yán)重影響桑葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。植物在受到干旱脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生PSII和PSI的光抑制現(xiàn)象，而PSI的光抑制現(xiàn)象與活性氧（ROS）的產(chǎn)生緊密相關(guān)（Liu et al， 2004； Asada， 2006）。體內(nèi)活性氧含量的增加，如過(guò)氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O-2·），對(duì)植物的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生不利影響（Strid et al， 1994； Yu et al， 2006； Pradedova et al， 2011）。因此，植物在干旱或者鹽脅迫下正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵是控制葉綠體中活性氧的平衡（Tseng et al， 2007）。為防止超氧化物對(duì)細(xì)胞體的破壞，植物將啟動(dòng)酶和非酶的防御系統(tǒng)來(lái)有效清除活性氧，以保護(hù)細(xì)胞膜等免受氧化傷害，從而有利于維持其他生理代謝的正常進(jìn)行 （Prochazkova et al， 2001； Gutteridge & Halliwell， 2010）。其中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 在保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的毒害中發(fā)揮著重要作用（Kim et al， 2010），SOD通過(guò)歧化反應(yīng)把O-2·轉(zhuǎn)化為H2O2，H2O2再被過(guò)氧化氫酶和氧化物酶轉(zhuǎn)化為H2O，從而達(dá)到清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，來(lái)緩解植物受到的逆境脅迫（Tian & Lei， 2007； Miller et al， 2010）。因此，抗氧化酶的活性與植物的抗逆性強(qiáng)弱有關(guān)（Kochhar & Kochhar， 2005）。應(yīng)朝陽(yáng)等（2006）、謝亞軍等（2008）和陳珺（2013）分別采用不同的植物花生、甘草以及四種觀賞植物紅葉石楠、小葉黃楊、金葉女貞及大葉黃楊，研究土壤干旱脅迫下對(duì)活性氧代謝及保護(hù)酶活性的影響變化規(guī)律。任迎虹（2009）研究報(bào)道在干旱條件下桑樹(shù)保護(hù)酶活性隨干旱脅迫的加強(qiáng)而提高。

前人研究當(dāng)中經(jīng)常使用紫外—可見(jiàn)吸收分光光度的方法，進(jìn)行檢測(cè)O-2·，但此法難以準(zhǔn)確用于O-2·的定性分析。Donahue（1997）和Liang et al（2003）利用硝基四氮唑藍(lán)（NBT）還原法進(jìn)行O-2·的組織化學(xué)定位， 此法測(cè)定靈敏度高。廖展如等（2003）模擬干旱脅迫利用NBT還原法，對(duì)水稻、棉花、小麥、玉米、油菜、花生等作物進(jìn)行O-2·組織化學(xué)檢測(cè)、光鏡及電鏡觀察。在桑樹(shù)抗逆性研究中，利用硝基四氮唑藍(lán)還原法進(jìn)行O-2·的研究報(bào)道比較少。因此，本研究以6個(gè)四川桑樹(shù)品種為研究對(duì)象，進(jìn)行干旱脅迫處理，利用生理生化方法來(lái)明確活性氧（O-2·）及保護(hù)酶系（SOD）的變化規(guī)律，釆用電鏡細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記技術(shù)在亞細(xì)胞水平上對(duì)O-2·的空間分布進(jìn)行定位，以研究活性氧在不同干旱脅迫下的變化規(guī)律，這為細(xì)胞學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

供試材料充桑，荷葉白1號(hào)，九龍拐，油桑，湖桑32號(hào)，云桑1號(hào)。均采集于四川省西昌市蠶種場(chǎng)品保園，其中旱地對(duì)照材料為湖桑32號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 干旱脅迫處理2015年4月室內(nèi)模擬干旱條件對(duì)種子進(jìn)行發(fā)芽后盆栽， 土壤混合比例（土壤∶營(yíng)養(yǎng)土為1∶1）。7月，苗木高度在40 cm左右時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的苗木，對(duì)供試桑樹(shù)品種進(jìn)行連續(xù)的人工干旱處理。實(shí)驗(yàn)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每個(gè)品種為12盆，待各品種桑樹(shù)生長(zhǎng)正常后，選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的于5月初對(duì)試驗(yàn)組進(jìn)行水分脅迫。將干旱和對(duì)照處理均澆透水后再分別處理，試驗(yàn)組停止?jié)菜?，自然失水，?duì)照組每隔2 d澆一次水，每次每盆1 500 mL。

分別于土壤干旱處理后7、l4、21 d后的早上8：00取上部同葉位葉片，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，三次重復(fù)。測(cè)得田間最大持水量為34.85%，據(jù)此設(shè)為正常處理（含水量為85%～100%）、輕度干旱（含水量為65%～75%）、中度干旱（含水量為50%～65%）、重度干旱（含水量為30%～45%）。

1.2.2 O-2·組織化學(xué)檢測(cè)和SOD活性測(cè)定方法O-2·的可視化檢測(cè)方法是按照Wang et al（2011）的方法，作微小修改進(jìn)行，選取抗旱性強(qiáng)的品種湖桑32和抗旱性弱的品種荷葉白1號(hào)進(jìn)行電鏡觀察，觀察超氧陰離子在細(xì)胞內(nèi)部的變化規(guī)律。SOD活性測(cè)定參考Beauchamp & Fridovich （1971）的測(cè)定方法。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，采用EXCEL和SPSS軟件（王滿蓮等，2014）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1 超氧化物歧化酶的活性變化

隨著干旱脅迫的加劇，SOD活性呈先升后降的變化趨勢(shì)，在各脅迫處理水平下，6個(gè)桑樹(shù)品種的水分含量變化存在顯著差異（P<0.05）。從CK到中度，各品種在干旱脅迫下持續(xù)升高并達(dá)到最大值（圖1），上升趨勢(shì)明顯的品種是九龍拐和湖桑32，分別升高了62.7%和60.1%，其次是云桑1號(hào)和荷葉白一號(hào)，分別升高了52.2% 、58.2%，油桑和充桑的分別升高了50.8%和47.4%，表明湖桑32和九龍柺的活性氧清除能力比較強(qiáng)。從中度到重度，SOD活性呈下降趨勢(shì)，各品種SOD活性從弱到強(qiáng)依次是荷葉白1號(hào)<油桑<充桑<云桑1號(hào)<九龍柺<湖桑32。這說(shuō)明自由基活性氧濃度未超過(guò)傷害“閾值”時(shí)，保護(hù)酶SOD活性會(huì)表現(xiàn)出積極應(yīng)對(duì)；而超過(guò)“閾值”后，保護(hù)酶SOD活性下降，從而進(jìn)一步促使了膜脂過(guò)氧化。

2.2 脅迫條件下對(duì)活性氧積累的影響

隨著干旱脅迫的加劇，超氧陰離子的藍(lán)色斑點(diǎn)聚合產(chǎn)物面積呈上升的變化趨勢(shì)，面積越大表明植物對(duì)干旱脅迫的防御機(jī)制越差，抗旱性能力就越低。在正常處理水平下，6個(gè)桑樹(shù)品種的超氧陰離子藍(lán)色斑點(diǎn)聚合產(chǎn)物均有少量的積累，表明葉片本身也存在少量的超氧陰離子（圖2：a、e、i、m、q、u）。輕度處理下，6個(gè)桑樹(shù)品種的超氧陰離子的藍(lán)色斑點(diǎn)積累產(chǎn)物面積比較小且數(shù)目開(kāi)始增加（圖2：b、f、j、n、r、v）。中度處理下，6個(gè)桑樹(shù)品種的超氧陰離子的藍(lán)色斑點(diǎn)積累產(chǎn)物主要集中在葉脈附近，斑點(diǎn)面積增大，且數(shù)目開(kāi)始增加（圖2：c、g、k、o、s、w）。在重度干旱脅迫處理下，超氧陰離子（O-2·）的藍(lán)色斑點(diǎn)積累產(chǎn)物面積增大，且色度加深，其中湖桑32和九龍拐的的藍(lán)色斑點(diǎn)產(chǎn)物比較少（圖2：d、h），云桑1號(hào)和充桑的次之（圖2：l、p），荷葉白1號(hào)和油桑的最多（圖2：t、x）。這表明隨著干旱脅迫的加劇湖桑32和九龍拐的自身防御機(jī)制比較強(qiáng)，抗旱能力比較好，云桑1號(hào)和充桑次之，荷葉白1號(hào)和油桑的抗旱能力較弱。

2.3 干旱脅迫下對(duì)超氧陰離子的葉片表皮細(xì)胞化學(xué)定位觀察

隨著干旱脅迫的加劇，超氧陰離子的藍(lán)色斑點(diǎn)積累產(chǎn)物主要集中在葉脈附近，斑點(diǎn)面積逐漸增大，葉脈茸毛中的超氧陰離子積累也隨之發(fā)生變化。在正常處理下，葉脈和細(xì)胞表面的藍(lán)色斑點(diǎn)積累產(chǎn)物較淡（圖3：a、e），其中抗旱性強(qiáng)的湖桑32葉脈茸毛較長(zhǎng)且呈透明狀，抗旱性弱的荷葉白1號(hào)葉脈茸毛較短（圖4：a、e）。在輕度處理下，葉脈中不同部位出現(xiàn)淡藍(lán)色斑點(diǎn)積累產(chǎn)物，葉脈茸毛末端部位有淡藍(lán)色的產(chǎn)物積累，表明超氧陰離子的積累相對(duì)比較少（圖3：b、f，圖4：b、f）。在中度處理下，葉脈部位的藍(lán)色斑點(diǎn)積累產(chǎn)物加深，細(xì)胞表面茸毛周圍的超氧陰離子逐漸增多，而葉脈茸毛中的超氧陰離子藍(lán)色斑點(diǎn)積累達(dá)到最大（圖3：c、g，圖4：c、g）。在重度處理下，細(xì)胞表面的超氧陰離子的積累產(chǎn)物面積增大，其中湖桑32在細(xì)胞表面及茸毛部位中的藍(lán)色斑點(diǎn)面積區(qū)域增大且茸毛部位尖端呈透明狀（圖3：d，圖4：d）；而荷葉白1號(hào)超氧陰離子的藍(lán)色斑點(diǎn)面積顏色較深、茸毛數(shù)量多顏色比較深（圖3：h，圖4：h），這表明抗旱性強(qiáng)的品種湖桑32超氧陰離子的清除能力比較強(qiáng)，荷葉白1號(hào)比較弱。

3討論

3.1 干旱脅迫下超氧化物歧化酶的活性變化

夏慧莉等（1999）研究表明，細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。通常細(xì)胞內(nèi)有一系列有效的抗氧化防御機(jī)制，包括清除ROS的SOD、CAT、POD等，其中，SOD 是抵御活性氧自由基介導(dǎo)的氧化損傷的第一道防線，是抗氧化酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，SOD 能以O(shè)-2·為基質(zhì)進(jìn)行歧化反應(yīng)（任永波等，2001）。隨著干旱脅迫的加劇，一旦活性氧水平超出一定域值，自由基產(chǎn)生與清除間的平衡失調(diào)，就會(huì)導(dǎo)致 SOD 酶活性的降低（林永英2002）。在本研究中，隨著干旱脅迫的加劇，SOD 活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，超氧陰離子一直呈加重的趨勢(shì)，6種桑樹(shù)SOD 活性變化與張旭穎等（2010）和陳珺（2013）的測(cè)定結(jié)果一致。SOD 的含量在中度脅迫下達(dá)到最大，說(shuō)明SOD發(fā)揮著積極的作用。在中度脅迫之后SOD 的活性與活性氧的水平表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，原因可能是在重度處理下活性氧達(dá)到最大值，超出一定域值，從而導(dǎo)致抗氧化酶活性的降低。

3.2 超氧陰離子在細(xì)胞中的分布規(guī)律

葉脈系統(tǒng)是葉片里重要的水分輸導(dǎo)系統(tǒng)，也是運(yùn)輸養(yǎng)分和光合產(chǎn)物的通道。葉脈密度和葉脈直徑等， 共同決定著葉脈系統(tǒng)的水力導(dǎo)度（Sack et al，2013）。隨著干旱脅迫加劇，超氧陰離子藍(lán)色斑點(diǎn)積累產(chǎn)物最先出現(xiàn)在葉脈中，并且面積區(qū)域逐漸增大，其可能原因是土壤水分缺失，葉片中葉脈區(qū)域最先表現(xiàn)出超氧陰離子的積累，這與葉脈的疏導(dǎo)性存在一定的關(guān)系。段喜華等（2003）認(rèn)為，葉片表皮毛數(shù)量較多，可以減少空氣流對(duì)氣孔的影響，也減少葉表蒸騰，因此，葉表皮茸毛在一定程度上反映植物的抗旱能力和抗逆特性。趙述文等（1991）通過(guò)大豆不同抗旱性品種葉片電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)抗旱性強(qiáng)的品種葉片茸毛粗而長(zhǎng)，茸毛基部膨大，抗旱性弱的品種茸毛細(xì)而短，上面的刺狀突起不明顯。該研究通過(guò)電鏡觀察及O-2·的葉片、葉脈表皮細(xì)胞化學(xué)定位觀察，研究結(jié)果表明茸毛部位的超氧陰離子積累由基部向端部擴(kuò)散，抗旱性強(qiáng)的品種湖桑32葉細(xì)胞表面茸毛比較長(zhǎng)且端部比較尖。隨著干旱脅迫的加劇，在重度處理下，湖桑32葉脈中超氧陰離子積累藍(lán)色斑點(diǎn)產(chǎn)物顏色變淺，在茸毛的細(xì)胞基部和端部呈透明狀、中部顏色加深，這表明湖桑32的氧自由基的清除能力比較強(qiáng)。而抗旱性弱的品種荷葉白1號(hào)，葉脈表面茸毛比較短，超氧陰離子積累藍(lán)色斑點(diǎn)產(chǎn)物顏色并未發(fā)生明顯變化。推測(cè)隨著干旱脅迫的加劇，細(xì)胞表面茸毛越長(zhǎng)能夠減少葉表蒸騰，同時(shí)對(duì)超氧陰離子的清除能力比較強(qiáng)，從而表現(xiàn)出較好的抗旱性。

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