寧夏不同地區(qū)靈武長棗果實多糖的單糖成分分析

柴雅紅 章英才

摘要： 以寧夏4個不同地區(qū)（靈武、中寧、青銅峽、銀川）成熟期的靈武長棗果實為研究對象，經水提醇沉法提取，采用DEAEcellulose52和HW55S分離純化，并利用GCMS法進行多糖的單糖組成分析。結果表明：多糖提取率最高的是靈武地區(qū)，達到1.795%；分離純化后，4個地區(qū)的長棗多糖各得到1個中性（Ju0）和3個酸性組分（Ju1、Ju2、Ju3），其中Ju2含量最高；GCMS分析可知靈武長棗多糖含有阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸10種單糖，不含果糖，以阿拉伯糖、核糖、半乳糖和2種糖醛酸為主，木糖含量最低。各地區(qū)多糖的單糖組成、含量各不相同，從各組分來看，四個地區(qū)多糖的Ju0和Ju1組分組成均以阿拉伯糖、核糖、半乳糖為主，四個地區(qū)多糖的組成差異主要在于Ju2和Ju3組分。從各地區(qū)單糖總量來看，靈武地區(qū)是阿拉伯糖含量最高，中寧、青銅峽、銀川地區(qū)以葡萄糖醛酸含量為最高。

關鍵詞： 靈武長棗， 多糖， 提取， 分離純化， 單糖組成

中圖分類號： Q946.3文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）09118708

Abstract： Fruits of Ziziphus jujube cv. Lingwuchangzao at mature stage from different areas in Ningxia（Lingwu， Yinchuan， Zhongning， Qingtongxia） were used as the experimental materials. The water extraction and alcohol precipitation method were adopted to obtain polysaccharide， which was subsequently purified by DEAE52 cellulose column and HW55S gel column. Finally gas chromatographymass spectrography（GCMS） was used to analyze the monosaccharide composition from purifed polysaccharides. The results showed that the crude polysaccharides from Lingwu had the highest yield， 1.795%. After purifed， all polysaccharides were fractioned respectively to one neutral fraction，Ju0， and three acid fractions，Ju1， Ju2， Ju3，and Ju2 had the highest contents. This indicated that the main components of polysaccharides in Z. jujube cv. Lingwuchangzao were acid fractions. The results from GCMS showed that Z. jujube cv. Lingwuchangzao were composed of arabinose， rhamnose， ribose， fucose， xylose， mannose， galactose， glucose， glucuronic acid and galacturonic acid， but monosaccharide contents were different among different fractions. Arabinose， ribose， galactose， glucuronic acid and galacturonic acid were the main components， and the content of xylose was the lowest. Both Ju0 and Ju1 were mainly composed by arabinose， ribose， galactose， while Ju2 and Ju3 exist obvious differences between four areas. According to the comparision of the total contents of monosaccharides， the content of arabinose in polysaccharides from Lingwu reached the highest， accounting for 28.6% of the total contents of monosaccharides， but other areas only accounted for 13%-18.9%. Meanwhile， glucuronic acid reached 21%-26.5% in polysaccharides from other three areas， but it was only 2.6% in polysaccharides from Lingwu. This indicates that the key difference in monosaccharide composition of polysaccharides from different areas lies in the content of arabinose and glucuronic acid. The advantages of polysaccharides in Z. jujube cv. Lingwuchangzao from Lingwu mainly are high content of arabinose and low content of glucuronic acid， which is likely to be one of key factors of the difference in fruit quality. This study will provide basis and scientific support for further of development and utlization of the fruits of Z. jujube cv. Lingwuchangzao.

Key words： Ziziphus jujube cv. Lingwuchangzao， polysaccharides， extraction， purification， monosaccharide compositions

靈武長棗（Ziziphus jujube cv. Lingwuchangzao），屬鼠李科棗屬植物，為寧夏回族自治區(qū)特有的優(yōu)質鮮食棗品種，已有800多年的栽種歷史，其果實以個大、色紅、風味酸甜適中、營養(yǎng)豐富而馳名（喻菊芳等，2004）。靈武長棗不僅是滋補佳品，也是傳統(tǒng)中藥，具有補中益氣，養(yǎng)血安神的功效（茍茜等，2014）。棗多糖是靈武長棗中具有重要生物功能的有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、提高機體免疫力等功能（姜曉燕等，2009； 顏小捷等，2012； Wang et al， 2010； 丁玉松等，2010），而多糖糖鏈的一級結構與其活性密切相關，一級結構的研究主要體現在組成多糖的單糖種類及各單糖的組成比例。靈武長棗果實所積累糖的含量、種類及比率的不同是果實品質差異的重要因素，果實多糖的單糖成分不僅決定著果實甜度和風味，而且是其他品質成分和風味物質合成的基礎原料，對果實品質起關鍵性作用（Teixeira et al ，2005；章英才等，2014）。因此，弄清多糖的單糖組成對控制多糖質量標準及研究棗多糖活性也具有重要意義。

目前，靈武長棗以靈武市為主栽區(qū)，種植面積達0.9萬hm2，中寧、青銅峽、銀川等周邊地區(qū)也有栽種，但其外觀、品質因產地、環(huán)境條件不同而呈現一定差異。隨著營養(yǎng)價值、藥用價值逐漸被人們認識，市場需求逐年加大，出現了長棗果實品質參差不齊，靈武長棗果實風味變淡，口感變差，已嚴重危及到靈武長棗的產業(yè)發(fā)展（張曉波，2014）。這很可能與各個產地具有品質差異的果實相繼涌入市場有關。因此，明確靈武地區(qū)長棗品質的產地優(yōu)勢，以及不同產地間品質差異的關鍵顯得尤為重要，從而為控制提高其多糖質量標準，調整優(yōu)化種植結構提供技術支撐。近年來，靈武長棗在栽培管理（萬仲武等，2013）、品種選育（喻菊芳等，2008）、生理生化（魏天軍等，2008）等方面已有研究，但其多糖的研究目前僅限于多糖的提取、含量測定及變化規(guī)律（楊軍等，2011）等方面，而有關靈武長棗多糖的組成、不同產地長棗主要有效成分比較方面尚缺乏系統(tǒng)研究。

本研究選擇寧夏靈武及其周邊3個主要棗產區(qū)（中寧、青銅峽、銀川）的靈武長棗果實作為材料，采用水提醇沉法提取粗多糖，經DEAE52纖維素柱、HW55S凝膠柱分離與純化，用GCMS法對于純化后的精多糖進行單糖組成和含量方面的分析比較，旨在為寧夏不同地區(qū)靈武長棗多糖的開發(fā)利用及產業(yè)發(fā)展提供科學依據。

1材料與方法

1.1 材料

以寧夏靈武、中寧、青銅峽、銀川的成熟期的“普通型”靈武長棗果實為供試材料，經45 ℃烘干至恒重，用粉碎機完全粉碎后過篩備用。

1.2 儀器與試劑

DEAE52纖維素柱（Φ 2.6 cm × 40 cm）（上海琪特儀器有限公司）、HW 55S凝膠柱（Φ 1.6 cm × 50 cm）（上海琪特儀器有限公司）、SBSZ100數控計滴自動部份收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）、YZ1515X恒流泵（保定蘭格恒流泵有限公司）、722N可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）、QP2010氣相色譜-質譜聯用儀（日本島津）。

DEAE52纖維素填料（Whatman）、TOYOPEARL HW55S凝膠樹脂填料（日本TOSOH）。標準單糖：葡萄糖（99.5%）、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、甘露糖（均>99%）購自北京拜爾迪公司；核糖（99.6%），巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸（>99%）購自國家標準物質網；鼠李糖、木糖（均>98%）購自北京化學試劑公司。六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷為色譜純，其余試劑均為分析純。本研究所用水均為超純水。

1.3 方法

1.3.1 靈武長棗粗多糖的提取 參照何進等（1995）的方法，略有改動。具體步驟：精確稱取15 g棗粉置于濾紙筒，放于加入100 mL石油醚的索氏提取器中，80 ℃回流脫脂8 h；過濾后的殘渣置于80%乙醇的普通回流裝置中85 ℃回流2次，每次75 mL，每次2 h，脫去小分子糖；過濾后的殘渣再用沸水提取3次，50 mL每次，t1=1.5 h，t2=1 h，t3=1 h，離心后合并上清液經40 ℃真空濃縮約為40 mL；濃縮液與1/4體積的Sevag 試劑混合，震蕩混合，靜置，分出氯仿層，除去蛋白質，此步驟重復多次；除蛋白后的濃縮液加入4倍體積無水乙醇進行醇沉，使多糖濃度達到80%，置于4 ℃冰箱靜置過夜，濾紙過濾沉淀后的濾渣依次用50 mL 95%的乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，最后在50 ℃鼓風恒溫箱里干燥得到粗多糖。

1.3.2 靈武長棗多糖的分級純化DEAECellulose（OH-）色譜柱分級：取粗多糖60 mg溶于超純水，配成濃度為6 mg·mL1的多糖溶液，過濾后，加樣至已裝好的DEAE52纖維素柱（有效柱長35 cm），梯度洗脫法洗脫各級分，洗脫液分別為超純水、0.1 mol·L1 、0.2 mol·L1 、0.3 mol·L1 NaCl，流速1 mL·L1，自動部分收集器自動收集洗脫液，5 mL每管，每管5 min，硫酸-苯酚法跟蹤檢測，490 nm下檢測吸光度，以洗脫管數為橫坐標，吸光值為縱坐標，作DEAECellulose（OH-）色譜柱洗脫曲線。分別合并各主峰收集管液，采用旋轉蒸發(fā)儀45 ℃真空濃縮，超純水下流水透析48 h，靜置透析24 h（選擇截留相對分子質量為3 500透析袋），每4 h更換一次超純水，收集透析袋內的多糖溶液，真空濃縮，冷凍干燥，得到各多糖級分。

TOYOPEARL HW55S色譜柱純化：將上述冷凍干燥的各多糖級分分別溶于2 mL超純水中。加樣至HW55S色譜柱（有效柱長42 cm），0.2 mol·L1Nacl洗脫，流速為0.5 mol·min1，4 mL每管，硫酸-苯酚法檢測，以洗脫管數為橫坐標，吸光值為縱坐標，作洗脫曲線。收集、透析、濃縮，冷凍干燥，得各精制多糖。

1.3.3 靈武長棗果實精制多糖的組成分析在參照林勤保等（2009）的方法基礎上，進行了實驗條件摸索和改進。

1.3.3.1 果實精制多糖的水解精確稱取果實精制多糖4 mg于反應釜中，加入0.4 mL 2 mol·L1的三氟乙酸（TFA），置于烘箱內110 ℃水解3 h，冷卻至室溫，放入真空干燥箱中70 ℃減壓干燥。

1.3.3.2 果實精制多糖的衍生將水解干燥后的靈武長棗果實精制多糖加入0.4 mL吡啶，迅速加入0.08 mL三甲基氯硅烷和0.16 mL六甲基二硅胺烷，注意操作要迅速，防止空氣中水分的進入。振蕩待其充分溶解后，于50 ℃恒溫干燥箱中反應40 min，冷卻至室溫，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，濾液3 000 r·min1離心10 min，取上清液稀釋1.5倍后進行氣相色譜-質譜聯用測定。

1.3.3.3 GCMS檢測條件氣相色譜條件：色譜柱為DB5MS（3 m × 0.25 mm × 0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，載氣為氦氣，柱壓73.0 kPa，柱流量1.00 mL·min1，分流比50∶1，程序升溫從100 ℃保持2 min，以10 ℃·min1升至260 ℃，保留10 min；進樣量為0.1 μL。質譜條件：離子源溫度200 ℃，M/Z范圍為35～800。

1.3.3.4 標準曲線的制作取各標準單糖，衍生后進行GCMS測定，方法同1.3.3.2，1.3.3.3。

1.3.3.5 果實精制多糖中單糖組成的定性與定量通過NIST譜庫及各標準單糖標品的比對，根據峰面積采用外標法進行定量分析， 根據各單糖的回歸方程計算出多糖中單糖的含量，保證定性、定量分析的準確性。

外標法定量計算公式： W=C × V

式中，W為單糖質量，C為帶入標準曲線求得的單糖濃度，V為稀釋后體積

2結果與分析

2.1 多糖的提取結果

經過上述方法提取的干燥粗多糖，靈武、銀川、中寧、青銅峽地區(qū)的粗多糖得率分別為1.795%，0.635%，0.618%，0.596%；多糖含量分別為63%，49.14%，47.15%，40.46%。

2.2 分級純化結果

靈武長棗果實粗多糖分別經DEAE纖維素柱層析后，分離得1個中性組分級分Ju0和3個酸性組分Ju1、Ju2、Ju3。經多糖含量計算發(fā)現，多糖含量均因組分不同而差異較大，在不同地區(qū)果實精制多糖中酸性多糖含量均高于中性多糖含量，尤其是Ju2含量豐富。將各組分分別經HW55凝膠柱純化后，得到單一對稱的洗脫峰，說明HW柱對多糖純化效果理想。經分離純化后得靈武、銀川、中寧、青銅峽精制多糖得率分別為0.193%，0.131%，0.136%，0.129%，靈武地區(qū)精制多糖得率最高。

2.3 GCMS分析結果

各單糖標準品經衍生后，在檢測條件下測得各標品衍生物的總離子流圖，如圖1所示。

根據GCMS得出的總離子流圖，經分析計算得出，不同地區(qū)各組分單糖組成及其含量如表2所示。

由表2可知，總體上，各地區(qū)靈武長棗多糖均含有阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸這10種單糖，不含果糖，主要以阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、糖醛酸為主，木糖含量最低。針對不同組分：Ju0中，均不含木糖，均以阿拉伯糖>核糖>半乳糖為主。Ju1中，也以阿拉伯糖、核糖、半乳糖為主。Ju2中，差別較大，靈武地區(qū)以阿拉伯糖>半乳糖為主；銀川以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>核糖>阿拉伯糖為主；中寧以半乳糖醛酸>鼠李糖>阿拉伯糖為主；青銅峽以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>半乳糖>鼠李糖>阿拉伯糖為主。Ju3中，靈武以阿拉伯糖>鼠李糖為主，銀川以葡萄糖醛酸>阿拉伯糖>鼠李糖為主；中寧以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>阿拉伯糖>鼠李糖；青銅峽以葡萄糖醛酸>鼠李糖為主。

從各組分單糖總量來看，所有中性組分Ju0均是阿拉伯糖含量最高。靈武地區(qū)酸性組分均阿拉伯糖含量最高，其含有的葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量明顯小于其他三個地區(qū)，且僅在Ju1組分出現；銀川、中寧、青銅峽地區(qū)：在含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的酸性組分中，均是葡萄糖醛酸含量最高；在不含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的酸性組分中，仍是阿拉伯糖含量最高。從各地區(qū)單糖總量來看，靈武以阿拉伯糖含量最高，達到總單糖含量的28.6%，其余地區(qū)為13%～18.9%；中寧、青銅峽、銀川地區(qū)為葡萄糖醛酸含量最高，達到21%～26.5%，而靈武僅占2.6%；其余多糖在不同地區(qū)間含量基本接近，木糖含量最低，僅占0.26%～0.47%。

靈武：單糖組成以阿拉伯糖>鼠李糖>半乳糖>核糖。銀川：以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>阿拉伯糖>鼠李糖>半乳糖。中寧：以葡萄糖醛酸>阿拉伯糖>半乳糖>核糖>鼠李糖>半乳糖醛酸。青銅峽：以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>半乳糖>阿拉伯糖>核糖>鼠李糖。

3討論與結論

本研究用熱水浸提法提取不同地區(qū)多糖，發(fā)現靈武地區(qū)粗多糖得率和含量為最高，分別為1.795%、63%，看來靈武長棗多糖的得率與含量關系密切；采用DEAE52纖維素層析柱對不同地區(qū)粗多糖進行分離純化，均得到1種中性多糖和3種酸性多糖，表明靈武長棗多糖的主要形式為酸性多糖，各地區(qū)均以酸性組分2得率最高；柳楊（2011）的研究結果表明靈武長棗各多糖組分分子量最大為1.60×105，最小為7.61×104，采用適用分離多糖分子量范圍為1 000～2×105的HW55S填料，得到的洗脫峰為對稱的單一峰，效果較好。本研究用GCMS分析單糖組成發(fā)現，總體上，各地區(qū)靈武長棗多糖均含有10種單糖，包括5種六碳糖（鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖），3種五碳糖（阿拉伯糖、木糖、核糖），2種糖醛酸（葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸），主要組成為阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、糖醛酸。四個地區(qū)的多糖組分差異主要在于Ju2和Ju3。從各地區(qū)單糖總量來看，靈武以阿拉伯糖含量最高，達到總單糖含量的28.6%，其余地區(qū)為13%～18.9%，而阿拉伯糖是纖維、半纖維的合成單位，這可能與靈武地區(qū)長棗中較高的粗纖維含量有關（茍茜等，2014）說明靈武地區(qū)生長的靈武長棗比其他地區(qū)棗果實更適合作為膳食纖維的來源。中寧、青銅峽、銀川地區(qū)為葡萄糖醛酸含量最高，達到21%～26.5%，而靈武僅占2.6%，說明不同產地長棗多糖的組成單糖的差異主要在于阿拉伯糖和葡萄糖醛酸含量的高低，靈武地區(qū)靈武長棗多糖的優(yōu)勢主要在于含量較高的阿拉伯糖和較低的葡萄糖醛酸，這可能是影響品質差異與活性的關鍵因素之一，希望在以后的研究中能明確影響阿拉伯糖、葡萄糖醛酸積累的關鍵因素，進而調控品質差異。王東營（2013）研究了灘棗多糖，發(fā)現灘棗多糖由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸10單糖組成，且阿拉伯糖含量最高，與本實驗研究結果基本接近，但林勤保等（1998）用HPLC測得大棗中性多糖由L阿拉伯糖、D葡萄糖和D半乳糖組成，酸性多糖由L阿拉伯糖、L鼠李糖、D甘露糖、D半乳糖和D半乳糖醛酸組成，石浩等（2015）發(fā)現糖棗中木糖醇、葡萄糖、半乳糖所含比例較高，趙智慧等（2010）發(fā)現金絲小棗主要組成分為半乳糖醛酸，這與本研究結果有差異，這可能與棗種類不同、產地不同、多糖提取方法不同，成分分析手段不同等有關。

一般多糖組成分析的方法主要有高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）及氣相色譜—質譜聯用（GCMS）、液相色譜—質譜聯用（HPLCMS）法。HPLC、GC是較常用的分析方法，但無法完成未知組分的定性，只能根據標準品一一對照，GCMS綜合了氣相色譜靈敏度高、分析速度快和質譜鑒別能力強的優(yōu)點，可同時完成待測組分的分離和鑒定，特別適用于多組分混合物未知組分的定性和定量分析，且靈敏度很高（張艷華，2013），HPLCMS目前在植物多糖分析上應用較少，實驗條件及設備尚不成熟。而本研究中靈武長棗多糖的單糖組分未知，因此選用GCMS法定性及定量，但多糖為大分子物質，不能直接揮發(fā)，因而須將多糖降解為結構單糖，并且將其衍生成易揮發(fā)，對熱穩(wěn)定的衍生物（葉林等，2010）。因此，本研究應用三氟乙酸水解多糖，甲基硅烷化衍生后進行GCMS分析多糖中單糖組成。該衍生化法操作簡單、反應迅速，所得衍生物揮發(fā)性好，但是較易產生異構峰，給定性定量帶來困難。本研究中以標準單糖衍生物的出峰時間和樣品單糖衍生物的出峰時間相對照，并結合NIST譜庫對照進行定性定量分析，使結果更加準確。本研究為棗多糖組成GCMS分析提供了快速、有效的檢測條件與手段。

本研究首次闡明該種植物單糖組成情況，靈武長棗以阿拉伯糖和葡萄糖醛酸含量最為豐富，而阿拉伯糖，作為低熱量糖，具有抑制蔗糖吸收作用，能抑制因蔗糖攝入而導致的血糖升高、抑制肥胖，預防治療與血糖升高有關的疾病（秦海敏等，2006）；葡萄糖醛酸能與肝臟中有毒物質結合，起解毒作用（Sherlock，1962），說明靈武長棗具有作為功能產品開發(fā)與加工的潛力。本研究比較了在寧夏不同地區(qū)間果實多糖差異，造成多糖組成與品質差異的原因，可能與土壤、水分等生長環(huán)境因素有關，因寧夏地區(qū)間土壤差異較大，呈現較大的不均衡性（王吉智，1990）。這將在以后的研究中繼續(xù)探討，不同地區(qū)靈武長棗多糖的比較，可為靈武長棗的品質評價、開發(fā)利用及產業(yè)發(fā)展提供一定參考。

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