血中mRNA與HBV慢加急肝衰竭預(yù)后的相關(guān)性研究

馬大鵬+吳鋒+梁恩富

【摘要】 目的 探討乙型肝炎病毒（HBV）慢加急肝衰竭（ACLF）患者血中mRNA表達(dá)及意義。方法 選取20例HBV所致ACLF患者作為肝衰竭組， 20例健康體檢者作為對照組， 分析比較兩組臨床相關(guān)指標(biāo)[谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-GT）、凝血酶原活動度（PTA）、總膽紅素（TBIL）、肌酐（Cr）、白細(xì)胞計數(shù)（WBC）]， 并分析HBV-ACLF患者三種微小RNA（mRNA）和臨床指標(biāo)[ALT、AST、白蛋白（ALB）、乙肝病毒的脫氧核糖核酸（HBV-DNA）、生存時間、PTA、凝血酶原時間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）、血小板（PLT）、TBIL、直接膽紅素（DBIL）、乙肝核心抗體（HBcAb）]的關(guān)系。結(jié)果 肝衰竭組患者的ALT、AST、PTA、TBIL、Cr、WBC分別為（156.41±214.08）U/L、（232.59±314.12）U/L、

（21.46±8.97）%、（324.60±164.76）μmol/L、（125.61±101.20）μmol/L、（8.12±5.29）×109/L， 與對照組的（26.67±

30.02）U/L、（24.22±7.60）U/L、（114.00±11.31）%、（12.83±3.25）μmol/L、（61.11±12.84）μmol/L、（5.14±

1.74）×109/L比較， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HBV-ACLF患者mRNA 150-5P與ALT、AST、PLT、TBIL、DBIL中度相關(guān)， 與生存時間高度相關(guān)；mRNA 146a-5P與ALT高度相關(guān)， 與AST、PTA、PLT、TBIL中度相關(guān)；mRNA 29a-3P與生存時間、PLT 、TBIL中度相關(guān)。結(jié)論 肝病病情越重， mRNA 146a-5P和mRNA 150-5P水平越低， mRNA 146a-5P和mRNA 150-5P對HBV-ACLF患者的預(yù)后評估有著重要意義， 可以作為肝衰竭新的預(yù)后判斷指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；芯片；慢加急性肝衰竭

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.11.031

慢加急性肝衰竭（acute on chronic liver failure， ACLF）具有起病急、并發(fā)癥多、預(yù)后差的特點， 雖然近幾年提倡的多學(xué)科重癥監(jiān)護治療及人工肝治療均在很大程度上提高了生存率， 但是ACLF的病死率仍然很高， 30%～50%患者會出現(xiàn)肝臟相關(guān)并發(fā)癥， 大多數(shù)患者最終因多器官功能衰竭而死亡， 未經(jīng)治療的ACLF患者死亡率可達(dá)75%。因此對于ACLF的早診斷及早治療是需要解決的難題[1]。mRNA是一類存在于真核生物中， 其大小長約18～25個核苷酸， 具有多種調(diào)控功能的非編碼RNA， 越來越多的研究表明mRNA在肝臟的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色[2]。為研究HBV導(dǎo)致的慢加急性肝衰竭外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells， PBMC）中mRNA的表達(dá)情況， 作者利用人類mRNA OneArray芯片找出表達(dá)水平明顯改變的mRNA ， 以期探究mRNA在HBV導(dǎo)致的慢加急性肝衰竭中表達(dá)情況， 并初步分析其臨床意義及應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2014年8月～2016年8月大連市第六人民醫(yī)院20例HBV所致ACLF患者作為肝衰竭組， 診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會《肝衰竭診治指南（2012年版》[2]診療標(biāo)準(zhǔn)。肝衰竭組中男8例， 女12例， 平均年齡（45.07±8.14）歲。另選20例健康體檢者作為對照組， 男11例， 女9例， 平均年齡（33.30±8.34）歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 實驗方法 以Trizol法（淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物科技有限公司， RNAiso Plus 購自TaKaRa公司）提取外周血RNA ， 通過熒光實時定量RT-PCR檢測方法（反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR引物由上海卓立技術(shù)科技公司合成）[3]， 分別檢測兩組的篩選mRNA定量。美國Beckman全自動生物化學(xué)分析儀檢測生物化學(xué)指標(biāo)， 采用STA-revolution（全自動血凝儀）及配套試劑盒檢測凝血功能。分析比較兩組患者的臨床相關(guān)指標(biāo)（ALT、AST、γ-GT、PTA、TBIL、Cr、WBC）， 并分析HBV-ACLF患者三種mRNA和臨床指標(biāo)（ALT、AST、ALB、HBV-DNA、生存時間、PTA、INR、PLT、TBIL、DBIL、HBcAb）的關(guān)系。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson分析， Pearson相關(guān)系數(shù)的絕對值 （|r|）>0.8 為高度相關(guān)， |r|>0.5為中度相關(guān)， |r|>0.3為低度相關(guān)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 兩組的臨床相關(guān)指標(biāo)比較 肝衰竭組患者的ALT、AST、PTA、TBIL、Cr、WBC水平與對照組比較， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；肝衰竭組患者的γ-GT與對照組比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2. 2 HBV-ACLF患者三種mRNA和臨床指標(biāo)的相關(guān)系分析 HBV-ACLF患者mRNA 150-5P與ALT、AST、PLT、TBIL、DBIL中度相關(guān)， 與生存時間高度相關(guān)；mRNA 146a-5P與ALT高度相關(guān)， 與AST、PTA、PLT、TBIL中度相關(guān)；mRNA 29a-3P與生存時間、PLT 、TBIL中度相關(guān)。見表2。

3 討論

目前臨床治療ACLF仍存在很多阻礙， 雖然多學(xué)科重癥監(jiān)護治療及人工肝治療等方法在治療過程中取得了一定成績， 但治療效果仍有待提高[4]。近年來研究表明mRNA在肝臟的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色， 本次實驗就是探究mRNA是否可以成為HBV導(dǎo)致的ACLF診斷預(yù)測新的標(biāo)志物， 另外mRNA在HBV導(dǎo)致的ACLF是否參與炎癥反應(yīng)來影響疾病的進(jìn)展。寧琴等[5]發(fā)現(xiàn)miR-146a敲除小鼠因超活化NF-κB會出現(xiàn)的超感染等炎癥狀態(tài)， 考慮其機制可能為miR-146a在NF-κB的驅(qū)使下是TLR信號通路及維甲酸誘導(dǎo)基因的負(fù)調(diào)節(jié)基因， 在巨噬細(xì)胞或者小腸上皮細(xì)胞中， miR-146a與其上游的主要組件， 包括IRAK1， IRAK2以及TNFR相關(guān)因子靶向結(jié)合[6]。本研究發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF患者血清中mRNA 146a-5P的水平明顯下降， 與 ALT、AST明顯相關(guān)， 證明了mRNA 146a-5P確實參與炎癥反應(yīng)， 與文獻(xiàn)[7]研究結(jié)果相符。miR-150則在組織缺氧情況下， 由缺氧誘導(dǎo)因子-1通過負(fù)性調(diào)節(jié)下調(diào)miR-150的表達(dá)， 其下游靶點血管內(nèi)皮生長因子A（VEGA）mRNA及蛋白質(zhì)增加， 促進(jìn)肝再生。由此說明mRNA能夠調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡， 參與肝再生過程， 在肝衰竭進(jìn)展中起重要作用， 可能作為肝衰竭預(yù)后的潛在標(biāo)志物。黃朝興等[8]發(fā)現(xiàn)重型肝炎患者的mRNA 150-5P的表達(dá)是下調(diào)的， 本次實驗mRNA 150-5P在肝衰竭組的表達(dá)較正常下調(diào)， 與其他相關(guān)報道相符。

綜上所述， 肝病病情越重， mRNA 146a-5P和mRNA 150-5P水平越低， mRNA 146a-5P和mRNA 150-5P對HBV-ACLF患者的預(yù)后評估有著重要意義， 可以作為肝衰竭新的預(yù)后判斷指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

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[7] 陳莉， 譚德明， 胡志亮， 等. 重型肝炎患者外周血單個核細(xì)胞中微小RNA表達(dá)的分析. 中華肝臟病雜志， 2011， 19（7）：556-558.

[8] 黃朝興， 呂吟秋， 李凡凡， 等. 乙肝病毒血癥與原發(fā)性腎炎患者腎組織內(nèi)乙肝抗原沉積的相關(guān)性研究. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志， 2001， 2（9）：526-528.

[收稿日期：2017-02-28]