1型糖尿病大鼠左心室HCN4表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究

摘 要： 目的探討4型超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道在1型糖尿病大鼠左心室的表達(dá).方法腹腔注射鏈脲佐菌素溶液建立1型糖尿病大鼠模型，通過免疫熒光染色和免疫印記觀察HCN4在左心室的表達(dá).結(jié)果免疫熒光染色HCN4在大鼠左心室未見表達(dá)，免疫印記顯示糖尿病大鼠左心室HCN4在蛋白質(zhì)水平升高（P<0.05）.結(jié)論正常大鼠左心室表達(dá)HCN4，T1DM左心室HCN4表達(dá)升高，導(dǎo)致糖尿病心室電重構(gòu)可能與室性心律失常發(fā)生有關(guān)。

關(guān)鍵詞：1 型糖尿病 HCN4 左心室

中圖分類號：R587 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1003-9082（2016）12-0257-01

心臟起搏細(xì)胞反復(fù)除極的離子基礎(chǔ)是超級化電流（If），If作為心肌舒張期去極化的主要決定因素在細(xì)胞自律性的產(chǎn)生過程中起著重要作用.其形成的分子基礎(chǔ)是編碼超極化激活的環(huán)化核苷酸門控通道（HCN）基因家族，該家族包括HCN1-4四種亞型，心室肌主要表達(dá)HCN2，少量表達(dá)HCN4.HCN4是控制心率的主要因素.1型糖尿病引發(fā)的糖尿病心肌病其發(fā)病機(jī)制不明，本實(shí)驗(yàn)通過T1DM模型觀察左心室HCN4在蛋白質(zhì)水平變化，為探討1型糖尿病的常見并發(fā)癥如室性心律失常的發(fā)生提供更多理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料 成年健康雄性SD大鼠60只體重（170±20）g.兔多克隆抗HCN4抗體（Alomone公司）、TR標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（Santa cruz 公司）、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）

2.方法 1.2.1模型制作：動物隨機(jī)分兩組即對照組（20只）和實(shí)驗(yàn)組（40只）.兩組大鼠普通飲食喂養(yǎng)1w后禁食12h，對照組大鼠腹腔一次性注射不含STZ的檸檬鈉-檸檬酸緩沖液，實(shí)驗(yàn)組大鼠55mg/kg一次性腹腔注射STZ，3d后取尾靜脈血測空腹血糖，血糖≥16.7mmol/L者為糖尿病大鼠.模型成功后均持續(xù)喂養(yǎng)3m。1.2.2取材：麻醉后取左心室，部分（對照組10只實(shí)驗(yàn)組14只）液氮速凍用作冰凍切片；一部分（對照組10只實(shí)驗(yàn)組15只）液氮速凍用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。1.2.3免疫熒光染色：LeicaCM1850恒冷冰凍切片機(jī)中進(jìn)行切片厚度10um.一抗HCN4抗體（1：50），二抗TR標(biāo)記山羊抗兔IgG（1：300），熒光顯微鏡下觀察熒光的分布。1.2.4免疫印跡反應(yīng)（Western Blot）：兩組左心室組織提取蛋白質(zhì)進(jìn)行WB分析.兔抗大鼠HCN4（1：400）、兔抗大鼠β-Actin抗體（1：500）作為一抗，辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1：2000），ECL顯色.用凝膠成像分析儀采集圖像及ImageJ圖像處理軟件進(jìn)行吸光度分析

3.統(tǒng)計學(xué)分析 SPSS14軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)

二、結(jié)果

1.免疫熒光染色：左心室縱切面上兩組都未見HCN4的表達(dá)。2.2Western Blot：12w時，對照組檢測到HCN4蛋白質(zhì)弱表達(dá)，糖尿病組檢測到HCN4蛋白質(zhì)表達(dá)明顯升高，與對照組相比有顯著性差異（P<0.05） （表1、圖1和2）

A、B分別代表實(shí)驗(yàn)（DM）組和對照組

三、討論

HCN4是正常起搏電流產(chǎn)生的重要因素對基礎(chǔ)心率的維持起重要作用并能隨著機(jī)體的不同生理狀態(tài)對頻率進(jìn)行調(diào)整.研究證實(shí)HCN4通道的異常與某些心臟疾病有關(guān)[1]。在心衰或者心肌肥大的病人心室肌HCN4在mRNA和蛋白質(zhì)水平都增加，室性心律失常時HCN4表達(dá)亦上調(diào)[2]，我們推斷這可能是由If過度表達(dá)引起.在老年自發(fā)性高血壓大鼠模型中發(fā)現(xiàn)If表達(dá)增多，心室起搏電流是正常鼠的5倍同時HCN4的表達(dá)上調(diào)，用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療會顯著地降低If電流的最大電導(dǎo)，通過抑制If電流，可以減慢心.本實(shí)驗(yàn)中通過免疫熒光在心室肌上未見HCN4，Western blot顯示正常左心室HCN4 少量表達(dá)，1型糖尿病大鼠左心室HCN4表達(dá)明顯增高，與上述文獻(xiàn)報道的其他心臟疾病電重構(gòu)的變化一致[3]?？梢姴±砬闆r下HCN4通道在普通工作心肌中表達(dá)升高使其具有產(chǎn)生起搏電流的特性，這可能與心律失常發(fā)生有關(guān).深入研究病理情況下HCN4的變化對各種心律失常疾病有一定的預(yù)防和治療作用.

參考文獻(xiàn)

[1]Lin H，Xiao J，et al.Transcriptional control of pacemaker channel genes HCN2 and HCN4 by Sp1 and implications in reexpression of these genes in hypertrophied myocytes[J].CellPhysiol Biochemm，2009， 23（4-6）：317-26

[2]Wu X，Jiang X，et al.Expression of HCN4 protein in ventricular outflow tract of rabbit with idiopathic ventricular tachycardia[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2015，95（44）：3620-4

[3]王慶志，周立等.1型糖尿病大鼠左心室 HCN2和 HCN4重構(gòu)[J].中國臨床解剖學(xué)雜志，2011，29（3）：321-324

作者簡介：張麗（1981-）女，湖北潛江市，碩士，助教，心臟基礎(chǔ)研究。