兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記的實驗研究

鄧辰紅　王飛　王文蘭　朱華

【摘要】 目的 對兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法、鑒定及標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行初步研究。方法 采用貼壁法培養(yǎng)幼年兔骨髓細(xì)胞， 經(jīng)反復(fù)傳代細(xì)胞逐漸純化， 以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原。以5-溴脫氧尿嘧啶核苷 （BrdU）標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， 將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注入兔腦內(nèi)， 2周后取腦作石蠟切片， 進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果 通過貼壁法培養(yǎng)幼年兔骨髓細(xì)胞可獲得較純化的細(xì)胞， 并能在體外長期培養(yǎng)。CD31的陰性率為5.67%， CD34的陰性率為4.31%， CD45的陰性率為4.42%， CD44的陽性率為98.82%， CD71的陽性率為99.17%， CD90的陽性率為98.23%。提示CD31、CD34、CD45 的結(jié)果為呈陰性， CD44、CD71、 CD90的結(jié)果為陽性， BrdU能夠摻DNA合成期的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。結(jié)論 貼壁法可獲得高純度的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， BrdU可作為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)示蹤的理想標(biāo)記物。

【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；CD分子；5-溴脫氧尿嘧啶核苷

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.32.091

【Abstract】 Objective To briefly research culture， identification and mark of rabbit bone marrow stroma stem cells. Methods Bone marrow cells of young rabbits were cultured by adhesion method for purification by repeated passage， and cell surface antigen was detected by flow cytometry. Bone marrow stroma stem cells marked by 5-bromodeoxyuridine （BrdU） was injected into rabbit brain for immunofluorescent staining of brain paraffin section after 2 weeks. Results Bone marrow cells cultured by adhesion method provided purified cells suitable for long-term culture in vitro. CD31 had negative rate as 5.67%， CD34 had negative rate as 4.31%， CD45 had negative rate as 4.42%， CD44 had positive rate as 98.82%. CD71 had positive rate as 99.17%. CD90 had positive rate as 98.23%. CD31， CD34 and CD45 showed negative outcome， and CD44， CD71 and CD90 showed positive outcome. BrdU was suitable to be taken by bone marrow stroma stem cells in DNA synthesis. Conclusion Adhesion method provides bone marrow stroma stem cells with high purification， and BrdU can be used as ideal marker for in vivo tracking bone marrow stroma stem cells.

【Key words】 Bone marrow stroma stem cells； CD molecule； 5-bromodeoxyuridine

骨髓基質(zhì)細(xì)胞是一種不具有造血功能的細(xì)胞， 由于該細(xì)胞容易取材， 并且可以體外擴(kuò)增以及多向分化等優(yōu)點， 逐漸成為受到廣泛研究[1-4]。本文作者主要對兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定以及標(biāo)記作簡單探究。

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑 ①材料：本文選擇的研究對象為幼兔， 主要來源于內(nèi)蒙古實驗動物中心。②試劑：主要有Gibco生產(chǎn)的胎牛低血清糖DMEM， 由Serotec公司生產(chǎn)的CD71、CD31、CD45mAb， 由Sigma生產(chǎn)的MTT、BrdU， 由Biolegend公司生產(chǎn)的經(jīng)異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的CD45和CDmAb， 剩余試劑則由我國生產(chǎn)。

1. 2 方法

1. 2. 1 原代培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 將幼兔采用脫頸的方式將其處死， 在充分消毒以后取出兩側(cè)的股骨， 中斷股骨并反復(fù)用肝素生理鹽水進(jìn)行沖洗， 主要是將骨髓細(xì)胞沖出， 將沖出的骨髓細(xì)胞加入至容量為200 ml的LG-DMEM培養(yǎng)液中， 將其在室溫為37℃環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)， 培養(yǎng)2 d后更換一半培養(yǎng)液， 以后每隔1～2 d在更換一半的培養(yǎng)液， 等到7～8 d后便可以實現(xiàn)1次傳代[5-8]。

1. 2. 2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞鑒定 將經(jīng)上述步驟培養(yǎng)出的第六代并且已純化的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞消化， 在計數(shù)之后將其倒入離心管內(nèi)， 使用磷酸鹽緩沖液（PBS） 0.01 mol/L洗滌1次， 離心的時間控制在5 min， 離心的轉(zhuǎn)速為800 r/min， 離心成功后， 再將其加入至200 μl的PBS重懸細(xì)胞中， 加入FITC分別標(biāo)記出小兔的CD31、CD34、CD45、CD90、CD44、CD71， 在室溫為37℃以及無關(guān)的環(huán)境下反應(yīng)1 h， 待反應(yīng)結(jié)果后， 在使用聚甲醛40 g/L進(jìn)行固定， 最后檢測流式細(xì)胞數(shù)[9-12]。

1. 2. 3 BrdU標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外研究 選擇處于對數(shù)生長期的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞開展細(xì)胞爬片， 等到細(xì)胞生長到一半時加入BrdU， 待2 d后取出玻璃片用PBS 0.01 mol/L洗滌， 運用多聚甲醛固定好后開展免疫組化和免疫熒光染色， 最后封面進(jìn)行觀察。

1. 2. 4 BrdU標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)研究 在幼兔顱內(nèi)注射經(jīng)過BrdU標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， 3周后脫頸處死并取出腦， 在穿刺點附近開展石蠟切片后開展免疫熒光染色。具體步驟為：首先， 常規(guī)脫蠟至水， 分別用30 ml/L 過氧化氫（H2O2）、2 mol/L 氯化氫（HCl）、4 g/L的胃蛋白酶、10 g/L

牛血清白蛋白室溫封閉約10 min， 加入2 mol/L HCl， 室溫下孵育30 min， 再將4 g/L的胃蛋白酶室溫孵育30 min， 然后兔抗BrdUmAb（1∶100）在濕盒中孵育過夜， 溫度為4℃；然后將TRITC標(biāo)記抗兔免疫球蛋白G（IgG）（1∶100）在室溫下孵育40 min， 最后在用PBS和蒸餾水洗滌， 封片觀察[13-16]。選擇同一個組織切片隨機(jī)選擇6個不同的視野分別計算陽性率， BrdU標(biāo)記陽性率=6個不同的視野分別計算陽性率/6個視野細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2. 1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 在對小兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的初期， 能夠看見很多懸浮的細(xì)胞， 再培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)了一些形狀為紡錘形的貼壁細(xì)胞呈分散狀態(tài)， 在經(jīng)過數(shù)次更換培養(yǎng)液后， 貼壁上的細(xì)胞數(shù)量不斷減少直至消失， 4 d后可以發(fā)現(xiàn)貼壁的紡錘細(xì)胞數(shù)量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他細(xì)胞， 但是在經(jīng)過數(shù)次傳代培養(yǎng)以后， 混雜細(xì)胞逐漸純化， 細(xì)胞初期的以集落增長， 但是在第六代之后均為均勻分布的紡錘形。

2. 2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)， CD31的陰性率為5.67%， CD34的陰性率為4.31%， CD45的陰性率為4.42%， CD44的陽性率為98.82%， CD71的陽性率為99.17%， CD90的陽性率為98.23%。

2. 3 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)外標(biāo)記 將小兔的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞免疫組化以后， 結(jié)果可以觀察到呈棕色的陽性細(xì)胞分布， 選擇相同的組織片中6個視野不同進(jìn)行觀察， 并將陽性率計算出來， 然后再分別計算不同的標(biāo)本， 經(jīng)計算， BrdU標(biāo)記的細(xì)胞所占的比例為87.6%。在運用免疫熒光染色之后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核染色顯著， 但若將BrdU標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注入體內(nèi)， 3周以后依然可以看到明顯的BrdU著色， 并且在穿刺位置還發(fā)現(xiàn)密集的細(xì)胞。

3 討論

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞屬于一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞， 當(dāng)理化環(huán)境不同和受到細(xì)胞因素誘導(dǎo)時， 可以進(jìn)一步向成軟骨、成骨、脂肪以及纖維細(xì)胞系等[17-19]進(jìn)行多方向性擴(kuò)增和分離， 并且骨髓基質(zhì)干細(xì)胞還容易被外源基因感染， 因此當(dāng)前成為基因治療和組織工程的較理想的靶細(xì)胞。因此如何獲取并純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界研究的重大課題。分離和純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的基本原則為細(xì)胞的粘附性。當(dāng)前， 從骨髓中獲得基質(zhì)干細(xì)胞常采用兩種途徑[20]：①為梯度離心法獲得干細(xì)胞；②為全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)。

本研究通過貼壁法培養(yǎng)幼年兔骨髓細(xì)胞可獲得較純化的細(xì)胞， 并能在體外長期培養(yǎng)， 結(jié)果提示：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在對小兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的初期， 能夠看見很多懸浮的細(xì)胞， 再培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)了一些形狀為紡錘形的貼壁細(xì)胞呈分散狀態(tài)， 在經(jīng)過數(shù)次更換培養(yǎng)液后， 貼壁上的細(xì)胞數(shù)量不斷減少直至消失， 4 d后可以發(fā)現(xiàn)貼壁的紡錘細(xì)胞數(shù)量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他細(xì)胞， 但是在經(jīng)過數(shù)次傳代培養(yǎng)以后， 混雜細(xì)胞逐漸純化， 細(xì)胞初期的以集落增長， 但是在第六代之后均為均勻分布的紡錘形。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的鑒定：經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)， CD31的陰性率為5.67%， CD34的陰性率為4.31%， CD45的陰性率為4.42%， CD44的陽性率為98.82%， CD71的陽性率為99.17%， CD90的陽性率為98.23%。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)外標(biāo)記：將小兔的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞免疫組化以后， 結(jié)果可以觀察到呈棕色的陽性細(xì)胞分布， 選擇相同的組織片中6個視野不同進(jìn)行觀察， 并將陽性率計算出來， 然后再分別計算不同的標(biāo)本， 經(jīng)計算， BrdU標(biāo)記的細(xì)胞所占的比例為87.6%。在運用免疫熒光染色之后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核染色顯著， 但若將BrdU標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注入體內(nèi)， 3周以后依然可以看到明顯的BrdU著色， 并且在穿刺位置還發(fā)現(xiàn)了密集的細(xì)胞。

綜上所述， CD31、CD34、CD45 的結(jié)果為呈陰性， CD44、CD71、 CD90的結(jié)果為陽性。BrdU可摻DNA合成期的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， 由此得出貼壁法可獲得高純度的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， BrdU可作為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)示蹤的理想標(biāo)記物， 依此可以作為檢測骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的一個依據(jù)。

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[收稿日期：2016-10-22]