血清ADAMTSL—1蛋白檢測(cè)在慢性肝病中的臨床價(jià)值初探

朱喆　高國(guó)生　柯葉芳

[摘要] 目的 探討血清ADAMTSL-1蛋白檢測(cè)在慢性肝病中的臨床意義。 方法 收集2016年2～4月在寧波市第二醫(yī)院肝病中心就診的80例慢性肝病患者作為實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)Child-Pugh評(píng)分分為A級(jí)32例，B級(jí)30例，C級(jí)18例，另外選擇24例健康體檢者作為正常對(duì)照組。檢測(cè)各組人群血清中的ADAMTSL-1蛋白濃度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 慢性肝病患者的血清ADAMTSL-1蛋白濃度為10.93（9.43～16.36）ng/mL，顯著高于正常對(duì)照組的7.53（6.91～8.17）ng/mL（t=5.47，P<0.01）；慢性肝病患者血清ADAMTSL-1蛋白濃度隨著Child-Pugh評(píng)分的升高而增加（F=12.33，P<0.01）。 結(jié)論 血清ADAMTSL-1蛋白有可能成為反映慢性肝病患者肝臟儲(chǔ)備功能的新指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] ADAMTSL-1；ADAMTS家族；凝血酶敏感蛋白-1；慢性肝病；Child-Pugh評(píng)分

[中圖分類(lèi)號(hào)] R575 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）36-0128-04

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of serum ADAMTSL-1 in chronic liver disease. Methods 80 cases of patients with chronic liver disease admitted to Liver Disease Center in Ningbo No.2 Hospital from February to April 2016 were collected as the experimental group. There were 32 cases of grade A， 30 cases of grade B and 18 cases of grade C according to the Child-Pugh score. In addition， 24 healthy subjects were selected as normal control group. The serum concentration of ADAMTSL-1 protein in each group was detected and analyzed statistically. Results The serum ADAMTSL-1 protein concentration in patients with chronic liver disease was 10.93（9.43-16.36） ng/mL， which was significantly higher than 7.53（6.91-8.17） ng/mL in the control group（t=5.47， P<0.01）. The serum ADAMTSL-1 protein concentration increased with the Child-Pugh score in chronic liver disease patients（F=12.33， P<0.01）. Conclusion Serum ADAMTSL-1 protein may be a new indicator of hepatic reserve function in patients with chronic liver disease.

[Key words] ADAMTSL-1； ADAMTS family； Thrombin sensitive protein-1； Chronic liver diseases； Child-Pugh score

含凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）重復(fù)基序的解聚素樣金屬蛋白酶超家族（ADAMTS super family）包括19種不同的ADAMTS蛋白和至少7種ADAMTS-like（ADAMTSL）蛋白[1]。ADAMTSL除不具有金屬蛋白酶和解聚素樣結(jié)構(gòu)域外，含有其他ADAMTS的結(jié)構(gòu)域，包括TSP-1。ADAMTSL沒(méi)有蛋白酶活性，且功能未知，其中一些成員被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）的組成成分[2]。

ADAMTSL-1是該家族的首個(gè)成員，是一類(lèi)分泌性糖蛋白，因其在細(xì)胞外基質(zhì)的分布呈顆粒狀而被稱(chēng)為punctin-1[3]。ADAMTSL-1含有4個(gè)TSP-1，TSP-1與激活TGF-β關(guān)系密切[4]，而TGF-β又與肝病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5，6]，但目前尚無(wú)ADAMTSL-1是否參與肝病進(jìn)展的相關(guān)報(bào)道。本文以不同程度（Child-Pugh A、B、C）慢性肝病患者為研究對(duì)象，檢測(cè)血清中ADAMTSL-1蛋白濃度，探討血清ADAMTSL-1蛋白在慢性肝病中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

連續(xù)收集2016年2～4月在寧波市第二醫(yī)院肝病中心就診的各種原因所致的慢性肝病患者80例作為實(shí)驗(yàn)組，男50例，女30例，平均年齡（57.49±12.66）歲。所有患者診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)2000年制訂的《病毒性肝炎防治方案》，其中，慢性HBV感染者63例，慢性HCV感染者2例，酒精性肝炎/肝硬化9例，藥物性肝炎/肝硬化6例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診或可疑惡性腫瘤；（2）妊娠；（3）合并 HIV感染。根據(jù)入院時(shí)患者的肝性腦病情況、腹水的有無(wú)及其程度、血清總膽紅素、血清白蛋白和凝血酶原時(shí)間（PT）將肝臟儲(chǔ)備功能分為Child-Pugh A、B、C三級(jí)（5～6分為A級(jí)，7～9分為B級(jí)，10～15分為C級(jí)），其中A級(jí)32例，B級(jí)30例，C級(jí)18例。另選取24例無(wú)肝膽疾病的健康體檢者作為對(duì)照組，其中男16例，女8例，平均年齡（57.21±11.45）歲。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的性別和年齡具有可比性。本研究由寧波市第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè)方法

對(duì)所有患者和健康對(duì)照組采集5 mL全血標(biāo)本，1000 g離心15 min后，取上清液并置于-80℃保存。實(shí)驗(yàn)前，所有標(biāo)本室溫下復(fù)溶后再次離心以備檢測(cè)。ADAMTSL-1 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cusabio公司，試劑批號(hào)：B24012221。酶標(biāo)儀型號(hào)為德國(guó)西門(mén)子BEP-Ⅲ。采用生物素-親和素放大的ELISA（BA-ELISA）檢測(cè)血清中的ADAMTSL-1蛋白。在預(yù)包被抗ADAMTSL-1抗體的微孔板中加入待測(cè)血清和標(biāo)準(zhǔn)品，再依次加入生物素化的抗ADAMTSL-1抗體和HRP標(biāo)記親和素，最后經(jīng)底物顯色，并在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得待測(cè)血清ADAMTSL-1濃度。具體操作步驟見(jiàn)試劑說(shuō)明書(shū)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

ADAMTSL-1濃度為呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料，故用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，兩組和多組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)和方差分析（經(jīng)開(kāi)平方正態(tài)性轉(zhuǎn)換后）。采用SPSS16.0軟件分析數(shù)據(jù)，雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 慢性肝病患者和正常對(duì)照組血清ADAMTSL-1蛋白比較

80例慢性肝病患者的血清ADAMTSL-1蛋白濃度為10.93（9.43～16.36）ng/mL，顯著高于正常對(duì)照組的7.53（6.91～8.17）ng/mL（t=5.47，P<0.01）。

2.2血清ADAMTSL-1蛋白在不同Child-Pugh 評(píng)分慢性肝病中的比較

血清ADAMTSL-1蛋白濃度隨著Child-Pugh評(píng)分的升高而增加（F=12.33，P<0.01），經(jīng)LSD檢驗(yàn)，Child-Pugh 評(píng)分A、B、C級(jí)之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。見(jiàn)圖1。

3討論

到目前為止，已有多個(gè)ADAMTS超家族中的成員被發(fā)現(xiàn)與肝病發(fā)展相關(guān)。ADAMTS13是肝臟分泌的一種金屬蛋白酶，主要由肝星狀細(xì)胞合成，其作用是通過(guò)降解vWF多聚體減少血栓的形成[7]。Uemura等[8]認(rèn)為隨著肝臟功能的減退ADAMTS13活性和抗原含量逐步降低。而Wiese等[9]的研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的ADAMTS13蛋白含量顯著高于對(duì)照組，但與Child-Pugh評(píng)分、門(mén)脈高壓和血流動(dòng)力學(xué)無(wú)關(guān)。以上兩項(xiàng)研究的結(jié)論看似矛盾，其原因可能與前者研究對(duì)象大多為病毒性肝炎肝硬化且采集的血標(biāo)本為來(lái)自外周靜脈，而后者病例大多為酒精性肝硬化且血液采集自肝靜脈和股動(dòng)脈有關(guān)。另有研究指出慢性乙型和丙型肝炎患者血漿中ADAMTS13活性和含量的升高是發(fā)展成肝癌的危險(xiǎn)因素[10]。ADAMTS-2、ADAMTS-3和 ADAMTS-14是前膠原N端蛋白酶，可通過(guò)剪切N末端前肽使前膠原發(fā)展為成熟膠原；三者都可通過(guò)裂解轉(zhuǎn)化因子結(jié)合蛋白1（Latent TGF-βbinding protein1，LTBP1）、TGF-β受體Ⅲ和前TGF-β而起到調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)的作用[11]。李漢軍等[12]也通過(guò)免疫組化和Western blot檢測(cè)到ADAMTS-2和TGF-β1在肝硬化組織中的表達(dá)比正常肝組織明顯升高，從而推測(cè)兩者可能存在協(xié)同致肝纖維化作用。

在過(guò)去的研究中發(fā)現(xiàn)ADAMTSL蛋白并不是由ADAMTS基因的剪接變體所產(chǎn)生的，它們由獨(dú)立的基因編碼，如ADAMTSL-1編碼基因位于人類(lèi)染色體9p21-22[3]，ADAMTSL-3編碼基因位于人類(lèi)染色體15等[13]。ADAMTSL-1蛋白含有497個(gè)氨基酸，含有1個(gè)信號(hào)肽、4個(gè)TSP-1、1個(gè)半胱氨酸富集區(qū)域、1個(gè)間隔區(qū)域和1個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)。研究指出ADAMTSL-1蛋白的TSP-1中含有O-連接巖藻糖基化位點(diǎn)和C-甘露糖基化位點(diǎn)，抑制兩者糖基化會(huì)減少ADAMTSL-1蛋白的分泌。由此推測(cè)O-連接巖藻糖基化和C-甘露糖基化可能作為翻譯后修飾而影響該蛋白的生成[2，14]。ADAMTSL-1蛋白主要表達(dá)在骨骼肌，而其小信使RNA也可見(jiàn)于其他組織（如心臟、結(jié)腸、腎臟、肝臟）[3]。Campbell等[15]通過(guò)對(duì)小鼠骨肉瘤模型注射Hh通路抑制劑IPI-926減弱骨肉瘤的增殖，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ADAMTSL-1表達(dá)降低，認(rèn)為ADAMTSL-1可能作為Hh通路的調(diào)控基因改變了骨肉瘤的發(fā)展。在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中，與哺乳動(dòng)物ADAMTSL-1同源的MADD-4通過(guò)導(dǎo)素受體UNC-40/DCC發(fā)揮作用[16]。DCC與細(xì)胞凋亡和腫瘤形成相關(guān)[17，18]，由此也推測(cè)ADAMTSL-1參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

到目前為止，包括ADAMTSL-1在內(nèi)的ADAMTSL蛋白家族功能仍然未知，特別是其與慢性肝病的關(guān)系未見(jiàn)有報(bào)道。Hirohata等[3]認(rèn)為這類(lèi)蛋白可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ADAMTS的底物而表現(xiàn)出與ADAMTS蛋白相拮抗。Drechsler等[19]在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)與ADAMTSL同源的Loh可通過(guò)與Prc膠原結(jié)合而在心肌的細(xì)胞外基質(zhì)形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，表明ADAMTSL在進(jìn)化過(guò)程中非常保守，并可能通過(guò)與膠原的結(jié)合而參與細(xì)胞外基質(zhì)的形成。另一方面，已發(fā)現(xiàn)多種ADAMTSL基因突變與疾病相關(guān)，如ADAMTSL-4基因突變被認(rèn)為是常染色體隱性的孤立性晶狀體異位（autosomal recessive isolated ectopialentis，IEL）的主要因素[20]；而ADAMTSL-2基因突變與一種表現(xiàn)為身材矮小、指短、皮厚和心瓣膜異常的罕見(jiàn)肌發(fā)育不良（geleophysic dysplasia）有關(guān)[21]。

原纖蛋白-1（fibrillin-1）是組成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，與TGF-β關(guān)系密切，而后者又是肝硬化最相關(guān)的細(xì)胞因子。TGF-β可促進(jìn)原纖蛋白1的表達(dá)，而原纖蛋白1參與構(gòu)成的LTBPs又是活性TGF-β的重要來(lái)源[22，23]。ADAMTSL-2、3、6已被發(fā)現(xiàn)可以與原纖蛋白1結(jié)合，是形成微纖維的重要調(diào)節(jié)分子[24，25]。Hubmccher等[24]認(rèn)為ADAMTSL蛋白可能參與了TGF-β的信號(hào)通路，提示我們值得對(duì)ADAMTSL家族做進(jìn)一步的研究。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)慢性肝病患者血清中ADAMTSL-1的濃度顯著高于健康對(duì)照組，且隨著Child-Pugh評(píng)分的增加而升高，各級(jí)之間存在著顯著性差異，表明ADAMTSL-1蛋白可能參與慢性肝病的進(jìn)展。然而本研究也存在一定的缺陷，如（1）病例數(shù)較少，尤其是Child-Pugh評(píng)分B、C級(jí)的患者數(shù)量不足；（2）因樣本數(shù)量的限制未能研究該蛋白與肝癌的相關(guān)性。所以未來(lái)的研究中我們需進(jìn)行大樣本量實(shí)驗(yàn)，并將肝癌患者納入研究，也許ADAMTSL-1蛋白能成為反映慢性肝病患者肝臟儲(chǔ)備功能和預(yù)后的新指標(biāo)。

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（收稿日期：2016-07-19）