自體外周血干細(xì)胞移植對(duì)乙型肝炎肝硬化失代償期吲哚氰綠滯留率的影響分析

鄧勤智　胡耀仁　應(yīng)豪

[摘要] 目的 觀察自體外周血干細(xì)胞移植治療對(duì)乙型肝炎肝硬化失代償期患者吲哚氰綠滯留率的影響。 方法 采用前瞻性、隨機(jī)對(duì)照分組法，將60例乙型肝炎肝硬化失代償期患者分成兩組，每組30例，一組為移植組，在接受綜合內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上接受自體外周血干細(xì)胞移植治療，一組對(duì)照組，僅接受綜合內(nèi)科治療。觀察自體外周血干細(xì)胞移植后12周、24周、36周、48周癥狀和體征變化、血總膽紅素（TBil）、凝血酶原活動(dòng)度（PTA）、白蛋白（Alb）水平、吲哚氰綠15 min滯留率（ICG R15）的變化以及移植后的副反應(yīng)、腫瘤發(fā)生率等，并與移植治療前及同期對(duì)照組比較。 結(jié)果 外周血干細(xì)胞移植治療后，大多數(shù)患者腹水等癥狀改善，未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)；移植后24周、36周、48周Alb水平、PTA與移植前及對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），移植后36周、48周ICG R15與移植前及12周比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 自體外周血干細(xì)胞移植治療乙型肝炎肝硬化失代償期患者安全、有效。

[關(guān)鍵詞] 外周血干細(xì)胞；肝硬化；ICG R15；細(xì)胞移植；乙型肝炎

[中圖分類號(hào)] R657.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）36-0001-04

[Abstract] Objective To observe the effect of autologous peripheral blood stem cell transplantation on the retention rate of indocyanine green in hepatitis B patients with cirrhosis in their decompensation period. Methods Sixty hepatitis B patients with cirrhosis in their decompensation period were divided into two groups according to the method of prospective， randomized， controlled grouping， with 30 cases in each group. One group was transplantation group and received autologous peripheral blood stem cell transplantation on the basis of comprehensive medical treatment. The other was control group and only received comprehensive medical treatment. Changes of symptoms and signs， serum total bilirubin （TBil）， prothrombin activity （PTA）， albumin（Alb） level， the changes of 15 min indocyanine green retention rate （ICG R15）， side effects after transplantation and tumor incidence were observed and compared with the control group and before transplantation at 12 weeks， 24 weeks， 36 weeks and 48 weeks after autologous peripheral blood stem cell transplantation. Results After peripheral blood stem cell transplantation， ascites and other symptoms of most patients were improved and no serious adverse reactions existed. The levels of Alb and PTA at 24 weeks， 36 weeks and 48 weeks after transplantation were statistically significant compared with those before transplantation and the control group（P<0.01）； and ICG R15 at 36 weeks and 48 weeks after transplantation was statistically significant compared with that before transplantation and 12 weeks（P<0.05）. Conclusion Autologous peripheral blood stem cell transplantation in the treatment of hepatitis B patients with cirrhosis in their decompensation period is safe and effective.

[Key words] Peripheral blood stem cell； Cirrhosis； ICG R15； Cell transplantation； Hepatitis B

目前內(nèi)科治療乙型肝炎肝硬化失代償期效果欠佳，肝移植為較理想的治療方法，但由于供體的緊缺限制了其臨床應(yīng)用[1]。近年來(lái)，干細(xì)胞移植治療肝硬化的研究在國(guó)內(nèi)外開(kāi)展，但目前仍然缺少大樣本的隨機(jī)、對(duì)照研究[2，3]，所以亟需一些大樣本、隨訪時(shí)間較長(zhǎng)的對(duì)照研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)干細(xì)胞移植對(duì)肝硬化治療的意義。我們希望通過(guò)本研究了解自體外周血干細(xì)胞（autologous peripheral blood stem cell，APBSC）在治療乙型肝炎肝硬化失代償期患者中的安全性、療效，特別是吲哚氰綠（indocyanine green，ICG）滯留率的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇在寧波市第二醫(yī)院肝病科2011年7月～2013年12月住院的乙型肝炎肝硬化失代償期患者60例，年齡18～59周歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2000年《病毒性肝炎防治方案》[4]、2006年《肝衰竭診療指南》[5]及2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[6]。肝硬化Child-Turcotte-Pugh（CTP）分級(jí)B～C級(jí)，HBV-DNA 水平每3個(gè)月檢測(cè)1次，且持續(xù)6個(gè)月以上HBV-DNA PCR<1.0×103 IU/mL；所有患者均經(jīng)影像學(xué)排除肝臟腫瘤，檢測(cè)前1個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)血漿、白蛋白等血制品。經(jīng)寧波市第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組病例按1∶1隨機(jī)法分為兩組，一組為干細(xì)胞移植組，共30例，其中男22例，女8例，在核苷類似物抗乙肝病毒、護(hù)肝、退黃、利尿等常規(guī)內(nèi)科治療的基礎(chǔ)上行APBSC移植；一組為對(duì)照組，共30例，其中男20例，女10例，同樣予常規(guī)內(nèi)科治療。移植組年齡（48.93±7.91）歲，對(duì)照組年齡（49.57±10.05）歲。腹水例數(shù)：移植組：0周：22例；對(duì)照組0周：23例。移植前Child-Turcotte-Pugh評(píng)分（CTP評(píng)分）比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見(jiàn)表1。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）肝硬化終末期合并嚴(yán)重并發(fā)癥者；（2）生命體征不穩(wěn)定者；（3）合并其他部位嚴(yán)重感染者；（4）心、肺、腎臟器功能衰竭者。

1.3 方法

1.3.1 吲哚氰綠滯留率檢測(cè)方法 移植組和對(duì)照組均檢測(cè)ICG R15，所有患者空腹，予0.5 mg/kg 吲哚氰綠（indocyanine green，ICG）靜推，10 s內(nèi)推注完畢，DDG分析儀鼻感光探頭連接于患者鼻翼部，利用脈沖式色素濃度圖像分析儀檢測(cè)ICG15 min滯留率（ICG R15）。

1.3.2 干細(xì)胞移植方法 移植組在移植前予患者G-CSF（5～10）μg/kg，皮下注射，qd×4 d，若無(wú)肥胖或嚴(yán)重消瘦，一般為400 μg/d，稱之為骨髓動(dòng)員。骨髓動(dòng)員結(jié)束后第2天采集干細(xì)胞：從左側(cè)正中經(jīng)脈引出靜脈血，經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)，分離出的干細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞數(shù)，干細(xì)胞數(shù)量（2～4）×107個(gè)。分離好的干細(xì)胞在2 h內(nèi)經(jīng)股動(dòng)脈插管至肝固有動(dòng)脈經(jīng)過(guò)注射器注入肝固有動(dòng)脈。移植后的特殊處理：術(shù)后常規(guī)應(yīng)用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素2周，對(duì)照組同樣適用。

1.3.3 移植組和對(duì)照組同樣接受綜合內(nèi)科治療 包括抗病毒治療（HBV-DNA陰轉(zhuǎn)>6個(gè)月）、復(fù)方甘草酸苷護(hù)肝、腺苷蛋氨酸退黃等治療。

1.4 觀察指標(biāo)

移植組和對(duì)照組均隨訪至少48周，觀察干細(xì)胞移植后的副反應(yīng)、腹水改善情況、1年腫瘤發(fā)生率，移植前（0周）、12周、24周、36周、48周ALT、AST、TBil、Alb、PTA、ICG R15等指標(biāo)變化情況。

1.5 儀器與試劑

粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）購(gòu)自日本麒麟公司，血細(xì)胞分離儀購(gòu)自德國(guó)Fresenius Kabi AG生產(chǎn)的COM.TEC血細(xì)胞分離儀；ICG試劑（50 mg/瓶，購(gòu)自遼寧沈陽(yáng)濟(jì)世制藥有限公司），日本光電 DDG-3300K分析儀及配套分析系統(tǒng)軟件為日本光電工業(yè)株式會(huì)社研發(fā)。采用美國(guó)Beckman全自動(dòng)生化儀以及配套試劑。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用EPI DATA軟件進(jìn)行資料錄入和核對(duì)，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料用（x±s）表示，行t檢驗(yàn)及方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APBSC治療前后TBil、ALT、AST變化情況

移植組移植前后TBil、ALT、AST與同期對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見(jiàn)表2；除2例患者移植后2 d出現(xiàn)體溫自限性升高外，無(wú)其他不良反應(yīng)。移植前兩組TBil、ALT、AST、Alb、PTA、ICG R15比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見(jiàn)表2～5中0周數(shù)據(jù)。

2.2 APBSC治療前后腹水、Alb、PTA、ICG R15變化情況

移植組移植后48周腹水7例，對(duì)照組48周腹水15例，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；移植組Alb、PTA、ICGR15在24周、36周、48周時(shí)出現(xiàn)改善，與0周、12周比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），與對(duì)照組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。見(jiàn)表3～5；移植組ICG R15隨著時(shí)間推移其值逐漸降低，移植后36周與48周分別為（38.15±5.48）%、（37.52±6.04）%，與0周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與12周比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；移植后所有病例經(jīng)B超檢查，未發(fā)現(xiàn)肝腫瘤發(fā)生。

3 討論

近年來(lái)，干細(xì)胞移植治療各種疾病進(jìn)展非?？?，因其來(lái)源方便，沒(méi)有排異反應(yīng)[7]，在治療肝病的領(lǐng)域也取得一定進(jìn)展[8]；目前干細(xì)胞移植應(yīng)用于肝硬化的研究較多，大多數(shù)報(bào)道為移植后患者肝臟生化改善的研究，關(guān)于ICG滯留率即肝臟儲(chǔ)備功能等改善的研究尚少。

世界各國(guó)有多個(gè)學(xué)者研究干細(xì)胞移植治療終末期肝病，方法多種多樣，主要包括：BM-MSCs及造血干細(xì)胞（包括骨髓造血干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞）等。在干細(xì)胞移植治療上多以肝硬化失代償期、肝衰竭患者為試驗(yàn)對(duì)象，大多數(shù)研究集中在移植后肝硬化患者生化指標(biāo)（總膽紅素、白蛋白）、凝血功能的改善，很少有研究涉及肝纖維化、肝硬化程度（肝臟病理改善或無(wú)創(chuàng)性纖維化指標(biāo)改善）的改善及肝臟儲(chǔ)備功能改善的研究。干細(xì)胞具有向受損肝臟歸巢的能力及免疫調(diào)節(jié)能力[9，10]，這些特性使干細(xì)胞移植成為臨床治療肝硬化的重要手段。干細(xì)胞移植后有兩方面分化潛能：其一，可以改善肝臟的合成能力，增加血清白蛋白合成水平；其二，基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)明顯升高，細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用加強(qiáng)，上調(diào)凋亡因子，旁分泌抑制星狀細(xì)胞，并誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的凋亡[11]，肝臟內(nèi)Ⅰ型膠原基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯減少，血清中羥基脯氨酸水平呈現(xiàn)減低趨勢(shì)，在門靜脈及纖維分隔部位可見(jiàn)大量的移植干細(xì)胞，移植后肝組織中纖維沉積減少減輕肝纖維化和改善肝功能[3，12-13]。Theise ND[14]、Oh SH等[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)干細(xì)胞能向受損肝臟歸巢。肝臟儲(chǔ)備功能是指在肝臟內(nèi)具有正常功能的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的總和，其從微觀角度可以反映肝臟有效細(xì)胞群數(shù)量和肝臟血流量，隨著肝硬化的進(jìn)展，肝臟儲(chǔ)備功能逐漸下降，并發(fā)癥增加[16]。在某些領(lǐng)域特別是在外科肝切除等有重要的意義[17]，研究顯示ICG清除試驗(yàn)可用來(lái)評(píng)估肝切除術(shù)后、肝移植以及危重癥患者是否發(fā)生肝功能失代償?shù)拿舾兄笜?biāo)，而且簡(jiǎn)單易行，能很好的反應(yīng)肝臟儲(chǔ)備功能[18]，ICG R15也被認(rèn)為與門靜脈壓力以及肝臟纖維化程度成正相關(guān)，所以ICG R15在肝臟儲(chǔ)備功能的評(píng)估中起到重要作用[19]，ICG R15的升高與肝切除術(shù)后肝功能衰竭的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)[20]，有研究認(rèn)為ICG R15比CTP評(píng)分更精確的評(píng)估肝臟儲(chǔ)備功能[21]，故ICG R15的好壞直接關(guān)系到患者的預(yù)后，對(duì)預(yù)測(cè)患者的生存期、肝移植與否、外科手術(shù)前評(píng)估肝臟功能提供重要的依據(jù)。

正常人注射ICG 15 min后，血內(nèi)ICG R15為0%～10%。慢性肝炎ICG R15多在15%～20%，肝硬化時(shí)ICG R15為35%左右，ICG R15值越高，肝臟儲(chǔ)備功能越差。

本研究結(jié)果顯示：Alb在移植后12周均值升高約1.5 g/L，24周改善明顯與對(duì)照組比較有差異，與國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞移植治療肝硬化的結(jié)果相似；PTA也在移植24周后出現(xiàn)明顯改善，均提示肝臟合成功能改善；ICG R15在干細(xì)胞移植后24周無(wú)明顯變化，至移植后36周時(shí)出現(xiàn)差異，證實(shí)了肝臟儲(chǔ)備功能的改善，說(shuō)明自體外周血干細(xì)胞可以改善Alb及肝臟儲(chǔ)備功能，但I(xiàn)CG R15改善時(shí)間較晚，考慮肝硬化基礎(chǔ)存在，細(xì)胞外基質(zhì)降解需要較長(zhǎng)時(shí)間，肝臟纖維化改善較慢，門靜脈血流改善相對(duì)較晚，同時(shí)也說(shuō)明并儲(chǔ)備功能的改善并不單純是由干細(xì)胞直接作用引起的，可能還與移植后各種免疫調(diào)控密切相關(guān)。

經(jīng)過(guò)移植后患者ICG R15改善，我們認(rèn)為與以下密切相關(guān)：干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞，干細(xì)胞與受損肝細(xì)胞的融合，干細(xì)胞通過(guò)旁分泌機(jī)制促進(jìn)內(nèi)源性肝細(xì)胞的再生，干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化等[15，22]，但目前干細(xì)胞移植后是以何種機(jī)制為主改善ICG R15仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)48周的觀察結(jié)果顯示干細(xì)胞移植可以改善肝臟功能，但干細(xì)胞移植改善肝臟功能能維持多長(zhǎng)時(shí)間，需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)觀察。

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（收稿日期：2016-06-04）