HCV RNA陽(yáng)性標(biāo)本PCR-熒光探針?lè)ú《緛喰臀礄z出原因分析*

張立麗，侯玉麗，趙艷明，黃雁翔，于艷華，婁金麗，趙艷(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨檢中心，北京 100069)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

HCV RNA陽(yáng)性標(biāo)本PCR-熒光探針?lè)ú《緛喰臀礄z出原因分析*

張立麗，侯玉麗，趙艷明，黃雁翔，于艷華，婁金麗，趙艷
(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨檢中心，北京 100069)

目的 探討血清HCV RNA陽(yáng)性，但PCR-熒光探針?lè)ú《緛喰蜋z測(cè)未檢出的原因。方法 收集2015年7月至2016年3月北京佑安醫(yī)院臨檢中心分子室病毒載量>1 000 IU/mL但未測(cè)出病毒亞型的標(biāo)本55例，采用基因測(cè)序方法對(duì)病毒擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型分析。結(jié)果 55例HCV病毒載量>1 000 IU/mL，但HCV病毒亞型未檢出的標(biāo)本中，其中3例為病毒載量接近病毒亞型檢測(cè)下限，經(jīng)測(cè)序分析為1b型2例，2a型1例；5例為檢測(cè)試劑盒未覆蓋亞型并且其探針位置無(wú)突變，HCV 1a型4例，6n型1例，占9.1%(5/55)；47例因探針序列位置基因突變導(dǎo)致病毒亞型未檢出，占85.5%(47/55)，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)其中1a型6例(6/47，12.8%)，1b型32例(32/47，68.1%)，2a型3例(3/47，6.4%)，2b型1例(1/47,2.1%)，3b型 1例(1/47,2.1%)，6a型2例(2/47,4.3%)，1b、6q、6c混合型1例(1/47,2.1%)，6n型1例(1/47,2.1%)。探針序列位置基因突變組中以HCV病毒5′非翻譯區(qū)(5′ UTR) 204 C/T突變?yōu)橹?31/47, 66.0 %)，其次為5′UTR 168 C/A突變(5/47, 10.6%)。結(jié)論 病毒載量低、試劑盒覆蓋的病毒亞型有限、探針對(duì)應(yīng)的序列存在變異均會(huì)影響PCR-熒光探針?lè)z測(cè)HCV基因型，其中探針序列變異是病毒亞型未測(cè)出的主要原因。

丙型肝炎病毒；病毒基因型；病毒變異；病毒載量

HCV是一種有很高變異率的不均質(zhì)病毒株，復(fù)制過(guò)程中所依賴的RNA多聚酶具有錯(cuò)配傾向[1]。不同的HCV基因型其致病毒力、預(yù)后及其抗病毒難度治療的反應(yīng)性方面都有差異，因此檢測(cè)HCV基因型對(duì)臨床的治療方案選擇、預(yù)后評(píng)估具有重要意義[2]?，F(xiàn)有的HCV基因型檢測(cè)試劑盒主要選取HCV的保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物和探針，但臨床存在HCV RNA陽(yáng)性，基因分型未檢測(cè)出的現(xiàn)象，給臨床診斷和治療帶來(lái)極大困擾。針對(duì)該現(xiàn)象，我們總結(jié)分析HCV病毒載量陽(yáng)性，但基因型不能分辨現(xiàn)象的原因及該部分患者的臨床特征。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年7月至2016年3月北京佑安醫(yī)院臨檢中心分子室HCV病毒載量>1 000 IU/mL，但PCR-熒光探針?lè)ㄎ礈y(cè)出病毒亞型的標(biāo)本55例；隨機(jī)選取同時(shí)期HCV病毒載量>1 000 IU/mL，且PCR-熒光探針?lè)ú《痉中蜑?b 亞型的標(biāo)本50例作為對(duì)照組。所有患者HCV感染診斷均符合2011年版《慢性丙型肝炎防治指南》。研究組及對(duì)照組均未進(jìn)行抗病毒治療。

1.2 標(biāo)本采集 抽取待檢者清晨空腹靜脈血2 mL，室溫放置1 h，500×g離心分離血清后于-20 ℃保存。

1.3 試劑與儀器 磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒、PCR-熒光探針?lè)℉CV核酸檢測(cè)試劑盒(湖南圣湘公司)；ABI 7500熒光PCR儀(美國(guó)ABI公司)；HCV基因分型檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?，中?guó)泰普生物科學(xué)公司)。

1.4 HCV病毒載量檢測(cè) 用磁珠法提取HCV RNA，在ABI 7500熒光PCR儀上用PCR-熒光探針?lè)ǘ繖z測(cè)HCV核酸，按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 HCV基因分型檢測(cè) 用PCR-熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行HCV基因分型，試劑盒覆蓋的亞型為1b、2a、3a、3b、6a，按試劑盒要求進(jìn)行操作。HCV各亞型的RNA最低檢出量均為1 000 IU/mL。

1.6 未分型標(biāo)本測(cè)序分析 用Sanger 測(cè)序，由中國(guó)泰普生物科學(xué)公司協(xié)助完成。在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)。

1.7 肝功能相關(guān)生化項(xiàng)目檢測(cè) 用Olympus AU5400全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果分析 55例熒光探針?lè)ㄎ捶中蜆?biāo)本中，經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)HCV 1a型4例，6n型1例，系檢測(cè)試劑盒未覆蓋亞型，占未分型病例的9.1%(5/55)；47例因探針序列位置基因突變導(dǎo)致病毒亞型未檢出，占85.5%(47/55)；3例病毒載量分別為1 100、1 008、1 064 IU/mL，因接近病毒亞型檢測(cè)下限而未能分型，經(jīng)測(cè)序分析為1b型2例，2a型1例。病毒載量大于1 000 IU/mL、因探針序列位置基因發(fā)生變異而導(dǎo)致病毒亞型未測(cè)出的47例標(biāo)本中，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)其中1a型6例(6/47，12.8%)，1b型32例(32/47，68.1%)，2a型3例(3/47，6.4%)，2b型1例(1/47，2.1%)，3b型 1例(1/47，2.1%)，6a型2例(2/47，4.3%)，1b、6q、6c混合型1例(1/47，2.1%)，6n型1例(1/47，2.1%)

2.2 HCV探針序列位置基因變異情況分析 47例突變組中以HCV病毒5′非翻譯區(qū)(5′-untranslated region,5′-UTR) 204 C/T突變?yōu)橹?31/47, 66.0%)，其次為5′UTR168 C/A(5/47, 10.6%)、5′UTR 214 A/T(2/47, 4.3%)、5′UTR 214 A/C(2/47, 4.3%)、 5′UTR 168 C/G(2/47, 4.3%)、5′UTR 214 A/C (1/47, 2.1%)、5′UTR 212 TC/GT(1/47, 2.1%)、84 T/G(1/47, 2.1%)、5′UTR 216 T/C(1/47,2.1%)及5′UTR 220 T/G(1/47, 2.1%)。

2.3 HCV 1b基因突變型的臨床特征 1b型5′UTR變異組32例與1b型無(wú)變異的52例(其中正常檢出無(wú)變異50例，檢出失敗但非變異2例)患者ALT、AST水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但HCV 1b亞型5′UTR變異組、非變異組病毒載量(IU/mL)的lg值分別為5.7±1.3、6.6±0.5，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)。見(jiàn)表1。

表1 1b亞型5′UTR變異組與非變異組患者一般情況比較

3 討論

HCV基因組為正鏈RNA，全長(zhǎng)約9 600 bp，含有單一開放閱讀框(open reading frame, ORF)，編碼3 000多個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白前體。HCV目前分為1～7個(gè)基因型和若干個(gè)亞型，我國(guó)HCV基因亞型以1b型最為常見(jiàn)(56．8%)，其次為2型(24.1%)、3型(9.1%)與6型(6.3%)[3]，上述基因型在我們使用的試劑盒中均可檢測(cè)。

已有研究表明，不同的HCV基因型對(duì)以干擾素為基礎(chǔ)的治療表現(xiàn)出不同的免疫應(yīng)答反應(yīng)。與基因型2、3、5和6相比，基因型1和4對(duì)基于干擾素的聯(lián)合治療敏感性較低，基因型1和4對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的干擾素治療耐受時(shí)間為48周，而2型和3型的耐受時(shí)間只有24周[4]。1型對(duì)干擾素治療的持續(xù)應(yīng)答率為70%，2型和3型的持續(xù)應(yīng)答率可達(dá)到90%，4型的持續(xù)應(yīng)答率僅有65%，而6型的持續(xù)應(yīng)答率可達(dá)80%[5-6]。因此，HCV基因型在臨床上常作為藥物療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。另外，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)HCV 1b亞型與丙型肝炎的進(jìn)展及發(fā)展成肝細(xì)胞癌具有密切關(guān)系[7]，因此HCV基因型還可用來(lái)預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程和肝臟病變的嚴(yán)重程度，以提高丙型肝炎診斷的準(zhǔn)確率。

HCV基因組的5′UTR共有341個(gè)核苷酸序列，在HCV基因組中最為保守，該區(qū)域包含一段必需順式作用元件和一段序列更為保守的內(nèi)源性核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。IRES上游序列對(duì)病毒復(fù)制是必需的，而IRES的部分莖環(huán)結(jié)構(gòu)在病毒蛋白的翻譯過(guò)程中起著重要作用[8]。5′UTR是HCV中高度保守的序列，具有雙重功能：一是含有IRES，可以指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成；二是在負(fù)鏈中提供順式作用復(fù)制元件(Cis-acting replication elements，CREs)指導(dǎo)子代正鏈的合成[9-10]。在本研究中，所用試劑盒是基于5′UTR序列進(jìn)行HCV分型，這也是當(dāng)前檢測(cè)HCV基因型的主要方式。

目前，HCV基因分型方法包括血清學(xué)分型、特異性探針雜交法、特異性引物擴(kuò)增法、DNA免疫酶分析法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法和核酸測(cè)序及同源性比較法[11]，其中核苷酸同源性分型法最為準(zhǔn)確可靠。臨床檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)HCV RNA陽(yáng)性，而基因型未測(cè)出的情況，分析其原因有以下幾種：(1)病毒載量低，影響病毒亞型的檢測(cè)；(2)試劑盒覆蓋的病毒亞型有限，不在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)；(3)探針對(duì)應(yīng)的序列存在變異。本研究中探針對(duì)應(yīng)序列變異情況占未分型病例的85.5%(47/55)，其中的1a和6n型屬于本試劑盒未覆蓋的亞型，具有試劑盒的局限性，而探針位點(diǎn)各種試劑盒通用，因此將其歸為探針突變型，更具有廣泛性?？梢钥闯觯琑NA陽(yáng)性、熒光探針?lè)ú《緛喰臀礈y(cè)出的主要原因是由于探針對(duì)應(yīng)序列的變異。

本研究結(jié)果顯示，病毒載量陽(yáng)性因基因變異導(dǎo)致病毒未分型病例中仍以1b 亞型為主要的HCV基因型，其次為1a型。此外，HCV基因型突變中不同亞型所占比例在不同區(qū)域中有一定差異[12]。在1b基因型突變組中，由于病毒突變所付出的適應(yīng)性代價(jià)(即病毒為了逃避機(jī)體免疫功能所付出的代價(jià))導(dǎo)致HCV載量相對(duì)無(wú)突變組較低，這個(gè)結(jié)果與其他學(xué)者報(bào)道的結(jié)果一致[13]。

總之，臨床檢驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)HCV RNA 陽(yáng)性、病毒亞型未能測(cè)出的現(xiàn)象，其中特異性探針對(duì)應(yīng)序列出現(xiàn)變異，影響探針結(jié)合是其主要原因，這部分患者在北京地區(qū)以1b 亞型為多見(jiàn)，并且病毒載量較非變異患者有減低的趨勢(shì)。針對(duì)這一問(wèn)題，有研究指出聯(lián)合HCV多區(qū)段例如將非結(jié)構(gòu)蛋白5B區(qū)和core區(qū)與現(xiàn)常用的5′UTR相結(jié)合，能提高檢測(cè)HCV基因型的準(zhǔn)確性及靈敏度[14]。

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(本文編輯：劉群)

北京市醫(yī)管局“揚(yáng)帆計(jì)劃”重點(diǎn)專業(yè)項(xiàng)目(ZYLX201711)；北京市豐臺(tái)區(qū)科技項(xiàng)目(BJYAH2015YN15)。

張立麗，1977年生，女，副主任技師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)及分子診斷學(xué)；侯玉麗，1992年生，女，碩士研究生，研究方向?yàn)閭魅拘约膊〉脑缙谠\斷。兩位對(duì)本文貢獻(xiàn)等同，共為第一作者。

趙艷，研究員，E-mail：18911380390@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.08

R446.6

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2017-02-23)