鮑曼不動桿菌分泌物對銅綠假單胞菌及其生物膜的作用*

譚芮辰，佘鵬飛，陳麗華，王妍樂，伍勇(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗科，長沙 410013)

·微生物生物膜·

鮑曼不動桿菌分泌物對銅綠假單胞菌及其生物膜的作用*

譚芮辰，佘鵬飛，陳麗華，王妍樂，伍勇
(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗科，長沙 410013)

目的 探討鮑曼不動桿菌培養(yǎng)上清對銅綠假單胞菌的浮游菌生長及生物膜形成的影響。方法 收集鮑曼不動桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 19606和ATCC 1195)和臨床菌株(AB23、AB39和AB53)，提取6、12、16、24和48 h培養(yǎng)上清液。利用96孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法檢測其培養(yǎng)上清液對銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1及其生物膜形成的影響；配制2×LB培養(yǎng)基，排除營養(yǎng)消耗對銅綠假單胞菌的影響；并進(jìn)一步利用相對分子質(zhì)量3 000蛋白質(zhì)濃縮管對其培養(yǎng)上清液進(jìn)行分離濃縮，初步探討鮑曼不動桿菌培養(yǎng)上清液中有效成分的相對分子質(zhì)量。結(jié)果 12～24 h內(nèi)的鮑曼不動桿菌培養(yǎng)上清液，抑制銅綠假單胞菌增殖的效果最為顯著，為便于操作，本實驗采用16 h培養(yǎng)上清液進(jìn)行后續(xù)實驗。50% ATCC 1195和ATCC 19606培養(yǎng)上清液能顯著抑制銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1浮游菌的增殖，可分別使其630 nm處的吸光度從0.688±0.014和0.692±0.014減少至0.431±0.023和0.428±0.020(t=16.780,P<0.05;t=18.500,P<0.05)；且50% ATCC 1195和ATCC 19606培養(yǎng)上清液能顯著抑制銅綠假單胞菌PAO1生物膜的形成，可使生物膜的形成量(A570 nm)從2.071±0.068和1.986±0.023減少至1.639±0.042和1.525±0.202(t=9.358,P<0.05;t=3.924,P<0.05)；此外，與50%鮑曼不動桿菌培養(yǎng)上清液組相比，培養(yǎng)上清液中相對分子質(zhì)量<3 000的成分抑制作用顯著，可使生物膜的形成量從1.177±0.040減少至1.056±0.030(t=4.192,P<0.05)，而>3 000的成分并無抑制作用。結(jié)論 鮑曼不動桿菌分泌物能有效抑制銅綠假單胞菌浮游菌的增殖和生物膜的形成，其有效蛋白質(zhì)成分相對分子質(zhì)量<3 000。

鮑曼不動桿菌；銅綠假單胞菌；生物膜；培養(yǎng)上清液

生物膜是細(xì)菌粘附于介質(zhì)(如：醫(yī)療器械、黏膜組織)表面形成的具有立體結(jié)構(gòu)的聚合物。物理屏障、突變率增加和滯留菌的形成等因素可使細(xì)菌耐藥性增加10～1 000倍不等[1-2]。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是一種常見的條件性致病菌，常引起免疫力低下患者的院內(nèi)感染，如呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、肺囊性纖維化肺炎、角膜炎、皮膚軟組織感染和敗血癥等[2]。PA有極強(qiáng)的生物膜形成能力，給臨床的治療帶來極大的困難[3]。近年來，研究者從植物提取物[4]、細(xì)菌自身分泌的某些小分子物質(zhì)[5]以及“老藥新用”[6]等方面著手，試圖挖掘某些新型生物膜抑制劑。但這些研究絕大多數(shù)還停留于基礎(chǔ)實驗或動物實驗階段，因種種局限尚未能用于臨床。我們在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumanii, AB)與PA幾乎很少共存于同一培養(yǎng)基中，因而，我們推斷這兩種細(xì)菌某些菌株之間可能存在相互抑制的作用。本研究從AB與PA菌群本身的相互作用出發(fā)，探索新型的生物膜抑制劑。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 3株AB臨床菌株(AB23、AB39和AB53)于2014年1月至2015年1月分離自中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗科，同一患者不同時間分離的菌株僅統(tǒng)計1次。AB標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 19606和ATCC 1195)由本實驗室保存，PA標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1由南開大學(xué)生命科學(xué)院喬明強(qiáng)教授惠贈。菌株鑒定均采用Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)。

1.2 試劑與儀器 結(jié)晶紫(天津市化學(xué)試劑一廠)；LB肉湯(北京奧博星公司)；Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)；0.22 μm無菌過濾器、相對分子質(zhì)量3 000蛋白質(zhì)濃縮管(德國Millpore公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning/Costar公司)；Elx800自動酶聯(lián)儀(美國Bio-Tek公司)。

1.3 AB培養(yǎng)上清液的提取 挑取血瓊脂平板上過夜培養(yǎng)的AB標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19606單個菌落于裝有15 mL LB肉湯培養(yǎng)基的50 mL離心管中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)6、12、16、24和48 h后，分別3 000×g離心15 min，取上清液，用0.22 μm無菌過濾器進(jìn)行過濾，取濾液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AB培養(yǎng)上清液對PAO1浮游菌的影響 挑取血瓊脂平板上的PAO1單個菌落于含有15 mL LB肉湯培養(yǎng)基的離心管中，于恒溫?fù)u床37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)16 h，3 000×g離心15 min后取沉淀。用15 mL LB肉湯稀釋AB培養(yǎng)16 h的培養(yǎng)上清液至相應(yīng)的濃度(100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%)，挑取PAO1單個菌落，并用生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液濃度至0.5 麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬謩e加100 μL此菌懸液至已稀釋的AB培養(yǎng)上清液中，于恒溫?fù)u床37 ℃ 180 r/min分別培養(yǎng)6、12、16、24和48 h后，各取200 μL菌懸液于96孔板中，用酶聯(lián)儀檢測630 nm處的吸光度(A630 nm)，即為細(xì)菌的相對生長量。分別繪制時間-生長曲線和濃度-生長曲線。

1.5 AB培養(yǎng)上清液對PAO1生物膜的影響 PAO1于LB肉湯中于恒溫?fù)u床37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，備用。用LB肉湯培養(yǎng)基對倍稀釋AB培養(yǎng)16 h上清液，分別取196 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔再分別加入4 μL備用的PAO1菌懸液，吹打混勻后，置濕盒中37 ℃靜置溫育24 h。棄去未與孔壁或孔底結(jié)合的浮游菌，用無菌生理鹽水輕洗3次，再分別加入200 μL 0.5 mg/mL結(jié)晶紫溶液，靜置染色15 min后，再用無菌生理鹽水輕洗3次以去除未與細(xì)菌結(jié)合的結(jié)晶紫，于烤箱烘干后，分別加入200 μL 95%乙醇溶液，置搖床溫育20 min，使結(jié)晶紫充分溶解后于酶聯(lián)儀檢測570 nm處的吸光度(A570 nm)，即為生物膜的相對量[7]。為排除AB培養(yǎng)上清液中LB肉湯營養(yǎng)消耗的影響，本試驗同時配制1×LB 和2×LB肉湯(即：按照LB肉湯說明書配制的基礎(chǔ)上，當(dāng)加入一份雙蒸水時加兩份LB培養(yǎng)基粉末)，分別對倍稀釋AB標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 1195培養(yǎng)16 h的上清液，進(jìn)行浮游菌抑制試驗和生物膜形成抑制試驗，方法同上。

1.6 AB上清液有效成分初探 用蛋白質(zhì)濃縮管將AB上清液分成蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量<3 000 和>3 000兩個部分(蛋白質(zhì)濃縮管離心后，上層保留的為相對分子質(zhì)量<3 000的成分，而下層為相對分子質(zhì)量>3 000的成分)，分別進(jìn)行生物膜形成抑制試驗，方法同1.5。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時間的AB上清液對PAO1浮游菌的抑制能力不同 將不同培養(yǎng)時間的對照組(僅有LB肉湯)與PAO1作用后浮游菌增殖量設(shè)置為100%時，濃度為25%和50%的AB標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19606培養(yǎng)上清液均對PAO1浮游菌的增殖有一定的抑制作用。其中，16 h的AB上清液抑制效果最為顯著，故選擇16 h培養(yǎng)上清液進(jìn)行后續(xù)實驗。25%和50%的AB培養(yǎng)上清液與PAO1分別作用16 h后，與僅有LB肉湯的對照組相比，可使其浮游菌的增殖量分別從(1.249±0.046)%減少至(1.005±0.051)%和(0.732±0.045)%(t=6.153,P<0.05;t=13.92,P<0.05)。見圖1。

2.2 AB培養(yǎng)上清液對PAO1浮游菌和生物膜的抑制能力具有劑量依賴性 AB臨床菌株AB23、AB39和AB53和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 1195、ATCC 19606的16 h培養(yǎng)上清液與PAO1作用24 h后均可同時抑制PAO1浮游菌的增殖和生物膜的形成。當(dāng)ATCC 1195和ATCC 19606培養(yǎng)上清液的濃度為50%時，可顯著抑制PAO1浮游菌的增殖，與僅有LB肉湯的對照組相比，可分別使PAO1在630 nm處的吸光度從0.688±0.014和0.692±0.014減少至0.431±0.023和0.428±0.020(t=16.780,P<0.05;t=18.500,P<0.05)。50%的ATCC 1195和ATCC 19606培養(yǎng)上清液可使PAO1生物膜的形成量從2.071±0.068和1.986±0.023減少至1.639±0.042和1.525±0.202(t=9.358,P<0.05;t=3.924,P<0.05)。隨著濃度升高，其抑制能力越強(qiáng)，具有顯著的劑量依賴性。見圖2。

圖1 不同培養(yǎng)時間的AB培養(yǎng)上清液對PAO1浮游菌的影響

注：A，浮游菌；B，生物膜。

圖2 不同濃度的AB培養(yǎng)上清液對PAO1的影響

2.3 不同濃度培養(yǎng)基對PAO1的影響 2×LB肉湯在一定程度上可以促進(jìn)PAO1浮游菌的增殖(P<0.05)，但并不影響AB培養(yǎng)上清液對生物膜的抑制作用(P>0.05)。見圖3。

注：A，浮游菌；B，生物膜；*與僅有LB培養(yǎng)液的對照組比較，P<0.05。

圖3 不同濃度培養(yǎng)基對PAO1的影響

2.4 AB上清液有效成分初探 將濃度為50%的AB培養(yǎng)上清液用蛋白質(zhì)濃縮管進(jìn)行濃縮和分離。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量<3 000部分與50%AB培養(yǎng)上清液組相比，可使生物膜的形成量從1.177±0.040減少至1.056±0.030(t=4.192,P<0.05)；而蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量>3 000部分具有顯著促進(jìn)生物膜形成的作用，與加50%AB培養(yǎng)上清液對照組相比，可使生物膜的形成量增加至1.677±0.102(t=7.904,P<0.05)。因此，我們推測AB培養(yǎng)上清液中抑制PAO1生物膜形成的有效成分蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量<3 000。見圖4。

注：*：與50%AB培養(yǎng)上清液對照組比較，P<0.05。

圖4 AB上清液中不同分離成分對PAO1生物膜的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，AB培養(yǎng)16 h的上清液能顯著抑制PA標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1的浮游菌增殖和生物膜的形成。并且，我們推測這種對浮游菌的抑制作用部分原因可能是因為其培養(yǎng)肉湯的營養(yǎng)成分消耗而導(dǎo)致，而AB上清液中存在特異性的生物膜抑制成分(相對分子質(zhì)量<3 000)抑制PAO1生物膜的形成。

人體內(nèi)的細(xì)菌并非以單一形式存在，不同種屬細(xì)菌之間可共存，并能相互促進(jìn)或抑制。如腸道菌群，不同種屬的細(xì)菌之間相互作用，共同維持腸道的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)這種自穩(wěn)態(tài)被打破，將引發(fā)相關(guān)疾病[8]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)PA與不同菌屬之間往往存在相互作用[9-13]。而目前國內(nèi)外尚無AB與PA之間的相互作用的相關(guān)報道。而本研究發(fā)現(xiàn)AB培養(yǎng)上清液對PA浮游菌增殖和生物膜的形成有顯著的抑制作用。

PA生物膜主要由菌體、胞外多糖、胞外DNA和胞外蛋白質(zhì)組成。其從起始粘附到生物膜的成熟和分散過程的整個生理周期均受到群體密度感應(yīng)(quorum sensing, QS)系統(tǒng)和第二信使環(huán)鳥苷二磷酸(c-di-GMP)的精確調(diào)控[14-15]。因此，我們推測AB上清液培養(yǎng)液對PA生物膜的的抑制作用可能是通過干擾其QS系統(tǒng)和c-di-GMP的正常調(diào)控作用，并進(jìn)一步抑制細(xì)菌粘附和胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)而完成。本實驗團(tuán)隊在后續(xù)的研究中將對其具體的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

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(本文編輯：劉群)

Effect ofAcinetobacterbaumanniisecretions onPseudomonasaeruginosacell growth and biofilm formation

TANRui-chen,SHEPeng-fei,CHENLi-hua,WANGYan-le,WUYong
(DepartmentofLaboratoryMedicine,TheThirdXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410013,Hunan,China)

Objective To investigate the effects ofAcinetobacterbaumanniiculture supernatants on planktonic cell growth and biofilm formation ofPseudomonasaeruginosa. Methods The standard isolates(ATCC 19606, ATCC 1195) and clinical isolates(AB23，AB39，AB53) ofAcinetobacterbaumanniiwere collected and the 6, 12, 16, 24 and 48 hour-cultured supernatants were extracted. The effects of the culture supernatants on the biofilm formation ofPseudomonasaeruginosaPAO1 were detected on the 96-well plate combined with crystal violet staining. Two-fold concentration of LB medium was prepared to eliminate the effects of nutrition consumption ofAcinetobacterbaumanniiduring culture onPseudomonasaeruginosagrowth. The active ingredients in the supernatant ofAcinetobacterbaumanniiculture medium were investigated by using the concentrated tube containing protein with relative molecular mass 3 000. Results The most suitable period forAcinetobacterbaumanniiculture supernatant extraction was between 12 to 24 hours, so the 16 hour-cultured supernatant was chosen for next experiments. The 50% culture supernatant ofAcinetobacterbaumanniiATCC 1195 and ATCC 19606 significantly inhibited the planktonic cell growth ofPseudomonasaeruginosaPAO1, in which the absorbance at 630 nm reduced from(0.688±0.014) and(0.692±0.014) to(0.431±0.023) and(0.428±0.020) respectively(t=16.780,P<0.05;t=18.500,P<0.05). The 50% culture supernatant ofAcinetobacterbaumanniiATCC 1195 and ATCC 19606 also significantly inhibited the biofilm formation ofPseudomonasaeruginosaPAO1 with decreased absorbance at 570 nm from(2.071±0.068) and(1.986±0.023) to(1.639±0.042) and(1.525±0.202) respectively(t=9.358,P<0.05;t=3.924,P<0.05). The biofilm inhibitory effect of the protein with relative molecular mass less than 3 000 was obviously observed by reducing amount of biofilm formation from(1.177±0.040) to(1.056±0.030)(t=4.192,P<0.05), while there was no inhibitory effect of the proteins with relative molecular mass more than 3 000 in the composition. ConclusionAcinetobacterbaumanniiculture supernatant could effectively inhibit the planktonic cell growth and biofilm formation ofPseudomonasaeruginosaand the relative molecular mass of active ingredients in the culture supernatant may be less than 3 000.

Acinetobacterbaumanii;Pseudomonasaeruginosa; biofilm; culture supernatant

湖南省自然科學(xué)基金(12JJ3092；2015JJ2188；2015JJ3165)。

譚芮辰，1992年生，女，碩士研究生，研究方向為臨床檢驗診斷學(xué)；佘鵬飛，1991年生，男，碩士研究生，研究方向為臨床檢驗診斷學(xué)。兩位對本文貢獻(xiàn)等同，共為第一作者。

伍勇，教授，E-mail:wuyong_xy@126.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.03

R446.5

A

2017-02-05)