熱處理對(duì)菠菜和上海青類囊體膜及葉綠素穩(wěn)定性的影響

樊昶昶，熊新星，鄒亞紅，于昊永，張 燕

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院/國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京 100083)

熱處理對(duì)菠菜和上海青類囊體膜及葉綠素穩(wěn)定性的影響

樊昶昶，熊新星，鄒亞紅，于昊永，張 燕

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院/國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京 100083)

綠色蔬菜在加工和貯藏過程中發(fā)生的顏色劣變與類囊體膜上葉綠素蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性有著密切的關(guān)系。本研究以上海青和菠菜為原料，研究了兩種綠色蔬菜在熱處理過程中類囊體膜溶液熱容、多肽組分、葉綠素含量、pH以及蛋白質(zhì)熒光的變化。結(jié)果表明：熱處理會(huì)導(dǎo)致葉綠素蛋白復(fù)合體的降解，類囊體膜溶液pH下降，上海青類囊體膜熱穩(wěn)定性、葉綠素含量的保持優(yōu)于菠菜類囊體膜。試驗(yàn)結(jié)果為我們明確綠色蔬菜顏色劣變的機(jī)理以及尋求更好的護(hù)綠手段提供了理論基礎(chǔ)。

類囊體膜；葉綠素蛋白復(fù)合體；熱穩(wěn)定性；葉綠素

綠色是展示綠色蔬菜及其制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，但綠色蔬菜加工和貯藏過程中通常會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的顏色劣變，嚴(yán)重影響外觀和消費(fèi)者的接受度，不利于影響著綠色蔬菜加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，探索合適的技術(shù)延緩加工綠色蔬菜的顏色劣變就顯得極為重要。但在此之前需要明確綠色蔬菜顏色劣變的機(jī)理。目前，綠色蔬菜顏色劣變主要?dú)w咎于葉綠素的降解，并認(rèn)為葉綠素的降解途徑主要有兩條：由外界環(huán)境如溫度和酸主導(dǎo)的降解途徑，這一過程大多存在于經(jīng)過一定加工的綠色蔬菜中[1]；另一條是由葉綠素酶和脫鎂葉綠素螯合酶主導(dǎo)的代謝途徑，這個(gè)途徑通常發(fā)生在衰老的植物葉片中[2]。

針對(duì)目前加工綠色蔬菜中存在的顏色劣變問題，較為常用的護(hù)綠策略為：采用葉綠素銅鈉或葉綠素鋅鈉進(jìn)行染色[3]、調(diào)節(jié)pH值護(hù)綠[4-5]、熱燙[4，6-7]、UV-B輻照等殺滅、鈍化酶活，控制酶主導(dǎo)的葉綠素降解[8]，加入抗氧化劑，抑制酶活，應(yīng)用ZnCl2、CuCl2金屬離子[4，9]可有效提高熱加工綠色蔬菜的顏色。由此可見，對(duì)于加工綠色蔬菜顏色控制的策略和方法，仍然集中于對(duì)葉綠素降解的控制，但增效多不明顯。

多年來，附于類囊體膜上的葉綠素蛋白復(fù)合體是調(diào)控綠色劣變的根本，這一實(shí)質(zhì)問題沒有被廣泛關(guān)注。經(jīng)過加工的綠色蔬菜，類囊體膜不同程度受損，葉綠素蛋白復(fù)合體降解，從而釋放出游離的葉綠素，葉綠素進(jìn)一步被降解，才導(dǎo)致加工綠色蔬菜最終的顏色劣變。為了尋找更加合適的調(diào)控綠色蔬菜顏色劣變的方法，提高加工綠色蔬菜制品品質(zhì)，本文以葉綠素蛋白復(fù)合體是穩(wěn)定綠色的根本這一觀點(diǎn)出發(fā)，研究熱處理對(duì)不同蔬菜的類囊體膜和葉綠素的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

購于農(nóng)貿(mào)市場的新鮮上海青以及菠菜，洗凈瀝干后，參考盧然[10]、王蓉蓉[11]的方法，置于4 ℃冷庫中進(jìn)行預(yù)冷處理，大約1h后取出預(yù)冷的葉片進(jìn)行類囊體膜的提取，得到類囊體膜制備液，而后進(jìn)行水浴加熱處理。控制水浴鍋升溫速率為10℃/10min，升溫范圍為20～90℃，在溫度上升至30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃時(shí)依次取出樣品并以溫度為標(biāo)記編號(hào)。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

2000 D型超純水器，北京長風(fēng)儀器儀表公司；S-HH-W21-Cr600型恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠；KQ-250DE型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；差式掃描微量熱儀Nano DSC，美國TA公司；安捷倫1260c型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Varian Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)，美國安捷倫公司；YP11/TN-EPS 300型電泳儀，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；MODEL868型pH計(jì)，美國奧立龍公司；BS223S型電子天平，德國Sartorious公司；CR21GIIIHITACHI型高速冷凍離心機(jī)，日立集團(tuán)；EY-300A型分析天平，日本松下電器公司；JYL-610型九陽打漿機(jī)，九陽股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 類囊體膜熱容測定 參照Cramer等[12]的方法，類囊體膜溶液放置在鋁坩堝中，升溫范圍為25～120℃，升溫速率為 1 ℃/min。使用差示掃描微量熱儀測定上海青及菠菜的類囊體膜溶液摩爾熱容的變化。

1.3.2 類囊體膜多肽組分測定 參照韋司棋[13]的方法，取出經(jīng)熱處理的類囊體膜溶液，每個(gè)樣品取出20 μL類囊體膜溶液，加入等體積2×蛋白上樣緩沖液，渦旋混勻，于100℃的沸水中變性5 min，冷卻后在12 000 g條件下離心5 min，取上清液點(diǎn)樣，再加電極緩沖液，當(dāng)指示劑到達(dá)板前2 cm完畢，取出膠放在水中10 min，然后放入到配置好的染色液中，染色0.5～1 h，用水洗2～3次，再加入脫色液脫色10 min，進(jìn)行3次后，放到搖床上，待條帶清晰背景清晰時(shí)，可采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝影。

1.3.3 葉綠素含量測定 用50 μL的加熱過后的類囊體膜溶液，再加入0.95 mL的甲醇，再用0.22 μm的針孔濾膜過濾，裝于液相小瓶之中。方法參照Teng & Chen[14]，色譜柱選用Cosmosil 5C18-AR-II(NACALAITESQUE，INC，5μm，4.6mm UEAR-II)，流動(dòng)相：乙腈：甲醇：三氯甲烷：正己烷=75∶12.5∶7.5∶7.5(v/v/v/v)，柱溫為30℃，流速為1 mL/min，等度洗脫，檢測波長為430 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.4 類囊體膜溶液pH測定 使用pH計(jì)測定加熱過程中的上海青和菠菜的類囊體膜溶液的pH值，待穩(wěn)定后記下讀數(shù)，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)測定3次。

1.3.5 類囊體膜溶液的蛋白質(zhì)熒光測定 類囊體膜溶液的蛋白熒光采用Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer 儀器進(jìn)行測定。取40 g鮮重葉片制備出的類囊體膜溶液10 mL，進(jìn)行加熱處理，處理之后，每個(gè)樣品取8 μL溶解于1 mL的A液中。以278 nm波長的光激發(fā)，檢測300～400 nm處的發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 類囊體膜熱容變化

差示掃描量熱儀可用于研究生物膜結(jié)構(gòu)和功能、蛋白質(zhì)和核酸構(gòu)象變化。熱容的變化能夠反映樣品中蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，熱容變化越大說明蛋白質(zhì)穩(wěn)定性較差。相變點(diǎn)能夠反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，從而推測物質(zhì)變化的規(guī)律[15]。由圖1可以看出，上海青對(duì)應(yīng)的相變溫度依次為51.38、60.55、63.75、70.96、84.61、104.66、109.85℃，均高于菠菜42.59、50.80、56.36、69.39、76.44、82.49、86.90℃，表明上海青的類囊體膜熱穩(wěn)定性優(yōu)于菠菜。而在30～90℃的溫度區(qū)間內(nèi)，菠菜的熱容變化明顯高于上海青，熱容變化越大表明蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性越差，容易在加工中受熱處理的影響而發(fā)生改變，能夠反映出上海青的類囊體膜的穩(wěn)定性優(yōu)于菠菜。

圖1 類囊體膜的熱容變化注：a菠菜類囊體膜體系；b上海青類囊體膜體系

2.2 熱處理過程中多肽組分變化

由圖2a、b可知，菠菜和上海青類囊體膜多肽組成及各組分比例存在較大差異，菠菜的類囊體膜多肽組分種類較上海青豐富。升溫至60 ℃時(shí)菠菜和上海青類囊體膜多肽組分沒有發(fā)生明顯的變化；70℃時(shí)光系統(tǒng)Ⅱ外周天線蛋白LHCⅡ蛋白逐漸降解；90 ℃時(shí)，代表光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心蛋白質(zhì)亞基PsaA和PsaB的條帶模糊，說明此時(shí)光系統(tǒng)Ⅰ已經(jīng)被破壞，結(jié)果與Hu等[16]相同。結(jié)果表明，溫度對(duì)類囊體膜中的多肽組分有顯著影響，70℃時(shí)光系統(tǒng)Ⅱ被破壞分解、90℃時(shí)光系統(tǒng)Ⅰ被破壞分解。多肽組分及功能的保持對(duì)于維持色素蛋白復(fù)合物中葉綠素的穩(wěn)定性抑制其降解具有積極的影響，因此高溫處理對(duì)葉綠素蛋白復(fù)合體的破壞不利于葉綠素的保持。

2.3 熱處理過程中葉綠素含量的變化

如圖3所示，菠菜類囊體膜中葉綠素a含量隨著溫度升高明顯下降，葉綠素b也隨之降低，與葉綠素a相比，葉綠素b的降解很小。而上海類囊體膜中葉綠素a含量變化呈現(xiàn)出波動(dòng)的趨勢，在60～70 ℃時(shí)降解最顯著，但是葉綠素b的含量整體上變化不大。這與之前的研究結(jié)果葉綠素a 較葉綠素b對(duì)熱處理有較低的耐受性[17]相同。

圖3b中上海青在80℃時(shí)葉綠素含量上升，而圖3a并沒有觀察到葉綠素a含量升高。可能是由于菠菜、上海青光系統(tǒng)Ⅱ捕光復(fù)合物組成和穩(wěn)定性差異造成的。一方面，光系統(tǒng)Ⅱ捕光復(fù)合物在70℃左右時(shí)結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出大量游離葉綠素，導(dǎo)致葉綠素含量增加[18]；但隨著溫度的增加，葉綠素因受熱逐漸降解，表現(xiàn)為葉綠素含量下降。光系統(tǒng)Ⅱ捕光復(fù)合物的熱穩(wěn)定性不同，游離葉綠素釋放過程存在差異，導(dǎo)致溶液中葉綠素含量變化趨勢不同。不同種類的綠色蔬菜可能由于類囊體膜結(jié)構(gòu)不同、組分不同、或組分之間比例不同而在同等的外界條件處理之下展現(xiàn)出了不同的特性[19]。

圖2 熱處理對(duì)類囊體膜多肽組分的影響注：a菠菜類囊體膜體系；b上海青類囊體膜體系

圖3 熱處理對(duì)類囊體膜溶液中葉綠素含量的影響注：a菠菜類囊體膜；b上海青類囊體膜

圖4 熱處理對(duì)類囊體膜溶液pH影響

2.4 熱處理過程中pH的變化

圖4可以看出隨著溫度的升高，菠菜和上海青的類囊體膜溶液的pH下降，在同樣的熱處理?xiàng)l件下上海青類囊體膜溶液的pH 值下降的幅度較菠菜小。類囊體膜pH變化的機(jī)理是光合作用下，通過電子傳遞鏈的作用，質(zhì)子醌會(huì)接受氫離子，同時(shí)也會(huì)影響氫離子向類囊體通道轉(zhuǎn)運(yùn)，以此來使類囊體膜的基質(zhì)側(cè)的pH值發(fā)生明顯的變化[20]。pH的下降說明熱處理會(huì)抑制質(zhì)子醌的釋放和傳遞，加速氫離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。不僅如此，pH的維持能夠一定程度的保護(hù)類囊體膜中的熱耗散功能從而保護(hù)光合器官免受破壞[21]。如果植物的pH梯度不夠，不能保持一定的pH值，就不能耗散多余的熱量，影響光合器官即增加葉綠素的解離和降解[22-23]。

因此，上海青能夠維持較高的pH，在一定程度上保護(hù)了光合器官，減緩了葉綠素的解離與降解。然而菠菜體系由于pH的下降幅度更大，因此保護(hù)光和器官的效果相對(duì)較弱。

2.5 溫度對(duì)類囊體膜蛋白熒光的影響

蛋白質(zhì)變性過程中，芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露于水溶液中，其所處的環(huán)境極性逐漸增加，因此蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰的Amax最大吸收峰逐值漸增大，同時(shí)λmax最大吸收峰位置藍(lán)移的程度能夠反映出蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的程度。藍(lán)移的程度越大則能夠說明，蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的程度也越大。由附表可以看出，菠菜最大吸收峰位波動(dòng)幅度較上海青大，但最大峰值均出現(xiàn)先上升再下降的趨勢，說明加熱處理改變了類囊體膜上的蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)[24]。菠菜在80 ℃、上海青在90 ℃時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度下降，這說明熱處理對(duì)蛋白質(zhì)的破壞程度逐漸增強(qiáng)，使得類囊體膜的多肽組分發(fā)生了降解，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)組分和含量減少，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度的減弱。色氨酸的熱分解是分三步，首先脫去氨基和羧基，其次脫去乙基，最終是剩余物的完全熱氧降解。因此我們也可以認(rèn)為在80℃以上時(shí)進(jìn)行的是第三步的完全降解，最終導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的下降[25]。

附表 熱處理對(duì)類囊體膜溶液體系蛋白發(fā)射熒光光譜的影響(278nm)

注：λmax最大吸收峰位；Amax最大吸收峰值

3 結(jié)論

差式掃描微量熱儀的數(shù)據(jù)顯示上海青的類囊體膜熱穩(wěn)定性較菠菜的更強(qiáng)，即不同種類蔬菜的類囊體膜在物理性質(zhì)上存在差異，同時(shí)上海青和菠菜類囊體膜的多肽組分差異很大，這些多肽對(duì)溫度敏感，溫度越高多肽降解越顯著。加熱過程中上海青和菠菜的類囊體膜溶液的pH會(huì)逐漸下降，葉綠素蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)被破壞，使一部分蛋白質(zhì)的氨基酸殘基暴露出來，繼續(xù)加熱，會(huì)導(dǎo)致這種破壞的程度更大，從而使得蛋白質(zhì)的分解，與之對(duì)應(yīng)，葉綠素含量隨溫度的上升而下降。綜上所述，在加工過程中可以通過保持類囊體膜上的葉綠素蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性來調(diào)控加工綠色蔬菜顏色的劣變?！?/p>

[1]焦凌梅，袁唯.綠色蔬菜加工中護(hù)綠技術(shù)的研究及進(jìn)展[J]. 保鮮與加工，2004，4(1)：11-14.

[2]田風(fēng)霞，惠振，王國坤，等.植物體內(nèi)的葉綠素降解與滯綠突變體[J]. 植物生理學(xué)通訊，2010，46(5)：505-511.

[3]王敏，劉鄰渭.葉綠素及衍生物研究進(jìn)展與護(hù)綠工藝分析[J]. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001(3)：63-67.

[4]李現(xiàn)彪.綠色蔬菜加工中的護(hù)綠技術(shù)研究[J]. 鄉(xiāng)村科技，2016(5)：66-67.

[5]王玨琪.銅、鋅對(duì)蕨菜護(hù)綠復(fù)綠過程的影響及其含量變化研究[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[6]羅魏，劉學(xué)文，王毅，等.萵筍泡菜護(hù)綠護(hù)脆工藝研究[J]. 中國調(diào)味品，2011，36(6)：59、74.

[7]房媛，文星.苦苣菜護(hù)綠保脆工藝研究[J]. 應(yīng)用化工，2016，45 (2)：316-319.

[8]陳科偉.青花椒干燥時(shí)葉綠素的酶降解機(jī)理及其護(hù)色技術(shù)的研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2013.

[9]劉茜茜，張秀玲，程雪，等.三種刺五加護(hù)綠劑的復(fù)配優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)，2016，37(2)：51-54.

[10]盧然.類囊體膜“超級(jí)蛋白復(fù)合物”組成結(jié)構(gòu)的初步研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2011.

[11]王蓉蓉.高靜壓對(duì)菠菜綠色品質(zhì)影響的生理機(jī)制研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[12]Cramer W A，Whitmarsh J，Low P S.Differential scanning calorimetry of chloroplast membranes：identification of an endothermic transition associated with the water-splitting complex of photosystem II[J]. Biochemistry，1981，20(1)：157-162.

[13]韋司棋.低溫脅迫下鉬對(duì)冬小麥類囊體膜組分的影響[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，2009.

[14]Teng S S，Chen B H.Formation of pyrochlorophylls and their derivatives in spinash leaves during heating[J].Food Chemistry，1999(65)：367-373.

[15]Anelia G.Dobrikova，et al.Structural rearrangements in chloroplast thylakoid membranes revealed by differential scanning calorimetry and circular dichroism spectroscopy.Thermo-optic Effect[J]. Biochemistry，2003，42(38)：11272-11280.

[16]Hu Z H，Xu Y N，Jiang G Z，et al.Degradation and inactivation of photosystem I complexes during linear heating[J]. Plant Science，2004，166(5)：1177-1183.

[17]Avan L，Ooms V，Weemaes C，et al.Thermal and pressure-temperature degradation of chlorophyll in broccoli (Brassica oleracea L.italica)juice：a kinetic study.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，1999，46(12)：5289-5294.

[18]Lípová L，Krchňák P，Komenda J，et al.Heat-induced disassembly and degradation of chlorophyll-containing protein complexes in vivo[J]. Biochimica Et Biophysica Acta，2009，1797(1)：63-70.

[19]賈夏，李棟，魏阿寶.溫度和水分對(duì)存儲(chǔ)菠菜的葉綠素a、b的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(13)：106-109.

[20]Jenkins G I，Woolhouse H W.Photosynthetic electron transport during senescence of the primary leaves of phaseolus vulgaris l.：ii.The activity of photosystems one and two，and a note on the site of reduction of ferricyanide[J]. Journal of Experimental Botany，1981，32(5)：467-478.

[21]廖鐵.植物光合機(jī)構(gòu)能量耗散機(jī)理[D]. 上海：中科院上海生命科學(xué)研究院生理生態(tài)研究所，2004.

[22]Wraight C A，Kraan G P B，Gerrits N M.The pH dependence of delayed and prompt fluorescence in uncoupled chloroplasts.[J]. Biochimica Et Biophysica Acta，1972，283(2)：259-267.

[23]詹沛鑫.pH 值對(duì)加熱綠色蔬菜中葉綠素形成的影響——亨蓋特Lab色度法[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，1997(6)：50-52.

[24]周峰，華春，周泉澄，等.髙溫脅迫對(duì)菠菜類囊體膜蛋白亞基和光譜特征的影響[J]. 南京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，33(1)：98-101.

[25]丁富傳，蔣擁華.五種常見氨基酸的熱分解動(dòng)力學(xué)及熱穩(wěn)定性的研究[J].化學(xué)與生物工程，2003：20(21)：156-158.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Effects of Thermal Treatment on Stability of Thylakoid Membrane and Chlorophyll of Spinach andBrassicachinensis

FAN Chang-chang，XIONG Xin-xing，ZOU Ya-hong，YU Hao-yong，ZHANG Yan

(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University/National Engineering & Technology Center for Fruit and Vegetable Processing，Beijing 100083，China)

The deterioration of color in green vegetables is closely related to the stability of chlorophyll-protein complexes located in thylakoid membrane during processing and storage.We tested heat capacity，polypeptides，chlorophyll content，pH and protein emission spectra of thylakoid membrane solution in spinach andBrassicachinensisunder thermal treatment，it showed that thermal treatment would lead to the degradation of chlorophyll-protein complexes and decrease of pH in thylakoid membrane solution.Otherwise，thylakoid membrane ofBrassicachinensisis more thermal stable and the remaining ratio of chlorophyll content is higher than spinach.All these provide a theoretical basis to clarify the mechanism of green vegetable color deterioration and to find a better way to protect green.

thylakiod membrane; chlorophyll-protein complexes; thermal stability; chlorophyll

高靜壓加工綠色蔬菜顏色品質(zhì)變化的分子機(jī)制研究(項(xiàng)目編號(hào)：31271910)；加工綠色蔬菜中葉綠素蛋白復(fù)合體和葉綠素的降解與控制策略(項(xiàng)目編號(hào)：31571844)。

樊昶昶(1994— )，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

張燕(1977— )，女，博士，副教授，研究方向：果蔬加工技術(shù)理論與應(yīng)用。