培元膠囊對(duì)正常小鼠免疫功能的影響

汪光云 汪 寧 宣自華 楊 光 桂雙英 戴 敏 王 鍵

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)研究所,安徽 合肥 230031)

培元膠囊對(duì)正常小鼠免疫功能的影響

汪光云 汪 寧 宣自華 楊 光 桂雙英 戴 敏 王 鍵

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)研究所,安徽 合肥 230031)

目的 探討培元膠囊(PYC)對(duì)正常小鼠免疫功能的影響。方法 3批小鼠，每批60只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、培元膠囊高、中、低劑量組(劑量分別為3.6、1.8、0.9 g生藥/kg)。給藥組連續(xù)灌胃培元膠囊15 d，空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組分別以等量的生理鹽水和甘露聚糖肽代替。灌胃結(jié)束后，測(cè)定小鼠脾臟、胸腺指數(shù)，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力以及單核-巨噬細(xì)胞碳廓清指數(shù)。結(jié)果 培元膠囊各劑量組的正常小鼠的免疫器官臟器系數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組；培元膠囊中、高劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著高于空白對(duì)照組；培元膠囊各劑量組小鼠的吞噬系數(shù)顯著高于空白組(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 培元膠囊能增強(qiáng)正常小鼠的免疫功能。

培元膠囊；免疫功能

培元膠囊保健方是在新安醫(yī)家汪機(jī)“固本培元”的理論指導(dǎo)下，在其再傳弟子孫一奎“壯元湯”的基礎(chǔ)上擬方，強(qiáng)調(diào)補(bǔ)氣、補(bǔ)陰、生血、補(bǔ)脾胃，從整體上激活機(jī)體的防御系統(tǒng)〔1～4〕。本文觀察培元膠囊對(duì)正常小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 培元膠囊：安徽省中醫(yī)院制劑室制備。昆明種清潔級(jí)小鼠，雌雄各半，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司〔SCXK(蘇)2011-0003號(hào)〕提供，甘露聚糖肽片：廣東宏遠(yuǎn)集團(tuán)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；刀豆球蛋白(Con)A Sigma公司；MTT、二甲基亞砜 Sigma分裝，武漢生命技術(shù)有限公司；PBS緩沖液：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)杭州四季青公司；Hanks液、RPMI1640 賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；Na2CO3宜興市展望化工試劑廠；印度墨汁：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 Multiskan spectrum型酶標(biāo)儀、371型二氧化碳培養(yǎng)箱、Multifuge XLR型水平離心機(jī)(德國Thermo Scientific公司)；紫外可見光分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；DMI4000型倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Countstar IC1000型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Inno-Alliance Biotech Inc公司)；FA2004型電子精密天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

1.3 試驗(yàn)方法 3批昆明種小鼠，每批60只(18～22 g)，隨機(jī)分為：空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、培元膠囊高、中、低劑量組(3.6、1.8、0.9 g生藥/kg)，每組12只。實(shí)驗(yàn)組給小鼠灌胃不同劑量的培元膠囊,陽性對(duì)照組給予等量甘露聚糖肽溶液(3.9 mg/kg)，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水。每天1次,連續(xù)15 d。末次給樣1 h以后進(jìn)行各項(xiàng)免疫指標(biāo)的測(cè)定〔5〕。

1.3.1 臟器/體重比值測(cè)定 末次給樣1 h以后,稱重并處死小鼠,無菌取出胸腺和脾臟,用濾紙吸干表面血污，在電子天平上稱重,計(jì)算臟器/體重比值〔6～8〕。

1.3.2 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 小鼠脫頸椎處死后無菌取脾,置于盛有適量無菌Hanks液的平皿中，輕輕將其磨碎，用4層紗布過濾，制成單細(xì)胞懸液。用 Hanks 液將細(xì)胞懸液洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，然后將細(xì)胞懸浮于1 ml的完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。將每只實(shí)驗(yàn)小鼠的脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml，其中一孔加75 μl ConA液，另一孔作為對(duì)照，置于5% CO2、37℃CO2孵箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 ml，加入0.7 ml不含小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液，同時(shí)加入 MTT(5 mg/ml)50 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 ml DMSO，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，最后將24孔中液體以每孔3個(gè)復(fù)孔分裝于96孔培養(yǎng)板中，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，于570 nm波長處，測(cè)定每孔吸光度。淋巴細(xì)胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值D(570 nm)減去不加ConA孔的光密度值D(570 nm)表示〔9〕。

1.3.3 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn) 末次給樣后1 h經(jīng)尾靜脈給小鼠注射用生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁,每10 g體重注射0.1 ml墨汁注入后立即計(jì)時(shí),于注入后第2和第10分鐘分別從眼內(nèi)眥靜脈叢取血20 μl,加入到2 ml 0.1%Na2CO3溶液、搖勻,以Na2CO3溶液作空白對(duì)照,用半自動(dòng)生化儀測(cè)光密度值D(600 nm)將小鼠處死,取肝和脾臟,稱重,計(jì)算吞噬指數(shù)〔10〕。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠免疫器官臟器/體重比值比較 與空白對(duì)照組相比，培元膠囊各劑量組可顯著增加正常小鼠的脾臟及胸腺免疫器官的臟器系數(shù)(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠免疫器官指數(shù)的比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力比較 與空白對(duì)照組相比，培元膠囊中、高劑量組可顯著增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.3 各組小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清功能比較 與空白對(duì)照組相比,培元膠囊劑量為3.6、1.8 g/kg時(shí)，小鼠的吞噬系數(shù)有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、碳廓清功能比較

3 討 論

培元膠囊是在“固本培元”學(xué)說指導(dǎo)下，在孫一奎“壯元湯”的基礎(chǔ)上，通過文獻(xiàn)、臨床療效等調(diào)研、篩選確定處方組成，該方由人參、黃芪等中藥組成。孫一奎是我國明代著名醫(yī)學(xué)家，因善用參芪，歷代以來多以“溫補(bǔ)派”而備受推崇，他認(rèn)為人參、黃芪不僅補(bǔ)氣，亦能補(bǔ)血，不僅補(bǔ)陰，還能補(bǔ)陽〔11〕，其“固本培元”的“本”側(cè)重于腎，通過推動(dòng)腎間動(dòng)氣，即激發(fā)人體生命的原動(dòng)力，來抵御外邪，治療疾病。故孫一奎治療疾病多采用益氣藥與溫陽藥共用〔12〕。免疫系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)擔(dān)負(fù)免疫功能的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子構(gòu)成，它們是機(jī)體免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)〔13〕。胸腺是中樞免疫器官，脾臟是外周免疫器官，二者均是體內(nèi)的主要免疫器官，與體液免疫和細(xì)胞免疫均的功能有密切關(guān)系〔14〕。通過檢測(cè)胸腺和脾臟等臟器系數(shù)的大小可反映機(jī)體免疫水平的高低，本文中培元膠囊各劑量組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均有顯著升高，作為重要的免疫器官，胸腺與脾臟的重量增加，提示免疫功能的增強(qiáng)〔15,16〕。小鼠的脾細(xì)胞主要為免疫細(xì)胞，免疫增強(qiáng)劑能誘導(dǎo)其發(fā)生增殖反應(yīng)。MTT法則通過檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化而間接反映細(xì)胞增殖的程度，是機(jī)體重要的細(xì)胞免疫指標(biāo)〔17,18〕。本文提示培元膠囊對(duì)小鼠的免疫細(xì)胞及免疫功能有直接的調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞是免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有多種免疫功能，包括免疫防御，免疫監(jiān)視，免疫調(diào)節(jié)及抗原呈遞等〔19〕，通過吞噬作用清除體內(nèi)衰老損傷和凋亡細(xì)胞及免疫復(fù)合物和病原體等抗原性異物，因此單核吞噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一，單核吞噬細(xì)胞清除的速率可反映其吞噬功能〔20,21〕。本文顯示培元膠囊的劑量為3.6、1.8 g/kg時(shí)，可顯著提高小鼠吞噬指數(shù)，說明培元膠囊可以增強(qiáng)正常小鼠非特異性免疫功能。

1 項(xiàng)長生,汪幼一.固本培元派的形成和發(fā)展〔J〕.中華醫(yī)史雜志,2001;31(4):247-51.

2 童佳兵,楊 程,馬 嘯,等.基于新安醫(yī)學(xué)“固本培元”思想研究肺脹的設(shè)想〔J〕.中醫(yī)臨床雜志,2014;6(21):144-6.

3 王 鍵,馮立中.新安醫(yī)學(xué)主導(dǎo)明清中醫(yī)潮流〔N〕.健康報(bào)，2014-2-26(5).

4 王國仁,崔冬生.以汪機(jī)固本培元法擬固本益腸方治療脾虛泄瀉32例〔J〕.中醫(yī)藥臨床雜志,2012;24(7):647-8.

5 徐淑云,卞如濂,陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1420-60.

6 Huang R,Zhao M,Yang XF,etal.Effects of Prunella vulgaris on the mice immune function〔J〕.PLoS One,2013;8(10):e77355.

7 Haque R,Ansari SH,Rashikh A.Coffea arabica seed extract stimulate the cellular immune function and cyclophosphamide-induced immunosuppression in mice〔J〕.Iranian J Pharmaceut Res,2013;12(1):101-8.

8 孫秀娥,呂有權(quán),吳潤嬌,等.多年生藤本豆多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響〔J〕.食品科學(xué),2006;27(12):739-41.

9 俞 丹,趙 軍,劉 濤,等.瑣瑣葡萄多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響〔J〕.食品科學(xué),2010;31(9):229.

10 Gao HY,Li GY,Huang J,etal.Protective effects of Zhuyeqing liquor on the immune function of normal and immunosuppressed mice in vivo〔J〕.Comp Alter Med,2013;13(1):252.

11 王 鍵,黃 輝,蔣懷周.新安醫(yī)學(xué)系列講座(六)-新安固本培元派〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2013;28(8):2341-9.

12 張 倩,牛淑平.新安醫(yī)家汪機(jī)“孫一奎,固本培元”學(xué)術(shù)流派研究〔J〕.中醫(yī)學(xué)報(bào),2012;27(169)：697-9.

13 Good RA,Fernandes G,Yuins EJ,etal.Nutritional deficiency,immunologic function and disease〔J〕.Am J Pathol,1976;84(3):599-614.

14 張樹清,李小成,孫玉華.大豆低聚糖對(duì)小鼠體液免疫功能的影響試驗(yàn)研究〔J〕.微生物學(xué)雜志,2007;27(2):97-9.

15 宋媛媛,周 越,孫守兵,等.丁香苷對(duì)免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用〔J〕.中藥藥理與臨床,2013;29(2):43-6.

16 Offeer H,Subramanian S,Parker SM,etal.Experimental stroke induces massive,rapid activation of the peripheral immune system〔J〕.J Cerebral Blood Flow Metab,2006;26(5):654-65.

17 賈 寧,王 漢,鄭 晶.復(fù)方黨參提取物對(duì)環(huán)磷酰胺處理小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011;17(17):206-8.

18 侯粉霞,楊慧芳,魚 濤.脂多糖及伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)方法用于免疫毒性評(píng)價(jià)的可行性研究〔J〕.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病,2007;33(6):336-8.

19 張莘莘，李文娟，聶少平，等.黑靈芝多糖對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào),2010;26(9):1139-42.

20 熊評(píng)源,胡藝蘭,郭凱文,等.何首烏對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響〔J〕.藥學(xué)研究,2007;20(3):370-1.

21 尹 進(jìn),彭芝配,馬建中,等.松黃顆粒對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清及其抗體生成細(xì)胞的影響〔J〕.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006;26(2):10-1.

〔2016-01-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

Effect of Peiyuan capsule on normal mice immunologic function

WANG Guang-Yun,WANG Ning,XUAN Zi-Hua,etal.

Key Laboratory of Xin′an Medicine, Ministry of Education, Hefei 230031, Anhui, China

Objective To observe the immunomodulatory activity of Peiyuan capsule(PYC) in normal mice.Methods The mice were divided into 5 groups: normal control, positive control, PYC high, middle and low dose (3.6, 1.8, 0.9 g/kg) groups.Mice in drug groups were administrated intragastrically with PYC for 15 days. Mice in normal and positive control groups were given equal amount of saline and mannatide. After that, mice were examined for the data of immune organs weights, lymphocyte transformation capability and mononuclear macrophage phagorytosis function. Results The spleen index and thymus index in PYC groups were significantly increased than those of normal control group (P<0.05,P<0.01).The lymphocyte transformation capability in middle and high dose PYC groups were significantly stronger than those of normal control group (P<0.01). High and middle dose of PYC could significantly increase the mononuclear macrophage phagorytosis function than that of normal control group (P<0.05,P<0.01).Conclusions PYC can improve the immune function of normal mice.

Peiyuan capsule(PYC);Immune function

十二五科技支撐計(jì)劃 (No.2012BAI26B03)

汪 寧(1970-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效學(xué)與功能性評(píng)價(jià)研究。

汪光云(1989-)，男，碩士，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

R151.41

A

1005-9202(2017)09-2090-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.004