先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良1A型1例臨床與基因分析

江士遠(yuǎn) 向 娜

單縣海吉亞醫(yī)院兒科（山東單縣 274300）

先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良1A型1例臨床與基因分析

江士遠(yuǎn) 向 娜

單縣海吉亞醫(yī)院兒科（山東單縣 274300）

目的報(bào)道1例LAMA2基因變異導(dǎo)致先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良的臨床、實(shí)驗(yàn)室檢查及遺傳學(xué)特點(diǎn)。方法回顧分析1例先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良1A型患兒的臨床資料，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果患兒，男，5歲2個(gè)月，臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后，2歲時(shí)可獨(dú)坐，不能獨(dú)走；肌力及肌張力低下，早期出現(xiàn)關(guān)節(jié)攣縮。生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肌酸激酶（CK）升高（491 U/L），其同工酶CK-MB升高（41.8 U/L）；肌電圖提示肌源性損害可能；頭顱MRI提示大腦白質(zhì)異常信號(hào)?；驒z測(cè)發(fā)現(xiàn)LAMA2存在復(fù)雜雜合突變，c.2045-2046delAG雜合缺失，來(lái)自母親，為已報(bào)道的致病變異；exon5存在雜合缺失，來(lái)自父親，為未報(bào)道的新變異，軟件功能預(yù)測(cè)提示為致病性變異。結(jié)論LAMA2基因變異導(dǎo)致先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良，患兒以運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后起病，CK升高，高通量基因檢測(cè)有助于明確診斷。

先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良; 臨床特點(diǎn); 分子診斷

先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良（congenital muscular dystrophy，CMD）是一類(lèi)出生后早期起病、主要影響骨骼肌功能的疾病，不同的肌營(yíng)養(yǎng)不良雖有相似的臨床表型，但遺傳差異很大[1]。LAMA2基因突變導(dǎo)致的先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良1A型（congenital muscular dystrophy type 1A， MDC1A）又稱(chēng)merosin缺乏癥，是首先被分離出的一種肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，約占先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良的40%，屬于常染色體隱性遺傳病，歐美國(guó)家較多見(jiàn)[2，3]。MDC1A臨床表現(xiàn)為出生時(shí)或出生后不久出現(xiàn)肌張力低下、肌肉無(wú)力、運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩以及關(guān)節(jié)攣縮等癥狀，肌酶可有輕到中度升高，肌肉病理檢測(cè)可見(jiàn)肌營(yíng)養(yǎng)不良改變[4]?，F(xiàn)報(bào)告1例MDC1A，并對(duì)相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行復(fù)習(xí)，探討臨床表現(xiàn)以及基因檢測(cè)對(duì)診斷的重要性。

1 臨床資料

患兒，男，5歲2個(gè)月，足月剖宮產(chǎn)，母孕期及出生時(shí)未見(jiàn)異常，出生后喂養(yǎng)困難，2歲可獨(dú)坐，早期出現(xiàn)關(guān)節(jié)萎縮，至今不能獨(dú)走。就診時(shí)體格檢查：神清，眼距寬，鼻梁低，上下牙齒不合；雙側(cè)呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)稱(chēng)，未聞及啰音；心律齊，心音有力，心臟各聽(tīng)診區(qū)均未聞及雜音；腹軟，肝脾肋下未觸及；四肢肌力及肌張力均降低，膝腱反射未引出，病理反射（－）。實(shí)驗(yàn)室檢查：肌酸激酶（creatine kinase，CK）491 U/L（參考值25～195 U/L），肌酸激酶同工酶（creatinine kinase MB isoenzyme，CK-MB）41.8 U/L（參考值0～25 U/L）；肌電圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肌源性損害可能；頭顱MRI提示大腦白質(zhì)異常信號(hào)，主要累及側(cè)腦室前后角。根據(jù)以上表現(xiàn)患兒擬診為先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良1A型。其父母體健，非近親結(jié)婚，雙方家族中無(wú)類(lèi)似疾病史。

經(jīng)家屬知情同意以及醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核后，抽取患兒及其父母外周靜脈血2 mL，置EDTA抗凝管，利用基因組DNA提取試劑盒（AXYGEN公司）提取基因組DNA，并測(cè)定濃度。委托華大基因公司利用目標(biāo)區(qū)域序列捕獲法對(duì)患兒進(jìn)行高通量測(cè)序分析（先天肌營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的基因檢測(cè)包），測(cè)序深度為200×，測(cè)序后行相應(yīng)的軟件分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)患兒LAMA2基因存在c.2045-2046delAG雜合缺失（圖1），2個(gè)堿基缺失可導(dǎo)致基因所編碼的蛋白產(chǎn)生移碼突變即LAMA2蛋白在682位賴(lài)氨酸開(kāi)始產(chǎn)生移碼突變并在之后22位氨基酸處終止（p.Lys682fsX22）。

圖1 突變位點(diǎn)高通量測(cè)序reads比對(duì)圖

對(duì)突變結(jié)果進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。在LAMA2基因突變位點(diǎn)的兩端設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，利用PCR方法擴(kuò)增出含有突變位點(diǎn)的片段，其中25μL的PCR擴(kuò)增體系中含10 mmol Tris-HCl（pH 8.3），50 mmol KCl，1.5 mmol MgCl2，0.3 mmol dNTP，引物各200 pmol，Taq 1.0 U（東盛生物公司），在Bio-Rad PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共34個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)患兒存在c.2045-2046delAG雜合缺失，其母親也存在該位點(diǎn)突變，其父親未見(jiàn)異常，見(jiàn)圖2，說(shuō)明患兒該位點(diǎn)的異常遺傳自其母親。

圖2 c.2045-2046delAG測(cè)序圖

對(duì)高通量測(cè)序的結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，患兒LAMA2基因exon5測(cè)序深度較其他外顯子低，推測(cè)患兒LAMA2基因exon5可能存在雜合缺失。選取ACTB基因?yàn)閮?nèi)參利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常對(duì)照，患兒的exon5片段拷貝數(shù)降低了約50%，說(shuō)明患者LAMA2基因exon5存在雜合缺失，且患者父親亦存在該區(qū)域的雜合缺失（圖3），說(shuō)明患兒該區(qū)域的異常遺傳自其父親。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量exon5拷貝數(shù)

2 討論

CMD于1960年由日本學(xué)者福山首先報(bào)道?；純撼錾鷷r(shí)或出生后數(shù)月內(nèi)即出現(xiàn)肌力和肌張力低下及關(guān)節(jié)攣縮，肌活檢病理可見(jiàn)典型的肌營(yíng)養(yǎng)不良改變，其他臨床表現(xiàn)為脊柱后突、髖關(guān)節(jié)脫位、近端關(guān)節(jié)攣縮、斜頸等，后期運(yùn)動(dòng)能力變異很大，部分可以自由活動(dòng)，而嚴(yán)重者始終不能獨(dú)立行走[5]。該疾病主要分為福山型（Fukuyama type）和非福山型兩大類(lèi)，而非福山型又可分為merosin缺乏癥（MDC1A）、肌-眼-腦病（又稱(chēng)Santavouri?。?、Walker-Warburg綜合征、先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良合并脊柱強(qiáng)直綜合征以及Ullrich病等[3]。高通量測(cè)序技術(shù)又稱(chēng)下一代測(cè)序技術(shù)，能一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定。國(guó)內(nèi)外很多研究組利用該技術(shù)對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行遺傳學(xué)分析，如對(duì)杜氏/貝式肌營(yíng)養(yǎng)不良、無(wú)腦回畸形及肥厚型心肌病等疾病的致病基因的檢測(cè)[6-8]，研究結(jié)果均顯示高通量測(cè)序技術(shù)具有高通量、低成本以及高靈敏度的特點(diǎn)，適合致病基因不確定及基因較大疾病的檢測(cè)。目前已經(jīng)證實(shí)，多種基因突變與CMD發(fā)病相關(guān)[3]，因此本例患兒選擇與先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的致病基因panel進(jìn)行檢測(cè)。

研究發(fā)現(xiàn)，LAMA2基因突變與MDC1A的發(fā)病有關(guān)。該基因定位于6q22-23區(qū)域，包括65個(gè)外顯子，編碼Laminin-a2蛋白(又稱(chēng)merosin)[9]，基因突變的類(lèi)型包括無(wú)義突變、錯(cuò)義突變、缺失重復(fù)以及剪接位點(diǎn)的突變，目前文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD database）中記錄了約230多種LAMA2基因相關(guān)的突變。Merosin是一種糖蛋白，是異源三聚體復(fù)合物laminin-2和laminin-4的其中一條鏈，存在于橫紋肌細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)-肌肉接頭、皮膚以及滋養(yǎng)層等處，該蛋白參與細(xì)胞間的識(shí)別、細(xì)胞分化以及遷移等過(guò)程，對(duì)維持正常的血腦屏障功能、引導(dǎo)神經(jīng)元移行有重要意義[10]。Merosin有6個(gè)結(jié)構(gòu)域，與細(xì)胞外基質(zhì)的大分子結(jié)合，建立一個(gè)連接肌細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)的橋梁。LAMA2基因突變后，merosin蛋白功能缺陷，使得肌膜完整性破壞，導(dǎo)致MDC1A發(fā)生[11]。

本例患兒胎兒期及出生時(shí)未見(jiàn)異常，出生后喂養(yǎng)困難，2歲可獨(dú)坐，但至今不能獨(dú)行。實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)肌酸激酶及其同工酶均升高，肌電圖提示肌源性損害可能，磁共振顯示腦白質(zhì)異常信號(hào)。結(jié)合臨床表現(xiàn)患兒疑似先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良。不足之處是本例患兒未作肌肉活檢。基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患兒存在復(fù)雜雜合突變（c.2045-2046delAG，del Exon5），故患兒MDC1A診斷確立。通過(guò)文獻(xiàn)搜索及數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)發(fā)現(xiàn)del Exon5為未見(jiàn)報(bào)道的新突變。

綜上所述，MDC1A疾病起病較早，患兒出生時(shí)或出生后數(shù)月內(nèi)即出現(xiàn)肌力和肌張力低下和關(guān)節(jié)攣縮，肌活檢病理可見(jiàn)典型的肌營(yíng)養(yǎng)不良改變。高通量測(cè)序可高效的進(jìn)行遺傳突變分析，有助于進(jìn)一步明確診斷。

[1] B?nnemann CG, Wang CH, Quijano-Roy S, et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies [J]. Neuromuscul Disord, 2014, 24(4)：289-311.

[2] Muntoni F, Voit T. The congenital dystrophies in 2004： a century of exciting progress [J]. Neurmuscul Disord, 2004, 14(10)：635-649.

[3] Falsaperla R, Praticò AD, Ruggieri M, et al. Congenital muscular dystrophy： from muscle to brain [J]. Ital J Pediatr, 2016, 42(1)：78.

[4] 王碩，熊暉，羅靜. 一個(gè)先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良1A型家系的臨床、分子病理及遺傳學(xué)研究 [J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2010, 27(1)：13-17.

[5] Ismail S, Schaffer AE, Rosti RO, et al. Novel mutation in the fukutin gene in an Egyptian family with Fukuyama congenital muscular dystrophy and microcephaly [J]. Gene, 2014, 539(2)：279-282.

[6] Wang Y, Yang Y, Liu J, et al. Whole dystrophin gene analysis by next-generation sequencing： a comprehensive genetic diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy [J]. Mol Genet Genomics, 2014, 289(5)：1013-1021.

[7] Jumuar SS, Lam AT, Kircher M, et al. Somatic mutations in cerebral cortical malformations [J]. N Engl J Med, 2014, 371(8)：733-743.

[8] 劉旭霞，姜騰勇，樸春梅，等．目標(biāo)基因捕獲測(cè)序技術(shù)鑒定肥厚型心肌病致病突變的研究 [J]. 心肺血管病雜志, 2014, 33(4)：599-603.

[9] Turner C, Mein R, Sharpe C, et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy： a novel homozygous mutation in the laminin-2 gene [J]. J Clin Neurosci, 2015, 22(12)：1983-1985.

[10] Kanagawa M, Toda T. The genetic and molecular basis of muscular dystriphy： roles of cell-matrix linkage in the pathogenesis [J]. J Hum Genet, 2006, 51(11)：915-926.

[11] Holmberg J, Alajbegovic A, Gawlik KI, et al. Laminin-a2 chain-de fi ciency is associated with microRNA deregulation in skeletal muscle and plasma [J]. Front in Aging Neurosci, 2014, 6：155.

(本文編輯：蔡虹蔚)

Congenital muscular dystrophy type 1A: a report of one case with literature review

IANG Shiyuan，XIANG Na

(Department of Paediatrics，Shanxian Hygeia Hospital，Shanxian 274300，Shandong, China)

ObjectiveTo investigate the clinical features and genetic tests of a case with congenital muscular dystrophy type 1A (MDC1A).MethodsClinical data of proband were collected, and genetic change were tested using next generation sequencing, and literatures pertinent to the epidemiology, mechanisms, especially genetic testing of lisencephaly were reviewed.ResultsA 5 year and 2 month old boy present with normal intelligence and delayed motor development, he can be sit alone but not walk at two years old. Physical examination showed normal mental reaction, muscular dystrophy, hypotonia, and joint contracture at early age. From biochemical tests, we found creatine kinase (CK) and CK-MB were increased (491U/L, 41.8U/L). EMG test suggested possible muscle-derived damage. Brain MRI showed white matter abnormality. And a heterozygous mutation (c.2045-2046delAG) inherited from his mother in LAMA2 gene, and another novel heterozygous mutation (del Exon5) inherited from his father were identi fi ed by genetic test.ConclusionsLAMA2 gene de fi ciency can lead to MDC1A, and gene testing can help diagnosis.

congenital muscular dystrophy type 1A ; clinical features; genetic testing

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.05.012

2016-11-01)