雞白痢沙門氏菌分離株invA基因的克隆與序列分析

劉志科，張秋雨，楊寧寧，徐明國，陳創(chuàng)夫

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

0 引言

雞白痢沙門氏菌是一種革蘭氏陰性桿菌，是由沙門氏菌屬中的多種血清型的沙門氏菌引起禽類疾病的總稱[1]，多侵害20日齡以內(nèi)的雛雞和雛火雞，不形成芽孢，自然宿主為雞，不僅可以經(jīng)蛋垂直傳播，也可以通過水平傳播，發(fā)病率和死亡率較高，臨床上以病雞拉白色糊狀稀糞為主要特征，是養(yǎng)雞業(yè)中危害最嚴(yán)重的一種致病菌。近年來，雞由于感染雞白痢沙門氏菌引起的死亡不計(jì)其數(shù)，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問題，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)雞業(yè)和公共衛(wèi)生問題。據(jù)報(bào)道，在美國每年因感染沙門氏菌相關(guān)的疾病超過40 000例，死亡人數(shù)至少在400例以上，其發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)，備受各國關(guān)注[2]。而我國的細(xì)菌性食物中毒事件中，有75%左右都是由沙門氏菌感染引進(jìn)的，該菌是一種重要的食源性致病菌。1885年美國獸醫(yī)師Daniel Elmer Salmon首次從病豬中分離出沙門氏菌[3]，隨后在世界各地都陸續(xù)報(bào)道了該病的發(fā)生；而雞白痢沙門氏菌最早是在1899年，被Retgter發(fā)現(xiàn)引起禽白痢的雞白痢沙門氏菌，對(duì)該病的認(rèn)識(shí)和深入研究發(fā)揮了重要的關(guān)鍵作用；中國是在1974年前后發(fā)現(xiàn)了沙門氏菌[4]。查華等[5]在2010—2012年對(duì)我國華東地區(qū)主要養(yǎng)雞場(chǎng)的雞白痢沙門氏菌病進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該地區(qū)雞白痢沙門氏菌感染相當(dāng)嚴(yán)重，其D群為優(yōu)勢(shì)血清群，血清型差異變化大，并呈明顯的上升趨勢(shì)。因此，如何更有效的預(yù)防雞白痢沙門氏菌病的發(fā)生和了解該病的致病機(jī)理顯得尤為重要。

雞白痢沙門氏菌致病菌株侵襲動(dòng)物體內(nèi)的上皮細(xì)胞以后，可以通過細(xì)胞層到達(dá)下層組織，一部分被機(jī)體吞噬細(xì)胞所殺滅，另一部分存活的沙門氏菌仍在組織器官內(nèi)進(jìn)行生長繁殖，這些相關(guān)的因素構(gòu)成了沙門氏菌的主要侵襲力[6]。該菌的致病力由沙門氏菌的毒力島、黏附素、脂質(zhì)A和毒力因子（invA，invB，invC，invD）等所決定的，而這些毒力因子常常存在于染色體和質(zhì)粒上，在沙門氏菌入侵的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它們編碼的產(chǎn)物對(duì)于病原體在機(jī)體內(nèi)的定居或增值提供了有利的條件，從而可以引起機(jī)體損傷[7]。invA基因又稱侵襲蛋白，為高度保守的細(xì)胞膜整合蛋白，是沙門氏菌侵入動(dòng)物體內(nèi)的主要毒力因子，可以作為診斷雞白痢沙門氏菌的一個(gè)潛在的標(biāo)記物[8]；而invA基因包含了獨(dú)特的沙門氏菌保守序列，所產(chǎn)生的靶向區(qū)域可針對(duì)性的用于診斷雞白痢沙門氏菌，具有重要的檢測(cè)意義。多名研究學(xué)者已經(jīng)證實(shí)invA基因是一個(gè)高度保守的靶基因，存在于所有的沙門氏菌血清型當(dāng)中，被視為檢測(cè)雞白痢沙門氏菌病的一個(gè)重要的目標(biāo)基因[9-10]。鑒于此，本研究在前期對(duì)烏魯木齊周邊種雞場(chǎng)雞白痢沙門氏菌病的流行狀況進(jìn)行調(diào)查分析的基礎(chǔ)上對(duì)該地區(qū)主要流行株的invA基因，通過PCR方法進(jìn)行克隆測(cè)序和生物信息學(xué)分析，為該地區(qū)雞白痢沙門氏菌新疆株的遺傳特征以及后續(xù)的invA基因的功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

雞白痢沙門氏菌由本課題組與2017年6月采自新疆烏魯木齊周邊大型種雞場(chǎng)具有典型癥狀的病雞腸道內(nèi)容物和血液，通過平板凝集試驗(yàn)和免疫膠體金試紙條確診為雞白痢沙門氏菌病后，從腸道內(nèi)容物中分離出該菌，-20℃保存。

1.1.2 主要試劑

T-vector pMD19、2×ES Taq MasterMix、 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、EcoR V、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶和小量質(zhì)粒提取試劑盒等，均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞為石河子大學(xué)人畜共患病試驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的雞白痢沙門氏菌保守的invA基因序列（NC_003 198.1），利用Oligo 6.0軟件在其保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，其invAF：5'-CGGAATTCGTGCTGCTTTCTCTACT TAAC-3'；invAR：5'-CGCTCGAGCTCATTAATCAA CAATACGA-3'，并在其上游和下游引物的5'端分別插入酶切位點(diǎn)EcoR V和XhoⅠ，其預(yù)期目的片段擴(kuò)增大小為1 251 bp，引物由北京華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 細(xì)菌基因組的提取

取甘油管里保存的雞白痢沙門氏菌20μL，接種到20 mL的LB液體培養(yǎng)基里37℃搖床里過夜進(jìn)行擴(kuò)繁。之后，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明要求提取雞白痢沙門氏菌的基因組。最后，用核酸蛋白儀測(cè)定其濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 invA基因的擴(kuò)增與克隆

以雞白痢沙門氏菌的基因組為模板，PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2μL，2×ES Taq MasterMix 10μL，引物 invAF和invAR各0.4μL，dd H2O補(bǔ)足至20μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火40 s，72℃延伸70 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。取6μL的 PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。將目的片段切下按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書的要求進(jìn)行膠回收，其回收產(chǎn)物與T-vector pMD19在16℃的水浴下過夜連接，其連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中進(jìn)行克隆，用藍(lán)白板進(jìn)行篩選，將PCR鑒定為陽性的克隆菌，并提取質(zhì)粒，用EcoR V和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定；將酶切鑒定的疑似陽性質(zhì)粒送到生物工程（上海）科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.4 invA基因的生物信息學(xué)分析

利用MegAlig 7.0軟件將雞白痢沙門氏菌陽性質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株invA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)；并與GenBank中已公布的主要代表性的12株invA基因的核苷酸序列及其所對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；利用Mega 4.0軟件在此基礎(chǔ)上對(duì)invA基因的核苷酸序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，進(jìn)而得到該物種間invA基因的起源及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。采用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)服務(wù)器SOPMA上預(yù)測(cè)invA蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL同源模建invA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 invA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物invAF和invAR，以分離的雞白痢沙門氏菌的invA的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳得到大小約1 251 bp的目的片段（圖1），與預(yù)期的理論結(jié)果相符合。

圖1 新疆株invA基因的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果Fig1 The PCR amplified results of invA gene in Xin jiang strain

2.2 invA基因重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將膠回收產(chǎn)物與T-vector pMD19過夜連接后，獲得的重組質(zhì)粒pMD19-invA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)在1 251 bp大小處出現(xiàn)一條特異性的目的條帶；重組質(zhì)粒PMD19-T-invA經(jīng)EcoR V和XhoⅠ雙酶切后，分別在大約2 692 bp和1 251 bp處產(chǎn)生兩個(gè)條帶（圖2），與預(yù)期理論值大小一致。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考的基因序列（NC_003 198.1）比對(duì)相似性為99.8%。結(jié)果表明invA重組質(zhì)粒pMD19-invA構(gòu)建成功，獲得了invA基因的陽性克隆菌。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳結(jié)果Fig2 Double enzyme digestion of electrophoresis re sults of recombinant plasmid

2.3 分離株invA基因的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將新疆株的invA基因的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序后，經(jīng)SeqMan軟件進(jìn)行拼接后得到invA基因的全核苷酸序列。同源性比對(duì)結(jié)果表明，與GenBank中標(biāo)準(zhǔn)（NC_003 198.1）的雞白痢沙門氏菌invA基因序列的同源性達(dá)到99.8%，其氨基酸序列的相似性在99.7%；分離株的invA序列與食酸代爾夫特菌（NC_005 088.1）、銅綠假單胞菌（NC_007 100.1）、色素桿菌（NZ_LCWP01 000 015.1）、大腸桿菌（NC_011 751.1）、摩氏摩根菌（NC_020 418.1）、梨火疫病菌（NC_013 961.1）、耶爾森氏菌（NZ_CP011 078.1）、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（NC_008 800.1）、馬紅球菌（NC_004 854.1）和野生煙草（NW_017 671 775.1）的核苷酸同源性序列分別為24.9%、26.3%、54.0%、51.1%、43.1%、40.8%、27.8%、25.3%、25.4%和28.0%（圖3），其與各自所編碼的氨基酸序列的同源性為22.0%—76.8%（圖4）。

圖3 雞白痢沙門氏菌分離株i nvA基因與其他物種間的invA基因的核苷酸序列的同源性比較Fig3 The nucleotide homology analysis of Salmonella pullorum isolates of invA gene of strain with other species

圖4 雞白痢沙門氏菌分離株i nvA基因與其他物種間的invA基因的氨基酸序列的同源性比較Fig4 The amino acids homology analysis of Salmonella pullorum isolates of invA gene of strain other species

用MegAlig 7.0對(duì)invA基因的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其分離株與國內(nèi)外主要的11個(gè)物種的參考invA毒株進(jìn)行基因的分類單元間的分子進(jìn)化遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖5），分離株的invA基因與耶爾森氏菌參考株在同一個(gè)大的分支上，同源性比較高，親緣關(guān)系十分接近，相互間差異較小，與標(biāo)準(zhǔn)株的invA基因的遺傳距離最近，為平行進(jìn)化和同源基因。但需要指出的是，其分離株與野生煙草、食酸代爾夫特菌、馬紅球菌和銅綠假單胞菌的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，為獨(dú)立的一個(gè)分支結(jié)構(gòu)，在其進(jìn)化的過程中可能發(fā)生了一定的變異。

圖5 雞白痢沙門氏菌分離株與其他物種間invA基因序列的遺傳進(jìn)化樹分析Fig5 The phylogenetic tree analysis of Salmonella pullorum isolates of invA gene of strain other species

圖6 invA蛋白新疆分離株的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig6 The secondary structure prediction results of invA protein of isolate strain in Xinjiang

2.4 invA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA在線軟件服務(wù)器Prodiction分析結(jié)果（圖6），發(fā)現(xiàn)invA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組分中，α-螺旋占43.18%；β-折疊占25.35%；β-轉(zhuǎn)角占11.42%；無規(guī)則卷曲所占比例為20.06%，表明該蛋白屬于α型蛋白。利用SWISS-MODEL在線軟件服務(wù)器對(duì)新疆分離株雞白痢沙門氏菌invA蛋白與模板信息比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖7），該目的基因所編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，主要由α-螺旋和β-折疊組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)信息的結(jié)果相符合，可信度較高。

圖7 invA蛋白新疆分離株的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig7 The tertiary structure prediction results of invA protein of isolate strain in Xinjiang

3 討論

由于新疆的飲食習(xí)慣和民族風(fēng)情的特殊性，人們對(duì)雞肉的需求量呈直線上升趨勢(shì)，石河子、烏蘇和烏魯木齊等3個(gè)縣市又稱為新疆養(yǎng)雞業(yè)的“金山角”地區(qū)，而雞白痢沙門氏菌病給該地區(qū)的養(yǎng)禽業(yè)和食品行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)于雞白痢沙門氏菌病的流行病學(xué)知識(shí)的研究報(bào)道比較少。因此，本研究對(duì)于本地區(qū)雞白痢沙門氏菌病的防控和凈化具有重要的公共衛(wèi)生參考價(jià)值。在西方國家，雞白痢沙門氏菌病已基本消滅和控制，由于我國的養(yǎng)雞業(yè)起步較晚，技術(shù)相對(duì)落后，該病在我國的一些地區(qū)的爆發(fā)時(shí)有發(fā)生，其主要原因是飼養(yǎng)環(huán)境差、雞群密度大以及飼養(yǎng)人員的防控意識(shí)不強(qiáng)，或者缺乏專業(yè)的理論知識(shí)[11]。

invA基因具有檢測(cè)和預(yù)防雞白痢沙門氏菌感染的功能，是雞白痢沙門菌重要的毒力因子，決定細(xì)菌能否進(jìn)入動(dòng)物上皮細(xì)胞的關(guān)鍵因子，與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)[12-13]。唐夢(mèng)君等[14]人利用invA基因的保守區(qū)域，建立了一種用于檢測(cè)雞蛋中沙門氏菌的LAMP方法，其靈敏性為1.04×102cfu/mL，該方法的的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法的檢測(cè)結(jié)果一致；劉志科等[15]人利用沙門氏菌的靶基因建立了雞白痢沙門菌套式PCR方法，其靈敏度為102cfu/μL，與傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)方法的符合率為95%；周愛萍等[16]通過原核表達(dá)獲得了invA重組蛋白，并通過Werter blotting和間接ELISA方法，驗(yàn)證了該蛋白具有較好的免疫原性，為該蛋白制備免疫血清用于臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究采用常規(guī)PCR方法，以分離株的雞白痢沙門氏菌基因組為模板，成功擴(kuò)增出invA基因新疆株，并利用生物信息學(xué)知識(shí)進(jìn)行了分析，為研究雞白痢沙門氏菌invA基因缺失苗和invA蛋白抗原表位的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過克隆獲得了雞白痢沙門氏菌新疆株的invA基因，其大小為1 251 bp，共編碼417個(gè)氨基酸，利用MegAlig 7.0對(duì)分離株的invA基因序列與GenBank公布的雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株的核苷酸同源性達(dá)到了99.8%，與其他物種的基因序列同源性最高為54.0%；而與雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株invA基因所編碼的氨基酸同源性達(dá)到了99.7%，與不同物種的invA基因所對(duì)應(yīng)的氨基酸的同源性為22.0%—70.7%，說明該基因比較保守。通過繪制不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，該分離株與雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株的遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，色素桿菌次之，與野生野草的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，也進(jìn)一步說明該基因在進(jìn)化上相對(duì)保守；對(duì)invA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量占43.18%；β-折疊占25.35%；β-轉(zhuǎn)角占11.42%；無規(guī)則卷曲占20.06%；由于β-折疊＞5%，所以該蛋白為非分泌蛋白，性質(zhì)比較穩(wěn)定，這也為B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位的篩選起到了鋪墊作用；invA蛋白屬于α型蛋白，在蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中可能起到主要的作用，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白在細(xì)胞核和線粒體中的可能性較大；利用SWISS-MODEL在線軟件服務(wù)器對(duì)新疆分離株雞白痢沙門氏菌invA蛋白與模板信息進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，invA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和延伸鏈組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)利用invA基因作為診斷標(biāo)志物，對(duì)新疆烏魯木齊地區(qū)周邊幾個(gè)大型種雞場(chǎng)的雞白痢沙門氏菌病的流行情況進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果表明，該地區(qū)雞白痢沙門氏菌病的發(fā)生率為9.2%。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雖然該病的血清學(xué)種類比較繁多，但本地區(qū)的主要流行株為D1型，這可能是雞白痢沙門氏菌病的某些血清型當(dāng)時(shí)的抗體水平含量比較低，未能檢測(cè)到有效的抗體水平所造成的。

4 結(jié)論

本研究通過PCR方法獲得了新疆株invA基因，大小為1 251 bp，與雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株invA基因核苷酸的同源性為99.8%，與其他物種的核苷酸同源性為24.9%—54.0%；與標(biāo)準(zhǔn)株的invA氨基酸序列同源性為99.7%，與其它物種的氨基酸序列的相似性為22.0%—70.7%；進(jìn)而證實(shí)了該基因比較保守。invA蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和β-折疊為主，且該蛋白為非分泌蛋白。本研究為新疆部分地區(qū)雞白痢沙門氏菌invA基因的克隆、生物學(xué)功能研究以及雞白痢沙門氏菌病的防控奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為以invA蛋白為診斷抗原的快速檢測(cè)試紙條的開發(fā)提供了新的素材。

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