姜黃素類似物對(duì)Aβ25—35誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡的影響

李超++畢鵬翔++董妍++雷佳宇++袁曉環(huán)++郭艷芹

[摘要] 目的 研究姜黃素類似物H8對(duì)Aβ25-35（β-amyloid protein 25-35）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。 方法 CCK-8法檢測(cè)Aβ25-35及姜黃素類似物H8的細(xì)胞毒性，以Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞）建立AD細(xì)胞模型，并使用不同濃度的H8進(jìn)行干預(yù)，通過RT-qPCR法檢測(cè)各組凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)。 結(jié)果 H8在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)幾乎無細(xì)胞毒性，Aβ25-35具有明顯的細(xì)胞毒性并呈濃度依賴性，經(jīng)過H8干預(yù)后細(xì)胞存活率明顯升高，其中以20 μmol/L的H8作用最明顯（P<0.001）。經(jīng)過H8作用后能降低Aβ25-35誘導(dǎo)的Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)，升高Bcl-2 mRNA表達(dá)。 結(jié)論 姜黃素類似物H8能夠抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因，發(fā)揮抗凋亡作用。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素類似物；細(xì)胞凋亡；Caspase-3；Bcl-2；Bax

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）10-0001-04

Effects of curcumin analogues on cell apoptosis induced by Aβ25-35 in AD cell model

LI Chao BI Pengxiang DONG Yan LEI Jiayu YUAN Xiaohuan GUO Yanqin

Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of curcumin analogue H8 on the expressionof apoptosis-related genes Caspase-3， Bcl-2 and Bax in PC12 cells induced by Aβ25-35（β-amyloid protein 25-35）. Methods The cytotoxicity of Aβ25-35 and curcumin analogue H8 were detected by CCK-8. The AD cell model was established using PC12 cells （rat adrenal pheochromocytoma cells） induced by Aβ25-35 and the cells were treated with different concentrations of H8. The expression of Caspase-3， Bcl-2 and Bax mRNA were detected by RT-qPCR. Results H8 had almost no cytotoxicity in the experimental concentration range， while Aβ25-35 had obvious cytotoxicity and concentration-dependent. The cell survival rate was significantly increased after H8 intervention， among them， 20 μmol/L H8 was most significantly（P<0.001）. After treatment with H8 could reduce Aβ25-35-induced Caspase-3， Bax mRNA expression and increase Bcl-2 mRNA expression. Conclusion Curcumin analogues H8 can inhibit Aβ25-35-induced apoptosis-related genes， with anti-apoptotic effect.

[Key words] Curcumin analogues；Cell apoptosis；Caspase-3；Bcl-2；Bax

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，表現(xiàn)為認(rèn)知功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退和喪失[1]。AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，研究表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡在AD發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[2]。姜黃素（curcumin）是一種低分子量酚類化合物，提取于姜黃、郁金等姜黃屬植物的根莖中，藥理作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等多方面的藥理作用[3，4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。然而，姜黃素在體內(nèi)的生物活性低、代謝快、吸收少、生物利用率低，極大地限制了其應(yīng)用[5]。本實(shí)驗(yàn)以姜黃素為母體去掉其β-二酮基團(tuán)，設(shè)計(jì)了穩(wěn)定的、分子量更小的戊-1，4二烯-3-酮類似物（H8）。本研究利用Aβ25-35誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）建立AD細(xì)胞模型，觀察姜黃素及其類似物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響并觀察其中凋亡相關(guān)基因及蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的變化，闡明姜黃素類似物H8治療AD的可能機(jī)制，為研究和治療阿爾茨海默病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 藥品與試劑

DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（上海同仁化工DOJINDO）；Trizol（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國羅氏公司Roche）；PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）；SYBR Green熒光染料（美國羅氏公司Roche）；姜黃素類似物H8[本課題組合成其化學(xué)名稱為：（2E，5E）-2，5-雙亞芐基環(huán)戊酮，HPLC檢測(cè)純度為99.3%]；Amyloid β-Protein Fragment 25-35（美國Sigma，貨號(hào)A4559）。

1.2 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；超凈工作臺(tái)（德國ESCO）；PCR儀（德國Eppendorf公司）；分光光度計(jì)（美國Beckman公司）；熒光定量PCR儀（美國 ABI stepone）。

1.3 細(xì)胞

PC12細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞）購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.4 Aβ25-35配制方法

將1 mg Aβ25-35溶于943 μL三蒸水，配成1000 μmol/L母液，置于37℃培養(yǎng)箱孵育7 d，使之老化，分裝，于-20℃凍存。

2 實(shí)驗(yàn)方法及分組

2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12），為貼壁生長細(xì)胞，使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)[內(nèi)含10%胎牛血清及青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）]，于5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天細(xì)胞貼壁后換液，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)傳代，細(xì)胞傳代貼壁后呈梭型，并有較長的突觸，取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)Aβ25-35、H8的細(xì)胞毒性

PC12細(xì)胞按4000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的藥物。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、H8組、Aβ25-35組。H8組的濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，Aβ25-35組的濃度為0、1、5、10、20、40、80 μmol/L，藥物作用24 h后，觀察細(xì)胞存活情況，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，室溫下避光振蕩3 min后在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算Aβ25-35的IC50值。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。

2.3 姜黃素類似物H8對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型細(xì)胞活性的影響

根據(jù)方法2.2結(jié)果最終選擇40 μmol/L的 Aβ25-35為最適造模濃度。將處于對(duì)數(shù)期生長的PC12細(xì)胞按4000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL。第一孔為對(duì)照孔，第2～6孔分別加入含H8的培養(yǎng)基預(yù)處理2 h，使其終濃度分別為2.5、5、10、20、40 μmol/L，然后加入Aβ25-35使其終濃度為40 μmol/L，共處理24 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔同時(shí)設(shè)置4個(gè)副孔。藥物作用24 h后，觀察細(xì)胞存活情況，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，室溫下避光振蕩3 min后在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定OD值。

2.4 RT-qPCR檢測(cè)姜黃素及H8對(duì)Caspase-3、Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)期生長的PC12細(xì)胞按4×105/mL的密度接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分為五組：（1）空白對(duì)照組：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；（2）Aβ組：40 μmol/L Aβ25-35處理24 h；（3）低濃度H8+Aβ組：40 μmol/LAβ25-35+5 μmol/L H8；（4）中濃度H8+Aβ組：40 μmol/LAβ25-35+10 μmol/L H8；（5）高濃度H8+Aβ組：40 μmol/LAβ25-35+20 μmol/L H8。各實(shí)驗(yàn)組首先使用H8預(yù)處理細(xì)胞2 h，然后加入40 μmol/L Aβ25-35共處理22 h，24 h后收集細(xì)胞提取RNA，采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)，通過2-ΔΔCT計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，使用One-way ANOVA對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素類似物H8及Aβ25-35的細(xì)胞毒性

在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前，首先對(duì)姜黃素類似物H8及Aβ25-35的細(xì)胞毒性進(jìn)行考察，如表2所示：與對(duì)照組（DMSO）相比，不同濃度（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）的H8作用于細(xì)胞24 h后，均沒有引起明顯的細(xì)胞毒性，說明H8在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞幾乎無毒性。 表3示：Aβ25-35干預(yù)PC12細(xì)胞，藥物濃度為5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為（86.82±2.74）%，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨著Aβ25-35濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，當(dāng)Aβ25-35濃度增加到40 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率下降至（44.62±1.26）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。根據(jù)SPSS 16.0 軟件計(jì)算IC50值為39.6 μmol/L，故選擇40 μmol/L Aβ25-35為造模濃度。

3.2 H8對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型的影響

加入不同濃度的H8干預(yù)后觀察對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活性的影響。如表4所示：與對(duì)照組相比，Aβ組細(xì)胞存活率明顯下降（P<0.001）；與Aβ組相比，經(jīng)過10、20、40 μmol/LH8干預(yù)后細(xì)胞存活率明顯升高（P<0.001），其中20 μmol/L的H8作用最明顯。以上實(shí)驗(yàn)表明姜黃素類似物H8能抵抗Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，發(fā)揮保護(hù)作用，提高細(xì)胞存活率。

3.3 Aβ25-35與H8對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

按方法2.3 加入不同濃度的Aβ25-35培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化如封三圖1A所示：對(duì)照組細(xì)胞多呈梭型形，立體感強(qiáng)，細(xì)胞飽滿，折光度好，突觸較長，大多數(shù)具有小的突起，細(xì)胞密集，細(xì)胞碎片少。而經(jīng)過不同濃度的Aβ25-35作用下，細(xì)胞總數(shù)量相對(duì)變少，細(xì)胞胞體皺縮，突觸變短消失，貼壁性差，有脫壁漂浮現(xiàn)象，細(xì)胞碎片較多。隨著Aβ濃度越大，細(xì)胞的狀態(tài)越差，細(xì)胞碎片也越來越多。經(jīng)過不同濃度H8干預(yù)后細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞形態(tài)明顯得到改善（封三圖1B）。

3.4 姜黃素類似物H8對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

按方法2.4使用不同濃度的H8預(yù)保護(hù)2 h，除對(duì)照組外其他各組給予40 μmol/L Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RT-qPCR方法檢測(cè)H8對(duì)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。從表5中可以看出，與對(duì)照組相比，Aβ組的Bax、Caspase-3基因mRNA表達(dá)均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），Bcl-2基因的mRNA表達(dá)下降（P<0.001）；與Aβ組相比，H8低、中、高劑量組的Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)均下降（P<0.05或P<0.01或P<0.001），而Bcl-2基因的mRNA表達(dá)上升（P<0.05或P<0.01）。以上結(jié)果表明，Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞可使促凋亡基因Bax、Caspase-3表達(dá)升高、抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)降低，經(jīng)H8作用后可降低凋亡基因表達(dá)、增加抗凋亡基因表達(dá)，因此，H8具顯著的抗凋亡作用。

4 討論

阿爾茨海默病的病理特征為：細(xì)胞外異常淀粉蛋白（β-amyloid，Aβ）沉積形成的老年斑和細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化的Tau蛋白和微管形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)[6，7]，此外，還有因細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元和突觸的丟失[8]。Aβ是構(gòu)成SP的核心成分，也是神經(jīng)纖維纏結(jié)以及血管淀粉樣變性的生化基礎(chǔ)[9]。Aβ可以通過多種途徑引起促細(xì)胞凋亡因素增加和抗凋亡的因素減少，最終引起神經(jīng)元的變性、凋亡和壞死[10]。Horiuchi M等[11]研究發(fā)現(xiàn)，β淀粉蛋白過表達(dá)和過度沉積是神經(jīng)元功能障礙的觸發(fā)者，在大腦內(nèi)注射Aβ能夠使神經(jīng)元受損[12]。因此，拮抗Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是治療AD的一種方法。

姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用。但姜黃素在體內(nèi)的活性偏低、水溶性差、口服后體內(nèi)代謝過快和生物利用度低[5，13]，這主要是由于姜黃素結(jié)構(gòu)中β二酮結(jié)構(gòu)片段的不穩(wěn)定性所造成的[14，15]。本實(shí)驗(yàn)室通過化學(xué)合成方法設(shè)計(jì)了姜黃素類似物H8[化學(xué)名稱為：（2E，5E）-2，5-雙亞芐基環(huán)戊酮，純度為99.3%]，前期經(jīng)過HPLC檢測(cè)姜黃素類似物H8降解率低，并且穩(wěn)定性較好。

本實(shí)驗(yàn)以Aβ25-35誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12）建立AD細(xì)胞模型，觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度Aβ25-35作用于細(xì)胞后，細(xì)胞存活率逐漸下降，細(xì)胞形態(tài)明顯改變：細(xì)胞胞體皺縮，突觸變短消失，出現(xiàn)凋亡的表現(xiàn)，并呈劑量依賴性。經(jīng)過H8干預(yù)后細(xì)胞存活率明顯升高，細(xì)胞形態(tài)得到改善，其中以20 μmol/L的H8作用最明顯（P<0.001）。RT-qPCR方法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ作用于細(xì)胞后抗凋亡基因（Bcl-2 mRNA）表達(dá)降低，促凋亡基因（Bax mRNA）表達(dá)升高，使用H8干預(yù)后改善了這一現(xiàn)象，提示H8能在基因水平對(duì)抗Aβ引起的細(xì)胞凋亡。

綜上，由于姜黃素類似物H8能有效地抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，發(fā)揮抗凋亡作用，因此，深入研究和開發(fā)姜黃素類似物對(duì)阿爾茨海默病的治療和預(yù)防具有重要意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Reitz C，Brayne C，Mayeux R. Epidemiology of Alzheimer's disease[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine，2011，7（3）：137-152.

[2] Shimohama S. Apoptosis in Alzheimer's disease-an update[J]. Apoptosis，2000，5（1）：9.

[3] GAO S，DUAN X，WANG X，et al. Curcumin attenuates arsenic-induced hepatic injuries and oxidative stress in experimental mice through activation of Nrf2 pathway， promotion of arsenic methylation and urinary excretion[J].Food & Chemical Toxicology，2013，59（3）：739-747.

[4] Ghosh S，Banerjee S，Sil Pc. The beneficial role of curcumin on inflammation，diabetes and neurodegenerative disease：A recent update[J]. Food & Chemical Toxicology，2015，83：111-124.

[5] Burgos-Mor Ne，Calder N-Monta O Jm，Salvador J，et al. The dark side of curcumin[J]. International Journal of Cancer，2010，126（7）：1771.

[6] Sinha S. The role of beta-amyloid in Alzheimer's disease[J].Med Clin North Am，2002，86（3）：629-639.

[7] 李艷霞，曹夢(mèng)媛，李艷萌，等. 阿爾茨海默病中Tau蛋白與相關(guān)分子作用的探究[J]. 醫(yī)學(xué)研究與教育，2014， 31（3）：72-75.

[8] Ubhi K，Masliah E. Alzheimer's disease： recent advances and future perspectives[J]. Journal of Alzheimers Disease Jad，2013，33（Suppl 1）：S185.

[9] Tanzi Re. Twenty Years of the Alzheimers Disease Amyloid Hypothesis：A Genetic Perspective[J]. Cell，2005， 120（4）：545-555.

[10] 呂良，鐘振國. 阿爾茨海默病淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的研究進(jìn)展[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007，5（6）：517-519.

[11] Horiuchi M，Maezawa I，Itoh A，et al. Amyloid β1-42 oligomer inhibits myelin sheet formation in vitro[J]. Neurobiology of Aging， 2012，33（3）：499-509.

[12] Miguelhidalgo JJ，Vecino B，F(xiàn)ern Ndeznovoa L，et al. Neuroprotective role of S12024 against neurodegeneration in the rat dentate gyrus[J]. European Neuropsychopharmacology，1998，8（3）： 203-208.

[13] Mohanty C，Sahoo Sk. The in vitro stability and in vivo pharmacokinetics of curcumin prepared as an aqueous nanoparticulate formulation[J]. Biomaterials，2010，31（25）：6597-6611.

[14] Pulido-Moran M，Moreno-Fernandez J，Ramirez-Tortosa C，et al. Curcumin and Health[J]. Molecules，2016，21（3）：234.

[15] 劉佳，黃宇虹，王保和，等. 姜黃素類化合物體內(nèi)代謝途徑及其代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2015，30（12）：1553-1557.

（收稿日期：2017-02-26）