一測(cè)多評(píng)法測(cè)定大鼠腸溫孵液中意大利牛舌草4種成分的含量

稅國(guó)蓮， 滕 亮， 張文文， 馬桂芝

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011; 2第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830054)

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)是紫草科(Boraginaceae)牛舌草屬(AnchusaL.)多年生草木植物，具有調(diào)節(jié)異常黑膽質(zhì)[1]、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、心血管保護(hù)等藥理作用[2]。本課題組前期對(duì)意大利牛舌草進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，從其乙醇提取物中分離得到蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸、苦莓苷、咖啡酸、胡蘿卜苷、β-谷甾醇乙酸酯、β-谷甾醇等成分[3-4]，對(duì)其乙醇提取物抗缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用及機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明意大利牛舌草乙醇提取物可能通過干預(yù)平衡氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成和抗氧化應(yīng)激的酶系統(tǒng)來減少缺氧/復(fù)氧所致原代心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[5]。本研究建立大鼠腸溫孵液中意大利牛舌草主要成分(蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸)的高效液相色譜定量分析方法，并以蘆丁作為內(nèi)參物，測(cè)定蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的RCF，利用RCF進(jìn)行含量計(jì)算，并與外標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)QAMS法進(jìn)行可行性驗(yàn)證,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1儀器LC-20AB型高效液相色譜儀(日本島津公司),New Classic MF型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),Milli-Q型艾柯超純水儀(美國(guó)密理博公司),SK2510HP型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2試藥蘆丁(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-16031813，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%),山奈酚-3-O-蕓香糖苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-16041507，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.16%),水仙苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-16070407，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.99%),迷迭香酸(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-16040512，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.40%),乙腈、甲醇(美國(guó)Fisher公司，色譜純),水為超純水,其他試劑均為分析純。8個(gè)批次的意大利牛舌草提取物為新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3動(dòng)物雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，SPF級(jí)，新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(新)2016-0001，動(dòng)物使用許可證：SYXK(新)2016-0002，飼養(yǎng)環(huán)境：光照12 h/d，溫度(21±2)℃，濕度40%～45%，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.4藥材意大利牛舌草2015年1月購自新疆伊鼎輝煌生科技有限公司，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為紫草科意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1提取物的制備取意大利牛舌草干燥地上部分，去除沙石等雜質(zhì)，粉碎粉末過20目篩，用75%乙醇，料液比1∶20回流提取2次，每次2 h。取預(yù)處理好的聚酰胺濕法裝柱，將1 BV的20 mg/mL意大利牛舌草粗提物溶液，以2 BV/h的速度上樣，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，上樣后靜態(tài)吸附30 min，先用1 BV的蒸餾水除雜后，再用20 BV的70%乙醇分別以5 BV/h的速度洗脫，收集70%乙醇過柱液，減壓濃縮，冷凍干燥，即為意大利牛舌草提取物。

2.2溶液的制備方法

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取蘆丁對(duì)照品、山奈酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品、水仙苷對(duì)照品、迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，制得蘆丁濃度為106 μg/mL、山奈酚-3-O-蕓香糖苷濃度為101 μg/mL、水仙苷濃度為108 μg/mL、迷迭香酸濃度為389 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 K-R液的制備 分別稱取NaCl 6.66 g、KCl 0.37 g、MgCl20.22 g、Na2HPO40.59 g、NaH2PO40.047 g、葡萄糖1.98 g、NaHCO32.1 g、CaCl20.14 g用超純水定容至1 000mL，用1 mol/mL鹽酸調(diào)pH值至7.40，備用。

2.2.3 空白腸溫孵液的制備 分別取大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸腸段固定在尤斯灌流室兩室中間，在兩室中各加入5 mL已預(yù)熱的K-R緩沖液，溫孵1 h，于黏膜側(cè)取出溫孵好的空白腸溫孵液，同時(shí)補(bǔ)充5 mL已預(yù)熱的K-R緩沖液，維持漏槽條件，溫孵1 h后，于黏膜側(cè)取出孵好的空白腸溫孵液，合并2次液體即得空白腸溫孵液。

2.2.4 供試品溶液的制備 稱取意大利牛舌草提取物5 mg至5 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，得到濃度為1 mg/mL供試品儲(chǔ)備液。腸粘膜孵育5 min后，分別在粘膜側(cè)(供給池)加入5 mL 100 mg/mL的意大利牛舌草提取物溶液，漿膜側(cè)(接受池)加入5 mL已預(yù)熱的K-R緩沖液，分別于不同時(shí)間點(diǎn)于漿膜側(cè)取樣200 μL，4℃儲(chǔ)存，備用。

2.3樣品前處理精密量取腸溫孵液200 μL，加200 μL甲醇，渦旋混勻2 min，4℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液過濾，備用。

2.4外標(biāo)法方法學(xué)考察

2.4.1 色譜條件 Cromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～9 min，83%B→80%B；9～20 min，80%B→68%B；20～40 min，68%B→40%B；40～45 min，40%B→83%B)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)354 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL。在該色譜條件下，各目標(biāo)物質(zhì)與相鄰色譜峰分離度良好，見圖1-4。

圖14種目標(biāo)物質(zhì)混合對(duì)照HPLC色譜圖

圖2空白腸溫孵液HPLC色譜圖

( a蘆?。籦山奈酚-3-O-蕓香糖苷；c水仙苷；d迷迭香酸)

圖3空白腸溫孵液加混合對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖4給藥120min后的腸液HPLC色譜圖

(a蘆?。籦山奈酚-3-O-蕓香糖苷；c水仙苷；d迷迭香酸) (a蘆??；b山奈酚-3-O-蕓香糖苷；c水仙苷；d迷迭香酸)

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 mL至10 mL容量瓶，以甲醇為溶劑倍量稀釋，得到系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別量取1 mL系列濃度溶液至5 mL容量瓶中，用空白腸溫孵液稀釋得到蘆丁(0.08、0.16、0.33、0.66、1.32、2.65、5.30、10.60、21.20 μg/mL)，山奈酚-3-O-蕓香糖苷(0.08、0.16、0.32、0.63、1.26、2.52、5.05、10.10、21.10 μg/mL)，水仙苷(0.08、0.17、0.33、0.67、1.34、2.68、5.35、10.70、21.40 μg/mL)，迷迭香酸(0.30、0.61、1.22、2.43、4.86、9.73、19.45、38.90、77.80 μg/mL)的腸液樣品。按“2.3”項(xiàng)下操作，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別以腸溫孵液中4種成分的濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 分別精密量取高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定5 d，記錄峰面積，測(cè)定質(zhì)控樣品濃度，計(jì)算回收率、日內(nèi)精密度及日間精密度，見表2。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別量取高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液適量，按“2.4.2”項(xiàng)下方法配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，分別于處理后的0、2、4、6、8、10、12、14 h，按“2.4.1” 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析。14 h內(nèi)測(cè)得各目標(biāo)成分濃度RSD均<20%，表明樣品溶液進(jìn)行前處理后在14 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5提取回收率試驗(yàn) 分別量取高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液適量，按“2.4.2”項(xiàng)下方法配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，進(jìn)行5樣本分析，記錄各目標(biāo)成分峰面積(A)；取空白腸溫孵液，按”2.3”項(xiàng)下方法處理，分別量取高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液，用已處理好的空白腸溫孵液稀釋定容至刻度，使其質(zhì)量濃度與A組相同。按“2.4.1” 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行5樣本分析，得到各成分峰面積(B)，以A/B計(jì)算提取回收率并求出RSD值。試驗(yàn)結(jié)果表明4種成分的提取回收率在80%～120%，RSD值均<20%，符合分析方法學(xué)的要求，見表3。

表1 4種成分線性范圍及檢測(cè)限(n=5)

表2 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

表3 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.5一測(cè)多評(píng)法量取“2.2.1” 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL置5 mL容量瓶，用空白腸溫孵液稀釋定容至刻度，按“2.3” 項(xiàng)下方法處理，按“2.4.1” 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣2、4、8、12、16、20 μL，測(cè)定各成分峰面積和保留時(shí)間。以蘆丁為內(nèi)參物，根據(jù)相對(duì)校正因子計(jì)算公式fi/s=fi/fs=(Ai/Ci)/(As/Cs)(其中Ai為待測(cè)成分i的峰面積，Ci為待測(cè)成分i的濃度，As為內(nèi)參物的峰面積，Cs為內(nèi)參物s的濃度)，相對(duì)保留值計(jì)算公式RRT=Ti/Ts(其中Ti為某待測(cè)成分保留時(shí)間，Ts為內(nèi)參物保留時(shí)間)分別計(jì)算山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸與內(nèi)參物蘆丁之間的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留值，見表4。

表4 相對(duì)校正因子(RCFs)、相對(duì)保留值(RRT)測(cè)定結(jié)果

注：a 蘆?。籦 山奈酚-3-O-蕓香糖苷；c 水仙苷；d 迷迭香酸

2.6一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果比較稱定意大利牛舌草提取物5 mg至5 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，得到濃度為1 mg/mL供試品儲(chǔ)備液。分別精密量取各批次供試品溶液1 mL至5 mL容量瓶，用空白腸溫孵液稀釋定容至刻度，按“2.3” 項(xiàng)下方法處理，按“2.4.1” 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣。采用ESM法測(cè)定8個(gè)批次的大鼠腸溫孵液中意大利牛舌草提取物主要成分蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的平均含量分別為14.20、15.88、9.80、66.90 mg/g。在線性范圍內(nèi)，蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的RCF分別為0.983、1.101、0.843。利用RCF計(jì)算得山奈酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的平均含量分別為15.67、9.87、67.44 mg/g，見表5。

表5 QAMS法與ESM法測(cè)定大鼠腸溫孵液中意大利牛舌草4種成分含量(mg/g)

3 討論

一測(cè)多評(píng)法是利用中藥化學(xué)成分間內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，在只采用1個(gè)對(duì)照品(價(jià)廉、易得者)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分(昂貴、難得者)同步測(cè)定的方法。是一種適合中藥特點(diǎn)的多成分定量方法，特別適用于對(duì)照品難得或不穩(wěn)定的情況[6]。從2006年對(duì)單味藥中同一類化學(xué)成分的研究開始，該方法已成功運(yùn)用于梔子[7]等藥材以及杜麻顆粒[8]等復(fù)方制劑的含量測(cè)定。在2010年版《中國(guó)藥典》一部[9]中，已經(jīng)收錄運(yùn)用QAMS法測(cè)定黃連中生物堿的含量。在2015年版《中國(guó)藥典》一部[10]中，新增了運(yùn)用QAMS法測(cè)定丹參以及生姜中目標(biāo)成分的含量。

蘆丁是意大利牛舌草中的含量較高的成分之一，化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，對(duì)照品來源有保障且價(jià)廉易得，故選作內(nèi)參物，能更好地體現(xiàn)一測(cè)多評(píng)法低成本、易操作的特點(diǎn)。迷迭香酸在測(cè)定過程中易降解，其含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯下降，其含量下降可能是因光照而發(fā)生分解[11]，因此試驗(yàn)過程中應(yīng)避光處理，且樣品前處理后應(yīng)立即測(cè)定。色譜峰定性時(shí)，可采用相對(duì)保留值法和保留時(shí)間差法對(duì)待測(cè)組分的色譜峰進(jìn)行定位，試驗(yàn)中2種方法均能準(zhǔn)確定位色譜峰，但相對(duì)保留值法是目前綜合效果最好，應(yīng)用最廣泛的定性方法。故本試驗(yàn)采用相對(duì)保留值法定位色譜峰。

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