十全育真湯對H22荷瘤小鼠免疫功能的影響*

朱云超， 詹光杰， 袁德培， 楊付明， 黃 瓊

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 恩施 445000)

十全育真湯對H22荷瘤小鼠免疫功能的影響*

朱云超△， 詹光杰， 袁德培， 楊付明， 黃 瓊

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 恩施 445000)

目的：研究十全育真湯對荷瘤小鼠免疫功能的影響，探討十全育真湯抗腫瘤的作用機制。方法：SPF級雄性昆明種小鼠30只，制成荷H22小鼠肝癌細(xì)胞移植瘤模型，隨機分為模型組、陽性對照組及十全育真湯組(n=10)；另選擇未接種小鼠10只為正常對照組。正常對照組、模型組每天按10 ml/kg灌胃生理鹽水及蒸餾水，陽性對照組、十全育真湯組每天按8 g/kg、18 g/kg灌胃參一藥液(80 mg/ml)與十全育真湯劑。連續(xù)給藥14 d后處死小鼠，測量胸腺、脾臟指數(shù)及抑瘤率，檢測外周血中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞含量及T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8細(xì)胞百分比，血清中白細(xì)胞介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及干擾素-β(IFN-β)的含量，淋巴細(xì)胞增殖能力及NK細(xì)胞殺傷功能。結(jié)果：較正常對照組，十全育真湯組小鼠體重明顯增加，脾臟指數(shù)顯著增大(P<0.05)；白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞CD4、CD8、CD3及TNF-α含量明顯升高(P<0.05)； IL-2、IFN-β含量顯著下降(P<0.05)；淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞殺傷功能明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，十全育真湯組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)顯著增大(P<0.05)；白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞CD3、 CD4、IL-2、IFN-β及TNF-α含量明顯升高(P<0.05)，CD8含量則顯著降低(P<0.05)；NK細(xì)胞殺傷功能及淋巴細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.05)。結(jié)論：十全育真湯可促進H22荷瘤小鼠免疫器官的生長，增強機體免疫功能，有利于腫瘤機體的恢復(fù)。

十全育真湯；H22荷瘤小鼠；免疫

【DOI】 10.12047/j.cjap.5380.2017.012

十全育真湯出自張錫純的代表作《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》治陰虛勞熱方篇[1]。由野臺參、生黃芪、生山藥、知母、玄參、生龍骨、生牡蠣、丹參、三棱及莪術(shù)組成，此方曾治療多種慢性病、虛損病并多獲良效。本研究觀察十全育真湯對荷瘤小鼠免疫功能的影響，探討十全育真湯抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明種雄性小鼠，7周，體重(24.6±1.7)g，購自湖北省實驗動物研究中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2008-0005]。

1.2 實驗藥品與儀器

小鼠肝癌系H22細(xì)胞購自上海博谷生物科技有限公司，參一膠囊購自吉林亞泰股份公司，CCK-8(cell proliferation and cytotoxiciuy Assay kit)購自碧云天生物技術(shù)公司，刀豆蛋白A(ConA)與四甲基偶氮哇鹽(MTT)購自美國Sigma公司，PE標(biāo)記抗小鼠CD3、CD8、FITC標(biāo)記抗小鼠CD4熒光抗體及紅細(xì)胞裂解液及溶血素購自美國Beckman公司，白細(xì)胞介素-2(interleukin 2，IL-2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及干擾素-β(interferon-β，IFN-β)檢測試劑盒購自南京建成生物制品研究所，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純試劑購自湖北恩施樂之塬科技公司)。精密電子天平(上海天平儀器廠)，全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，低溫冷凍離心機(美國Beckman公司)、流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)、MCO-18AIC37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋機電株式會社)。

1.3 十全育真湯煎液

十全育真湯由野臺參12 g、生黃芪12 g、生山藥12 g、知母12 g、玄參12 g、生龍骨12 g(搗細(xì))、生牡蠣12 g(搗細(xì))、丹參6 g、三棱4.5 g及莪術(shù)4.5 g組成，煎液由湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院藥劑科提供，相當(dāng)于生藥30%(2 g/ml)的液體,瓶裝密封消毒貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動物造模、分組及給藥

瘤源動物為H22細(xì)胞在小鼠體內(nèi)傳代3次，于最末次傳代7 d后的腹水小鼠，選擇狀態(tài)好、腹水多的小鼠抽取3 ml腹水，顯微鏡下血細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞數(shù)約為2.0×108cells/ml。取1 ml腹水用滅菌生理鹽水配成細(xì)胞懸液，鏡下細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×107cells/ml作為接種用瘤液。精確稱量30只SPF級雄性昆明種小鼠，75%乙醇對左腋下消毒，皮下注射接種用瘤液0.2 ml[5，6]，制成荷H22小鼠肝癌細(xì)胞移植瘤模型。接種24 h后將小鼠隨機分為模型組、陽性對照組及十全育真湯組(n=10)，另選擇未接種小鼠10只為正常對照組。正常對照組、模型組每天按10 ml/kg分別灌胃生理鹽水及蒸餾水，陽性對照組、十全育真湯組每天按8 g/kg、18 g/kg灌胃參一藥液(80 mg/ml)與十全育真湯劑。各組自由飲食，連續(xù)給藥14 d[7]。

1.5 小鼠一般行為學(xué)觀察，胸腺、脾臟指數(shù)及抑瘤率的測定

每日給藥前觀察并記錄各組小鼠體重、精神、活動、飲食及毛色等情況。末次給藥24 h后精確稱量各組小鼠，75%乙醇消毒，眼眶取血后斷頸處死，小心取出腫瘤組織、胸腺、脾臟，放入冰凍生理鹽水沖洗拭干，迅速用精密分析天平稱取重量，測定胸腺、脾臟指數(shù)[胸腺、脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g)]與抑瘤率(1-給藥組腫瘤質(zhì)量/模型組腫瘤質(zhì)量×100%)。

1.6 外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群檢測

先于進樣管中加入20 μl熒光抗體，然后加入100 μl抗凝血，低速離心靜置15 min，加入稀釋的溶血素450 μl，稍稍低速離心后靜置10 min，用流式細(xì)胞儀對白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞進行分析[6]。取100 μl小鼠EDTA抗凝血于流式細(xì)胞檢測管中，分別加入用PE標(biāo)記抗小鼠CD3、CD8及用FITC標(biāo)記抗小鼠CD4熒光抗體各2 μl，充分混勻，避光反應(yīng)15 min后加入100 μl紅細(xì)胞裂解液，混勻充分反應(yīng)12 min，然后再分別加入1 ml PBS，1 000 r/min離心6 min，取上層液體加入0.5 ml PBS后流式細(xì)胞儀檢測分析T淋巴細(xì)胞亞群[8]。

1.7 ELISA法檢測血清中IL-2、TNF-α及IFN-β含量

小心收集小鼠血液于無內(nèi)毒素、熱原的促凝管中，4℃，10 000 r/min離心15 min， -20℃保存?zhèn)溆谩Ｑ逯蠭L-2、TNF-α及IFN-β含量檢測參考試劑盒說明書采用雙抗體夾心ELISA法。

1.8 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力及NK細(xì)胞殺傷功能的檢測[9]

無菌條件下小心將脾臟放于離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液中研磨，將懸有淋巴細(xì)胞的分離液轉(zhuǎn)移到另外離心管中，加入RPM1640培養(yǎng)基1 ml，2 000 r/min離心12 min。吸出淋巴細(xì)胞層，經(jīng)培養(yǎng)基洗滌后1 200 r/min離心15 min，最后用RPM1640將細(xì)胞濃度調(diào)至2×106cells/ml備用。脾淋巴細(xì)胞增殖能力檢測：取100 ml脾淋巴細(xì)胞懸液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并加入100 μl濃度為10 μg/ml的ConA置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，然后加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后檢測每孔吸光度。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)功能檢測：把制備好的脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞(2×106cells/ml)，靶細(xì)胞為處于對數(shù)生長期的YAC-1細(xì)胞(1×105cells/ml)，用臺盼藍(lán)檢測活細(xì)胞數(shù)，每個樣品在96孔板上設(shè)3個復(fù)孔，各孔加入細(xì)胞懸液50 μl。另外設(shè)6孔，分別加入100 μl單純靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后每孔加入MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔加入150 μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩混勻12 min后酶標(biāo)儀檢測，并計算NK細(xì)胞活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 十全育真湯對荷瘤小鼠一般行為學(xué)，胸腺、脾臟指數(shù)及抑瘤率的影響

模型組小鼠在后期飲食量顯著減少、毛色差、無光澤，其它各組則無明顯改變；精神狀況模型組小鼠在后期呈現(xiàn)出萎靡不振、不活潑，其它各組小鼠則活潑、精神狀況良好，僅陽性對照組與十全育真湯組各有一只小鼠精神萎靡不振。十全育真湯對小鼠體重(增量)、胸腺、脾臟指數(shù)及抑瘤率的影響如表1所示，較正常對照組，模型組與十全育真湯組體重增量明顯增大；陽性對照組與十全育真湯組脾臟指數(shù)顯著增大(P<0.05)。與模型組相比，正常對照組小鼠體重增加量要明顯低于模型組(P<0.05)，其它二組則無顯著性差異；陽性對照組、十全育真湯組胸腺、脾臟指數(shù)顯著增大(P<0.05)。陽性對照組、十全育真湯組都能顯著影響小鼠的腫瘤增長，抑瘤率陽性對照組要高于十全育真湯組。

2.2 十全育真湯對小鼠外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群的影響

外周血經(jīng)細(xì)胞流式儀檢測，白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞數(shù)量及CD3、CD4及CD8的百分比。較正常對照組，模型組、陽性對照組及十全育真湯組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞CD4及CD8含量均顯著升高，陽性對照組及十全育真湯組CD3含量明顯升高(P<0.05，表2)；與模型組比較，正常對照組、陽性對照組及十全育真湯組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞CD3含量，陽性對照組及十全育真湯組CD4含量明顯升高(P<0.05)，CD8含量則顯著降低(P<0.05，表2)。

GroupWeightbeforedrugdelivery(g)Weightexcisdtumorafteradministration(g)Weight(g)Thymusindex(mg/g)Spleenindex(mg/g)Tumorinhibitionrate(%)Normalcontrol25.86±2.1332.58±3.854.25±0.823.35±1.315.13±0.92-Model25.45±2.2430.18±5.784.87±0.68*2.57±1.146.82±2.32-Positivecontrol25.28±2.5431.75±4.064.59±1.423.41±1.45*#15.12±4.38*#51.43Shiquanyuzhentang26.08±2.3131.24±4.384.98±1.83*3.35±1.38*#14.68±4.46*#46.37*

*P<0.05vsnormal control group；##P<0.05vsmodel group

GroupLeukocytes(×109/L)Lymphocyte(×109/L)CD3(%)CD4(%)CD8(%)Normalcontrol8.24±0.786.51±0.6934.7±1.717.5±1.28.1±1.5*Model4.31±0.76*3.08±1.23*30.8±1.4*21.1±1.5#18.3±0.6Positivecontrol5.91±0.94*#4.89±0.63*#46.1±2.5*#32.9±2.7*#11.6±1.3*#Shiquanyuzhentang5.53±0.81*#4.68±0.56*#45.8±2.2*#31.4±2.1*#10.8±0.8*#

*P<0.05vsnormal control group；##P<0.05vsmodel group

2.3 十全育真湯對小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-β含量的影響

ELISA法檢測外周血中IL-2、TNF-α及IFN-β含量。較正常對照組，陽性對照組與十全育真湯組IL-2、IFN-β含量顯著下降，TNF-α含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，正常對照組、陽性對照組及十全育真湯組IL-2、IFN-β含量都有顯著增加(P<0.05)，正常對照組TNF-α含量明顯降低，十全育真湯組TNF-α含量明顯升高(P<0.05，表3)。

GroupIL-2(pg/ml)TNF-α(μg/ml)IFN-β(pg/ml)Normalcontrol81.74±14.651.11±0.1851.46±2.67Model65.61±4.13*1.53±0.21*40.35±4.21*Positivecontrol73.22±9.71*#1.73±0.24*45.35±3.43*#Shiquanyuzhentang72.63±10.97*#2.19±0.16*#44.74±3.52*#

IL-2: Interleukin 2; TNF-α: Tumor necrosis factor α; IFN-β: Interferon-β

*P<0.05vsnormal control group；##P<0.05vsmodel group

2.4 十全育真湯對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力及NK細(xì)胞殺傷功能的影響

小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力及NK細(xì)胞殺傷功能的檢測。較正常對照組，陽性對照組與十全育真湯組淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞殺傷功能明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，正常對照組、陽性對照組及十全育真湯組NK細(xì)胞殺傷功能顯著增加(P<0.05)，正常對照組淋巴細(xì)胞增殖能力明顯降低，陽性對照組與十全育真湯組淋巴細(xì)胞增殖能力明顯升高(P<0.05，表4)。

GroupLymphocytes(A)NKcell(%)Normalcontrol0.44±0.1453.11±22.18Model0.51±0.23*41.53±20.21*Positivecontrol0.92±0.11*#75.73±14.24*#Shiquanyuzhentang0.83±0.09*#67.19±13.16*#

*P<0.05vsnormal control group；##P<0.05vsmodel group

3 討論

大多數(shù)抗腫瘤化學(xué)藥物由于缺少選擇作用，患者在接受放療、化療的同時，機體免疫系統(tǒng)也受到不同程度的損傷。腫瘤的發(fā)展與機體的免疫能力息息相關(guān)，腫瘤會影響機體的免疫功能，同時機體的免疫力對腫瘤又有抑制作用[8,10]。提高機體的免疫功能，增強機體自身抗腫瘤免疫反應(yīng)在治療腫瘤中極為重要[9]。中藥配合治療腫瘤，不僅可以減輕不良反應(yīng)，治療效果也有明顯提升，這對加強中藥在抗腫瘤機制方面的基礎(chǔ)研究具有重要意義[11，12]。十全育真湯為張氏治陰虛勞熱方，張氏認(rèn)為虛勞之因在于氣血遲滯，治虛勞必先治血痹，據(jù)此擬定十全育真湯[3]。此方具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀之功，虛瘀同治、補消兼?zhèn)?，切合腫瘤在不斷發(fā)展的同時，伴隨明顯的機體免疫功能下降的病理特點。

目前認(rèn)為細(xì)胞免疫是機體抗腫瘤的主要免疫機制，體液免疫協(xié)同，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答起著至關(guān)重要的作用。T 淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+及CD8+細(xì)胞是機體重要的免疫調(diào)控細(xì)胞[13，14]，當(dāng)免疫功能失衡時CD3+、CD4+及CD4+/CD8+細(xì)胞水平會下降，CD8+細(xì)胞增多有利于腫瘤細(xì)胞的生長[15]。IL-2能激活、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，參與體液免疫，通過促進T細(xì)胞的增殖與分化而產(chǎn)生抗腫瘤作用，還調(diào)節(jié)NK細(xì)胞，促進IFN-β等淋巴因子的分泌增強抗腫瘤活性；TNF-α在機體內(nèi)正常情況下濃度較低，通過激活NF-κB或JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控肝細(xì)胞，具有抑制腫瘤增殖的作用，是目前發(fā)現(xiàn)抗腫瘤作用最強的細(xì)胞作用因子；IFN-β具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、提高NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷水平，血清中IFN-β水平可作為評價機體抗腫瘤效應(yīng)的指標(biāo)[9，16]。機體抗腫瘤免疫反應(yīng)中淋巴細(xì)胞也是極為重要，淋巴細(xì)胞的增殖是評價其抗腫瘤功能的指標(biāo)，NK細(xì)胞作為抗腫瘤免疫中早期發(fā)揮作用的細(xì)胞，可直接殺死腫瘤細(xì)胞[9]。

本實驗結(jié)果表明十全育真湯可不同程度提高H22荷瘤小鼠CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量，減少CD8+細(xì)胞數(shù)量。有文獻報道CD3+細(xì)胞減少及功能的下降還可導(dǎo)致IL-2分泌的減少[17]。本實驗也發(fā)現(xiàn)H22荷瘤小鼠CD8+、CD3+細(xì)胞的減少及增多是顯著的，IL-2含量與CD3+細(xì)胞的改變呈正相關(guān)，表明十全育真湯可以通過改善脾臟微環(huán)境來協(xié)調(diào)T細(xì)胞亞群失衡及免疫功能下降的問題，對平衡免疫功能有較好的作用。實驗研究結(jié)果還顯示出十全育真湯對H22荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的殺傷功能增殖顯著，刺激機體分泌IFN-β。表明十全育真湯可激活淋巴細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞損傷NK細(xì)胞有較好的保護作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強機體抗腫瘤能力是有效的。

綜上所述，十全育真湯對H22荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)有較好保護作用，能增強機體的免疫功能，提升抗腫瘤能力，有利于促進腫瘤機體的恢復(fù)。

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Effects of Shiquanyuzhentang on immunologic function of H22tumor-bearing mouse

ZHU Yun-chao△， ZHAN Guang-jie， YUAN De-pei， YANG Fu-ming， HUANG Qiong

(School of Medical Science, HuBei University for Nationalities， Enshi 445000， China)

Objective: To investigate the effects of Shiquanyuzhentang (Traditional Chinese Medicine) on the immunologic function of tumor-bearing mice and its mechanism of antitumor. Methods: Thirty SPF grade male Kunming mice transplanted with H22hepatocellular carcinoma were divided into three groups randomly：model group，positive control group and Shiquanyuzhentang group(n=10). Another 10 mice were selected as normal control group. Normal control group and model group received normal saline and distilled water supplementation by 10 mL/kg everyday. Positive control group and Shiquanyuzhentang group received Shengyi(80 mg/ml)and Shiquanyuzhentang decoction at the doses of 8 g/kg and 18 g/kg respectively everyday. After 14 days of continuous administration, the mice were killed and the thymus, spleen index, tumor inhibition rate，peripheral blood leukocytes，lymphocyte content，cell percentage of T cell subsets CD3, CD4, CD8，interleukin 2(IL-2)in serum，tumor necrosis factor-α(TNF-α)，interferon β (IFN-β) content，lymphocyte proliferation ability and NK cell were measured. Results: Compared with normal control group, the weight of mice and thymus and spleen index of the Shiquanyuzhentang group were increased significantly(P<0.05)；leukocyte and lymphocyte CD3、CD4、CD8 and TNF-α were increased greatly(P<0.05)，IL-2 and IFN-β were decreased significantly(P<0.05). Compared with model group，thymus and spleen index of Shiquanyuzhentang group were increased significantly(P<0.05)；leukocyte and lymphocyte CD3、CD4、IL-2、IFN-β and TNF-α of Shiquanyuzhentang group were increased significantly(P<0.05)，CD8 content was decreased significantly(P<0.05)；NK cell and lymphocyte proliferation were increased significantly(P<0.05). Conclusion: Shiquanyuzhentang can promote the growth of immune organs in mice bearing H22, enhance immune function and is beneficial to the recovery of tumor body.

Shiquanyuzhentang； H22tumor-bearing mouse； immunity

國家中醫(yī)藥管理局公共衛(wèi)生專項資金項目(財社〔2010〕91號)；湖北民族學(xué)院博士科研啟動基金項目(MY2010B004)

2015-11-17 【修回日期】2016-10-25

R285.5

A

1000-6834(2017)01-051-05

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