超聲引導(dǎo)下細針穿刺聯(lián)合細胞蠟塊免疫組化及基因檢測在診斷肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的價值

田海英 徐海苗 楊琛 趙惠琤 王立平 徐棟

·經(jīng)驗交流·

超聲引導(dǎo)下細針穿刺聯(lián)合細胞蠟塊免疫組化及基因檢測在診斷肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的價值

田海英 徐海苗 楊琛 趙惠琤 王立平 徐棟

目的探討超聲引導(dǎo)下細針穿刺聯(lián)合細胞蠟塊免疫組化及基因檢測對老年肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的臨床應(yīng)用價值。方法選取85例肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（共95個淋巴結(jié)），采用超聲引導(dǎo)下細針穿刺獲得標本，行細胞學(xué)涂片檢查，同時制作細胞蠟塊行免疫組織化學(xué)和基因檢測。結(jié)合隨訪結(jié)果分析兩種檢查方法的臨床應(yīng)用價值。結(jié)果85例患者共穿刺95個淋巴結(jié)，超聲引導(dǎo)細針穿刺診斷淋巴結(jié)陽性率為44.8%（30/67），組織學(xué)正確分類比例為37.3%（25/67），淋巴結(jié)陰性率為55.2%（37/67），穿刺成功率為70.5%（67/95）。聯(lián)合細胞蠟塊切片行免疫組織化學(xué)檢查后，淋巴結(jié)陽性率為77.4%（72/93），組織學(xué)正確分類比例為59.1%（55/93），淋巴結(jié)陰性率為22.6%（21/93），穿刺成功率為97.9%（93/95）。兩種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。37例肺腺癌細胞蠟塊樣本中22例行表皮生長因子受體基因突變檢測，16例突變陽性，突變率72.7%。結(jié)論超聲引導(dǎo)下細針穿刺聯(lián)合細胞蠟塊免疫組化診斷肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移簡單實用，可提高臨床診斷準確率。

超聲檢查；肺癌；鎖骨上淋巴結(jié)；細胞蠟塊；組織學(xué)

肺癌是目前危害人類健康最常見的惡性腫瘤，其中80%～90%為非小細胞肺癌［1］，而鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肺癌常見的轉(zhuǎn)移方式。肺癌發(fā)生鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認為是N3期，外科手術(shù)的遠期獲益不明顯［2］。目前臨床上有部分患者在原發(fā)灶病理組織獲取方面出現(xiàn)困難，主要原因是病灶較小或位置靠近肺組織外周，纖支鏡或CT定位下難以獲取有效組織成分，從而無法進行免疫組化和基因檢測。對于這部分患者如發(fā)現(xiàn)有鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則可在超聲引導(dǎo)下行細針穿刺并制作細胞蠟塊。本研究通過在超聲引導(dǎo)下行鎖骨上淋巴結(jié)細針穿刺并制作細胞蠟塊，結(jié)合免疫組化和基因檢測，探討其對肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床價值。

資料與方法

一、臨床資料

選取2014年1月至2016年4月浙江省腫瘤醫(yī)院收治的85例肺癌患者，其中男63例，女22例，年齡49～85歲，平均（62.68±9.13）歲，60歲以上老年患者占76.5%，所有患者臨床病理資料完整。85例患者共95個淋巴結(jié)，結(jié)節(jié)最大直徑為4～19mm，平均（8.19±3.18）mm。

二、儀器與試劑

1.儀器：使用GELogiq E 9彩色多普勒超聲診斷儀，9L-D線陣探頭和ML6-15D探頭，頻率9～15MHz。

2.試劑及抗體：免疫組織化學(xué)染色的相關(guān)抗體購自上海基因公司。表皮生長因子受體（EGFR）試劑盒購自廈門艾德公司。

三、方法

1.細針穿刺：患者去枕取平臥位，對鎖骨上可疑轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)行多軸位掃查，確定結(jié)節(jié)大小，選擇進針位置。常規(guī)對鎖骨上區(qū)域局部皮膚進行消毒后，在超聲引導(dǎo)下避開大血管、氣管及周圍神經(jīng)等重要組織，沿淋巴結(jié)長軸經(jīng)皮刺入淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)，保持針管內(nèi)持續(xù)負壓，反復(fù)旋轉(zhuǎn)抽吸并進行多點多方向提插，抽取10～15次，直至所需標本進入針頭柄及針管后去負壓退針（圖1）。

圖1 超聲引導(dǎo)下細針穿刺示意圖

2.涂片制作及細胞學(xué)診斷：將針管內(nèi)的穿刺標本均勻涂布于載玻片上，立即置入95%乙醇，固定15min后行常規(guī)巴氏染色，顯微鏡下觀察并做出細胞學(xué)診斷。

3.細胞蠟塊制作：將針管內(nèi)剩余樣本注射至10%中性福爾馬林10m l中固定30～60min以上，2000 r/min，離心5m in，沉淀后棄上層清液，沉淀物瓊脂凝集成塊，濾紙包裹，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，厚4μm連續(xù)切片10張以上行HE染色并在顯微鏡下觀察［3］。

4.免疫組織化學(xué)染色：每例樣本的細胞蠟塊切片同時進行ALK（D5F3）（＋）、ALK-NC（-）、ROS1（-）、c-Met（＋＋，80%）、CK7（＋）、Napsin A（＋）、P40（-）、P63（-）、TTF1（＋）及CK5/6（-）等10項免疫組織化學(xué)染色，采用Lab Vision公司生產(chǎn)的Labvision Autostainer720型自動免疫組織化學(xué)染色，Envision法，處理過程與一般的組織學(xué)檢查相同［3］。

5.EGFR檢測：確認為肺腺癌的細胞蠟塊樣本采用突變特異性擴增系統(tǒng)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法進行EGFR基因突變的檢測。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，率的比較行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、穿刺時間和并發(fā)癥情況

所有患者均穿刺成功，穿刺時間不超過10min，未出現(xiàn)血腫、感染、食管氣管損傷及神經(jīng)損傷等并發(fā)癥。

二、超聲引導(dǎo)細針穿刺與聯(lián)合細胞蠟塊免疫組化診斷結(jié)果比較

95個淋巴結(jié)超聲引導(dǎo)細針穿刺常規(guī)涂片及聯(lián)合細胞蠟塊診斷結(jié)果比較見表1和圖2。其中，常規(guī)涂片取材成功67個，超聲引導(dǎo)細針穿刺診斷淋巴結(jié)陽性率為44.8%（30/67），組織學(xué)正確分類比例為37.3%（25/67），淋巴結(jié)陰性率為55.2%（37/67），穿刺成功率為70.5%（67/95）。超聲引導(dǎo)聯(lián)合細胞蠟塊取材成功93個，免疫組織化學(xué)檢查后，淋巴結(jié)陽性率為77.4%（72/93），組織學(xué)正確分類比例為59.1%（55/93），淋巴結(jié)陰性率為22.6%（21/93），穿刺成功率為97.9%（93/95）。兩種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 肺腺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細針穿刺病理圖

三、細胞蠟塊EGFR基因檢測

本研究22例確診為肺腺癌病例的細胞蠟塊切片采用突變特異性擴增系統(tǒng)法行EGFR基因突變檢測，其中16例突變陽性，突變率72.7%。EGFR突變陽性患者均采用靶向藥物治療。

討論

目前組織學(xué)檢查雖然是鎖骨上淋巴結(jié)病變公認的診斷標準，但多需采用外科手術(shù)切除或粗針穿刺獲取組織學(xué)標本［4］，對鎖骨上淋巴結(jié)的初始診斷而言，患者難以接受。為解決這一問題，本院超聲科開展了超聲引導(dǎo)下細針穿刺聯(lián)合細胞蠟塊免疫組化檢查。

常規(guī)超聲引導(dǎo)下淋巴結(jié)穿刺活檢在診斷淋巴結(jié)疾病中有著重要作用，超聲定位引導(dǎo)穿刺活檢可實時監(jiān)控穿刺針頭，避開重要血管和神經(jīng)組織，具有安全、微創(chuàng)及可重復(fù)性高的特點［5］。有研究［6］顯示，超聲聯(lián)合超聲定位引導(dǎo)穿刺活檢對腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準確性和特異性均較高。在超聲引導(dǎo)下，穿刺針可對常規(guī)超聲認為可疑的腫大淋巴結(jié)進行標本采集，并可根據(jù)標本質(zhì)量實時調(diào)整穿刺次數(shù)，為診斷提供更多信息。同時穿刺操作者可通過二維超聲選擇最佳進針路徑，并在穿刺過程中盡量避開大血管和神經(jīng)，減少對組織的損傷，以及大出血等并發(fā)癥的發(fā)生，較外科手術(shù)切除或粗針穿刺創(chuàng)傷更小，降低了操作難度，有利于臨床推廣應(yīng)用。

細胞蠟塊免疫組化檢查是一種介于涂片細胞學(xué)和病理組織學(xué)之間的一種有效的臨床診斷方法［7－9］，利用細針穿刺標本呈現(xiàn)局部組織病理學(xué)形態(tài)，細胞蠟塊切片中細胞數(shù)量豐富而且相對集中，為進行免疫組織化學(xué)染色后分子病理學(xué)檢測提供了良好的樣本平臺。近年來，許多獲批的抗癌藥物均為靶向治療藥物，在給藥前對患者進行特定基因突變的篩查，能夠使部分患者獲得最大的治療益處。而目前臨床對于肺癌選擇用藥的重要依據(jù)是明確組織學(xué)類型，尤其是區(qū)分小細胞肺癌和非小細胞肺癌。對于非小細胞肺癌臨床要求進一步區(qū)別鱗癌和腺癌，并提供與藥物使用相關(guān)的分子病理學(xué)檢測結(jié)果，然而目前超過70%的肺癌確診依賴小活檢和細胞學(xué)樣本［10－11］。本研究對85例臨床懷疑肺癌卻無法獲取原發(fā)灶組織病理的患者在超聲引導(dǎo)下行鎖骨上可疑腫大淋巴結(jié)細針穿刺，結(jié)合細胞蠟塊免疫組化做出了明確診斷及分型，避免了更高風(fēng)險的其他侵襲性活檢，必要時對部分患者進行了EGFR基因檢測，為臨床的靶向治療及預(yù)后評估等方面提供了依據(jù)。

本研究顯示應(yīng)用超聲引導(dǎo)下細針穿刺聯(lián)合細胞蠟塊免疫組化及基因檢測有較高的臨床推廣價值：①超聲引導(dǎo)下細針穿刺在一定程度上有效避免了高風(fēng)險的侵襲性活檢及不必要的外科手術(shù)，對大血管周圍或1 cm以下的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)更具優(yōu)勢；②超聲引導(dǎo)下穿刺具有微創(chuàng)、可重復(fù)取樣的優(yōu)點，適用范圍廣，尤其適用于晚期老年患者，對于氣道阻塞及上腔靜脈綜合征引起端坐呼吸的患者同樣適用；③隨著臨床需求不斷提高，如精確定性分型、藥物敏感及預(yù)后相關(guān)性的各類分子檢測項目的廣泛應(yīng)用，細針穿刺結(jié)合細胞蠟塊技術(shù)逐漸成熟和廣泛應(yīng)用；④超聲引導(dǎo)下細針穿刺聯(lián)合細胞蠟塊可最終明確病理診斷和疾病分期，為制定治療方案及評估預(yù)后提供了依據(jù)，提高了臨床的治療水平。

綜上所述，超聲引導(dǎo)下的多點多方向針吸細胞學(xué)檢查診斷準確率高、安全性好，穿刺靶點、穿刺針及血管在超聲圖像下可清晰顯示，對于明確頸部腫大淋巴結(jié)性質(zhì)有重要的應(yīng)用價值，可作為診斷的首選方法。超聲引導(dǎo)下細針穿刺聯(lián)合細胞蠟塊免疫組化不僅為臨床提供診斷依據(jù)，更為臨床的靶向治療及預(yù)后評估等方面提供了有力證據(jù)。

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V alue of ultrasound－guided fine－needle aspiration cell blocks immunohistochem istry and gene detection in diagnosis of metastatic supraclavicular lym ph nodes in lung cancer

TIANHaiying，XUHaimiao，YANGChen，ZHAOHuicheng，WANGLiping，XUDong
DepartmentofUltrasound，t he Second ClinicalMedicalCollege，Zhejiang ChineseMedicalUniversity，Hangzhou 310053，China

ObjectiveTo investigate the clinical value of ultrasound－guided fine－needle aspiration combined with cell block immunohistochemical and gene testing in the elderly patients with supraclavicular lymph nodemetastasis of lung cancer.MethodsEight-five patientswith supraclavicular lymph nodemetastasis of lung cancerwere collected（95 lymph nodes）.Using ultrasound－guided fine－needle aspiration，the specimenswere obtained cytological smears，and alsomade into cell block for immunohistochemical and genetic testing.Combined with follow－up results，the diagnosis of cytological smearsand cell block immunohistochemicalwere retrospectively analyzed and compared.ResultsA total of 95 lymph nodeswere punctured in 85 patients，the positive rate of lymph node s diagnosis was 44.8%（30/67）by ultrasound-guided fine-heedle aspiration，histological correct classification ratewas37.3%（25/67），the negative rate of lymph node s was55.2%（37/67），and the success rateofpuncturewas70.5%（67/95）.Combinedwith immunohistochemistry，the positive rate of lymph node s diagnosis was77.4%（72/93），the histological correct classification rate was 59.1%（55/93），the negative rate of lymph node s was 22.6%（21/93），and the success rate of puncture was97.9%（93/95）.The differencebetween the twomethodswasstatistically significant（P＜0.05）.37 casesof lung adenocarcinoma cellblock samples in 22 casesof EGFR genemutation detection，16 cases ofmutation－positive，mutation rate was 72.7%.ConclusionThe diagnosis of supraclavicular lymph nodemetastasis in lung cancer is simple and practicalunder the ultrasound－guided fine－needleaspiration combined with cellblock immunohistochemical.Italso can improve the clinicaldiagnosis rate.

Ultrason ography；Lung cancer；Supraclavicular lymph node s；Cellblock；Histology

R734.2；R445.1

A

2016-07-16）

310053杭州市，浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院超聲醫(yī)學(xué)科（田海英）；浙江省腫瘤醫(yī)院病理科（徐海苗），超聲科（楊琛、趙惠琤、王立平、徐棟）

徐棟，Email：xudnj＠163.com