南繁區(qū)稻瘟病菌遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的AFLP分析

朱名海 皮磊 舒燦偉 周而勛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642；*通信聯(lián)系人，E-mail:exzhou@scau.edu.cn)

南繁區(qū)稻瘟病菌遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的AFLP分析

朱名海 皮磊 舒燦偉 周而勛*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642；*通信聯(lián)系人，E-mail:exzhou@scau.edu.cn)

【目的】為了明確南繁區(qū)稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的遺傳分化情況，【方法】采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)南繁核心區(qū)(三亞、樂(lè)東和保亭)和非核心區(qū)(瓊中、屯昌和定安)共60個(gè)稻瘟病菌菌株的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析?！窘Y(jié)果】聚類分析表明，幾乎所有菌株都聚在同一個(gè)譜系里，并且該譜系沒(méi)有明顯的亞群；群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，核心區(qū)群體的多態(tài)性位點(diǎn)百分率、Shannon信息指數(shù)和基因流分別為87.89%、0.2738和4.2897，高于非核心區(qū)群體的81.37%、0.2703和3.5892；然而，核心區(qū)群體的Nei基因多樣性指數(shù)和基因分化系數(shù)分別為0.1657和0.1044，低于非核心區(qū)群體的0.1662和0.1223。【結(jié)論】這些結(jié)果表明核心區(qū)和非核心區(qū)菌株都存在豐富的遺傳多樣性，不同群體間均存在較多的基因交流，但遺傳變異均主要來(lái)自群體內(nèi)；相比之下，核心區(qū)菌株的遺傳多樣性和遺傳分化程度較高。

南繁區(qū)；稻瘟病菌；遺傳多樣性；群體遺傳結(jié)構(gòu)；AFLP

南繁區(qū)，即國(guó)家南繁育種基地，位于我國(guó)海南島，是指科研人員利用海南省(瓊)的三亞市、陵水縣、樂(lè)東縣和保亭縣(南繁核心區(qū))以及瓊中縣、屯昌縣和定安縣(南繁非核心區(qū))等地區(qū)優(yōu)異的光溫條件和生物生態(tài)資源進(jìn)行作物品種的繁育工作的地區(qū)，是我國(guó)最具影響力的農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)基地，有“中國(guó)種業(yè)科技硅谷”之美譽(yù)[1,2]。

稻瘟病是一種常見(jiàn)的世界性水稻真菌病害，在水稻的各個(gè)生長(zhǎng)階段均能發(fā)生，菌源、水稻品種抗性、栽培管理和氣候條件等因素是影響該病發(fā)生和危害的主要因素，如遇抗性差的品種且條件適宜，病情會(huì)迅速蔓延，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)率超過(guò)50%，甚至導(dǎo)致絕收[3,4]。稻瘟病的病原菌是稻巨座殼菌[Magnaporthe oryzae(Hebert)Barr,無(wú)性態(tài)為稻梨孢Pyricularia oryzae Cav.]，該菌是一種單倍體絲狀子囊菌，能夠侵染包括水稻在內(nèi)的眾多禾本科植物。當(dāng)前，培育抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效且綠色環(huán)保的手段，但由于稻瘟病菌的種群結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜性和易變性，致使很多抗病品種在大面積種植多年后失去抗性[5,6]。因此，對(duì)該菌進(jìn)行遺傳多樣性研究，了解其演變規(guī)律和分布動(dòng)態(tài)，對(duì)抗病品種的合理選育和利用具有重要指導(dǎo)意義。

自分子標(biāo)記技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，各種類型的標(biāo)記技術(shù)在稻瘟病菌(M.oryzae)遺傳多樣性研究上發(fā)揮了巨大的應(yīng)用價(jià)值，主要有RFLP[7]、RAPD[8]、SSR[9]、AFLP[10-12]以及rep-PCR[13]指紋技術(shù)等。其中，AFLP是一種既可靠又高效的分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、DNA用量少、檢測(cè)效率高、重復(fù)性高、對(duì)DNA模板濃度變化不敏感等優(yōu)點(diǎn)[14,15]。Taheri等[10]采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)收集自伊朗的55個(gè)稻瘟病菌和烏拉圭的32個(gè)稻瘟病菌的遺傳變異情況進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)伊朗菌株和烏拉圭菌株的遺傳相似系數(shù)大于78%，證明兩地菌株之間存在基因交流現(xiàn)象。Masoud等[11]利用AFLP DNA指紋圖譜對(duì)分離自伊朗水稻和其他雜草上的梨孢菌(Pyricularia spp.)進(jìn)行了親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFLP標(biāo)記可以將分離自不同寄主的菌株區(qū)分開來(lái)；其中，分離自狗尾草(Setaria sp.)的菌株與分離自水稻的菌株親緣關(guān)系最近，分離自馬唐(Digitaria sp.)的菌株則表現(xiàn)出最大的遺傳變異；此外，不同寄主的菌株之間僅存在低水平的基因交流，遺傳多樣性豐富且復(fù)雜。

農(nóng)作物品種在南繁過(guò)程中，大陸與海南島之間的水稻種子或無(wú)性繁殖材料調(diào)運(yùn)頻繁，進(jìn)島種子或無(wú)性繁殖材料上所攜帶的病原真菌對(duì)南繁區(qū)稻瘟病菌的遺傳變異及其與病原真菌致病性的關(guān)系造成什么樣的影響，至今尚未見(jiàn)到相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本研究以分離自南繁核心區(qū)和非核心區(qū)的稻瘟病菌為研究材料，對(duì)其進(jìn)行了遺傳多樣性研究，旨在了解南繁區(qū)稻瘟病菌遺傳本質(zhì)上的差異，為南繁區(qū)稻瘟病的防治提供依據(jù)，對(duì)于制定正確的防治策略具有重要的指導(dǎo)義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試的稻瘟病菌菌株于2014-2015年采自海南省南繁區(qū)6個(gè)縣(市)的秈稻，保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌研究室。全部60個(gè)供試菌株均為單孢菌株，并經(jīng)形態(tài)和分子鑒定為稻瘟病菌。菌株詳情見(jiàn)表1。

1.2 菌絲收集及DNA抽提

將稻瘟病菌在PDA平板上活化后轉(zhuǎn)接到150 mL酵母粉葡萄糖培養(yǎng)基(0.6 g酵母粉，2.25 g葡糖糖，純水定容至150 mL，高溫高壓滅菌)，28℃下?lián)u菌培養(yǎng)5～7 d后抽濾收取菌絲。DNA的抽取采用真菌DNA小量抽提試劑盒。

1.3 AFLP分析

AFLP分析的步驟和方法參照Vos等[14]的方法進(jìn)行，有少許改動(dòng)。

1.3.1 基因組DNA的酶切和連接

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，MseⅠ和T4連接酶均購(gòu)自NEB公司，酶切體系為15 μL，DNA模板量為300.0 ng，37℃下酶切3.5 h；連接體系為25 μL，MseⅠ接頭和EcoRⅠ接頭的濃度分別為5 μm/L和50 μm/L，16℃下連接過(guò)夜。

表1 南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌的詳細(xì)情況Table 1.The details of Magnaporthe oryzae in the core and non-core regions of South China Crop Breeding Area.

1.3.2 預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增

PCR所用的預(yù)擴(kuò)增體系為25 μL，其中，連接產(chǎn)物5 μL，10 μm/L EcoRⅠ和MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物各1 μL，混勻后進(jìn)行常規(guī)PCR；選擇性擴(kuò)增體系為25 μL，其中，預(yù)擴(kuò)增20倍稀釋產(chǎn)物2.5 μL，10 μm/L EcoRⅠ和MseⅠ選擇性擴(kuò)增引物各1 μL，混勻后進(jìn)行降落PCR(touch-down PCR)。

習(xí)近平總書記在全國(guó)高校思想政治工作會(huì)議上發(fā)表的重要講話中指出:“做好高校思想政治工作，要因事而化、因時(shí)而進(jìn)、因勢(shì)而新。要遵循思想政治工作規(guī)律，遵循教書育人規(guī)律，遵循學(xué)生成長(zhǎng)規(guī)律，不斷提高工作能力和水平[2]”。習(xí)近平總書記的講話，是新媒體環(huán)境下加強(qiáng)對(duì)大學(xué)生思想行為正確引領(lǐng)的重要指南。

1.3.3 變性聚丙烯酰氨凝膠電泳及銀染檢測(cè)

6%變性聚丙烯酰胺凝膠在80 W恒功率下電泳2 h，采用Sanguinetti等[16]的方法(略有改動(dòng))進(jìn)行銀染檢測(cè)，膠板晾干后拍照保存。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)擴(kuò)增帶的有無(wú)對(duì)電泳圖譜進(jìn)行讀取，取得“0/1”數(shù)據(jù)矩陣表；用NTSYSpc 2.1軟件進(jìn)行聚類分析；用POPGENE32 1.32軟件計(jì)算相關(guān)的遺傳多樣性指標(biāo)：多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPL)、Nei基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon信息指數(shù)(I)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、基因分化系數(shù)[Gst, Gst=(Ht-Hs)/Ht]、基因流[Nm，Nm=0.5×(1-Gst)/Gst]、遺傳一致性(In)和遺傳距離(D)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物組合對(duì)稻瘟病菌DNA擴(kuò)增的多態(tài)性

從64對(duì)隨機(jī)引物組合中篩選出9對(duì)條帶較豐富且多態(tài)性較高的引物組合用于AFLP分析，分別為E2/M1、E2/M2、E3/M4、E3/M5、E4/M5、E4/M6、E4/M8、E5/M1和E5/M4。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多為100～500 bp，共擴(kuò)增出413條條帶，平均每對(duì)引物組合可檢測(cè)到45.89條條帶；其中411條具有多態(tài)性，平均每對(duì)引物組合可檢測(cè)到45.67條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分率為99.52%(表3，圖1)。

2.2 遺傳多樣性分析

由菌株的聚類分析圖可看出，在相似系數(shù)為0.74處，可將這些菌株分為4個(gè)譜系。譜系Ⅰ包含P18、P29、P34、P40和P51共5個(gè)菌株，這些菌株來(lái)自樂(lè)東、保亭、瓊中和屯昌；譜系Ⅱ和譜系Ⅲ分別只包含樂(lè)東的P15菌株和P16菌株；譜系Ⅳ包括南繁區(qū)各地區(qū)余下的53個(gè)菌株(圖2)。

圖1 引物組合E5/M4擴(kuò)增的稻瘟病菌AFLP分析結(jié)果Fig.1.AFLP results for Magnaporthe oryzae with the primer combination E5/M4.

由圖2還可發(fā)現(xiàn)，南繁區(qū)各地的菌株基本都聚在同一個(gè)譜系里，該譜系沒(méi)有明顯的亞群，證明核心區(qū)菌株和非核心區(qū)菌株在親緣關(guān)系上很接近，但菌株個(gè)體間又存在著豐富的遺傳多樣性。

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

在種群水平上對(duì)南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌樣品的“0/1”數(shù)據(jù)矩陣按群體進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。由表4可知，南繁區(qū)稻瘟病菌群體總的多態(tài)性位點(diǎn)百分率為99.52%，其中，核心區(qū)群體的多態(tài)性位點(diǎn)百分率為87.89%，非核心區(qū)群體的為81.37%。6個(gè)群體的多態(tài)性位點(diǎn)百分率為30.99%～80.39%，按由高到低的順序依次為：樂(lè)東＞瓊中＞定安＞保亭＞三亞＞屯昌。南繁區(qū)稻瘟病菌群體總的Shannon信息指數(shù)為0.2821，其中，核心區(qū)群體的為0.2738，也稍高于非核心區(qū)的0.2703。6個(gè)群體間的Shannon信息指數(shù)范圍為0.1283～0.3156，按由高到低的順序依次為樂(lè)東＞瓊中＞定安＞保亭＞三亞＞屯昌。南繁區(qū)稻瘟病菌群體總的Nei基因多樣性指數(shù)為0.1701，其中，核心區(qū)群體的為0.1657，稍低于非核心區(qū)群體的0.1662，6個(gè)群體的Nei基因多樣性指數(shù)范圍為0.0815～0.2025，按由高到低的順序依次為瓊中＞樂(lè)東＞定安＞保亭＞三亞＞屯昌。以上各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)的比較分析結(jié)果表明，南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體的遺傳多樣性存在一定的差異，但差異不大。

表4 南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌不同群體的遺傳多樣性分析Table 4.Genetic diversity analyses of different Magnaporthe oryzae populations in the core and non-core regions of South China Crop Breeding Area.

由表5可知，南繁區(qū)稻瘟病菌群體總的基因分化系數(shù)為0.1348，其中，核心區(qū)稻瘟病菌群體的基因分化系數(shù)為0.1044，非核心區(qū)稻瘟病菌群體的為0.1223；南繁區(qū)稻瘟病菌群體總的基因流為3.2092，其中，核心區(qū)稻瘟病菌群體的基因流為4.2897，非核心區(qū)稻瘟病菌群體的為3.5892。這些結(jié)果表明核心區(qū)稻瘟病菌群體間的基因交流水平相對(duì)非核心區(qū)要高些，群體間的遺傳分化相對(duì)更小些，但兩大區(qū)群體間的基因交流均較多，遺傳變異都主要發(fā)生在群體內(nèi)。

由表6可知，遺傳一致性最高(遺傳距離最小)的群體為樂(lè)東和定安，遺傳一致性最低(遺傳距離最大)的群體為瓊中和屯昌。

由圖3可知，在遺傳一致性為0.9710時(shí)，核心區(qū)的樂(lè)東群體和非核心區(qū)的瓊中群體、定安群體聚為一組，核心區(qū)的三亞群體、保亭群體、非核心區(qū)的屯昌群體分別聚為一組，進(jìn)一步證明南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體的遺傳分化程度較一致。

3 討論

本研究一共篩選出9對(duì)引物組合用于南繁核心區(qū)和非核心區(qū)60個(gè)稻瘟病菌菌株的AFLP分析，不同引物的多態(tài)性條帶百分率介于97.56%～100.00%，多態(tài)性條帶百分率為99.52%，說(shuō)明這些菌株間存在非常豐富的遺傳多樣性。

圖2 南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌的聚類分析結(jié)果Fig.2.Clustering results of M.oryzae in the core and non-core regions of South China Crop Breeding Area.

表5 南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體的遺傳分化和基因流Table 5.Genetic differentiation and gene flow of different populations of Magnaporthe oryzae from the core and non-core regions of South China Crop Breeding Area.

表6 南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體的遺傳一致性和遺傳距離Table 6.Genetic identity and genetic distance of different Magnaporthe oryzae populations from the core and non-core regions of South China Crop Breeding Area.

南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌的聚類分析表明，南繁區(qū)各地的稻瘟病菌菌株基本都聚在同一個(gè)譜系里，并且沒(méi)有明顯的亞群，進(jìn)一步證明了南繁區(qū)稻瘟病菌菌株間存在較廣泛的基因交流，核心區(qū)菌株和非核心區(qū)菌株在親緣關(guān)系上很接近，但各菌株間又存在豐富的遺傳多樣性，也說(shuō)明了稻瘟病菌菌株具有高度的變異性。這與很多研究結(jié)果高度一致。如劉振華等[17]采用Pot2-Rep-PCR分子指紋技術(shù)對(duì)2010-2011年間采自云南省五大稻區(qū)的455個(gè)稻瘟病菌菌株進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，分析結(jié)果表明云南省各稻瘟病菌群體間具有豐富的遺傳多樣性；張亞玲等[18]也采用Pot2-Rep-PCR分子指紋技術(shù)對(duì)采自黑龍江省和吉林省的49個(gè)稻瘟病菌菌株進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)這些稻瘟病菌種群在DNA水平上存在豐富的遺傳多樣性。

南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體的遺傳多樣性指數(shù)分析表明，核心區(qū)群體的遺傳分化程度與非核心區(qū)的基本一致，推測(cè)出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由南繁區(qū)復(fù)雜的水稻品種來(lái)源以及稻瘟病菌孢子的高度遷移能力造成的。

圖3 基于Nei遺傳一致性的南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體聚類圖Fig.3.Clustering analyses of Magnaporthe oryzae from the core and non-core regions of South China Crop Breeding Area based on Nei's genetic consistency.

南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體間的遺傳分化結(jié)果表明，南繁區(qū)稻瘟病菌群體間存在較高的基因交流現(xiàn)象，菌株間的遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)，群體間的遺傳變異很??；并且核心區(qū)群體和非核心區(qū)群體間的基因交流水平相當(dāng)，差異不大，證明南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體間的遺傳漂變作用較大。王玲等[19]采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析四川綿陽(yáng)、營(yíng)山、雅安、北川和武勝5個(gè)稻瘟病菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)也得到了相似的結(jié)論，結(jié)果表明5個(gè)地理群體間存在高水平的遺傳分化，各群體間存在不同程度的基因交流(基因流水平為0.472～4.347)，并且絕大多數(shù)遺傳變異(81.17%)來(lái)自于群體內(nèi)，僅有18.83%的變異發(fā)生在群體間。

南繁核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體間的遺傳一致性和遺傳距離分析進(jìn)一步證明南繁核心區(qū)稻瘟病菌群體和非核心區(qū)群體間的遺傳分化程度較為一致，說(shuō)明核心區(qū)和非核心區(qū)稻瘟病菌群體的遺傳分化與其地理距離之間沒(méi)有直接的相關(guān)性。

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[18]張亞玲,王寶玉,臺(tái)蓮梅,豫虎,鄭雯,鄧本良,靳學(xué)慧.黑龍江省和吉林省稻瘟病菌種群多樣性研究.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2014,26(1):1-4,31. Zhang Y L,Wang B Y,Tai L M,Yu H,Zheng W,Deng B L,Jin X H.Study of populationstructure of Magnaporthe oryzae from rice in Heilongjiang and Jilin. J Heilongjiang Bayi Agri Univ,2014,26(1):1-4,31.(in Chinese with English abstract)

[19]王玲,左示敏,張亞芳,陳宗祥,潘學(xué)彪,黃世文.四川省稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)分析.中國(guó)水稻科學(xué),2015, 29(3):327-334. Wang L,Zuo S M,Zhang Y F,Chen Z X,Pan X B, Huang S W.Genetic structure of rice blast pathogen Magnaporthe oryzae in Sichuan Province.Chin J Rice Sci,2015,29(3):327-334.(in Chinese with English abstract)

AFLP Analyses of Genetic Diversity and Population Genetic Structure of Magnaporthe oryzae from South China Crop Breeding Area

ZHU Minghai,PI Lei,SHU Canwei,ZHOU Erxun*

(Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control,College of Agriculture,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;*Corresponding author,E-mail:exzhou@scau.edu.cn)

【Objective】In order to clarify the genetic differentiation of Magnaporthe oryzae in South China Crop Breeding Area in Hainan Province,【Method】the genetic diversity and population genetic structure of 60 Magnaporthe oryzae isolates collected from the core region(Sanya,Ledong and Baoting)and non-core region(Qiongzhong,Tunchang and Ding’an)of South China Crop Breeding Area were comparatively analyzed using amplified fragment length polymorphism(AFLP)technique.【Result】The cluster analysis showed that almost all isolates were clustered in one group,and there was no obvious subgroup.The analysis of population genetic structure showed that the percentage of polymorphic loci(PPL),Shannon’s information index(I)and gene flow(Nm)in the core population were 87.89%,0.2738 and 4.2897,respectively,higher than those of non-core population whose PPL,I and Nm were 81.37%,0.2703 and 3.5892,respectively.However,Nei’s gene diversity index(H)and genetic differentiation coefficient(Gst)in the core population were 0.1657 and 0.1044,lower than those of non-core population whose H and Gstwas 0.1662 and 0.1223.【Conclusion】These results showed that there were rich genetic diversity in both isolates of core and non-core regions and wide gene flow existed among these populations,but the genetic variation was mainly within the population.In contrast,the genetic diversity and the degree of genetic differentiation in the isolates of core region were relatively larger.

South China Crop Breeding Area;Magnaporthe oryzae;genetic diversity;population genetic structure; AFLP

S435.111.4+1

：A

：1001-7216(2017)03-0320-07

2016-10-20；修改稿收到日期：2016-11-30。

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)(201403075)。