矮稈小粒水稻瀟湘矮的形態(tài)學(xué)與分子遺傳學(xué)分析

呂育松謝耘豐圣忠華鄔亞文唐紹清胡培松魏祥進,*

(1中國水稻研究所國家水稻改良中心/水稻生物學(xué)國家重點實驗室，杭州310006；2杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州310036；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail:weixiangjin@caas.cn)

矮稈小粒水稻瀟湘矮的形態(tài)學(xué)與分子遺傳學(xué)分析

呂育松1,#謝耘豐1,2,#圣忠華1鄔亞文1唐紹清1胡培松1魏祥進1,*

(1中國水稻研究所國家水稻改良中心/水稻生物學(xué)國家重點實驗室，杭州310006；2杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州310036；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail:weixiangjin@caas.cn)

【目的】研究揭示瀟湘矮矮稈小粒的遺傳機制，為瀟湘矮的育種利用提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坷盟居N過程中自然突變而得到的穩(wěn)定遺傳的矮稈小粒水稻材料瀟湘矮，對其進行農(nóng)藝性狀考查、赤霉素(GA3)和油菜素內(nèi)酯(BR)敏感性分析、遺傳學(xué)分析，并利用瀟湘矮與其近等基因系NIL(NIP)衍生的F2群體對控制矮稈小粒的基因xxa進行圖位克隆，最終利用轉(zhuǎn)基因互補試驗驗證候選基因。【結(jié)果】瀟湘矮除表現(xiàn)為矮稈小粒外，其穗長變短，穗型緊湊，千粒重極顯著下降。不同濃度梯度的赤霉素(GA3)和油菜素內(nèi)酯(BR)處理，發(fā)現(xiàn)瀟湘矮對GA3部分敏感，而對BR不敏感。遺傳分析發(fā)現(xiàn)其符合孟德爾3∶1分離規(guī)律。圖位克隆將xxa基因定位于第5染色體InDel標(biāo)記F81和F82之間約70 kb區(qū)間的物理距離內(nèi)。該區(qū)間包含8個開放閱讀框(ORF)。其中，第5個ORF(LOC_Os05g26890)被注釋為水稻株高基因D1。序列分析發(fā)現(xiàn)，瀟湘矮的D1基因在第5和12外顯子分別有1個堿基的無義替換和3個堿基的缺失，其中第12外顯子3個堿基的缺失導(dǎo)致1個賴氨酸的缺失。轉(zhuǎn)基因互補顯示D1可以恢復(fù)瀟湘矮的表型?！窘Y(jié)論】瀟湘矮控制株高的途徑可能與GA3代謝有關(guān)；瀟湘矮矮稈小粒表型符合單隱性核基因控制的遺傳規(guī)律；瀟湘矮矮稈小粒性狀是由D1基因突變所致。

水稻；矮稈小粒；圖位克??；機械化制種

水稻矮稈突變體對于研究水稻株高的調(diào)控機制具有重要的意義。到目前為止已經(jīng)有60多個的水稻矮稈突變體被鑒定[5]。很多矮稈突變體除了表現(xiàn)為矮稈之外，還表現(xiàn)出一些其他表型特征，如小粒、多分蘗、窄葉、卷葉等[5]。水稻矮稈、半矮稈基因主要與植物激素赤霉素(GA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、獨腳金內(nèi)酯素(SLs)等的合成與信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)[6-9]。其中，“綠色革命”中使用的半矮稈栽培品種，就是由于赤霉素的合成或信號傳導(dǎo)途徑基因改變,如sd1屬于赤霉素的生物合成途徑缺陷突變體，gid1、d1等屬于赤霉素信號傳導(dǎo)缺陷突變體[8-9]。SD1參與赤霉素的生物合成，該基因編碼赤霉素合成途徑中關(guān)鍵酶GA20氧化酶，該基因的突變導(dǎo)致水稻不同程度矮化[10-11]。GA代謝途徑中，受體蛋白GID1通過降解DELLA蛋白介導(dǎo)水稻中GA的信號傳導(dǎo)。gid1突變體表現(xiàn)株高嚴(yán)重矮化、不育等性狀[12]。Dwarf 1(D1)參與了依賴G蛋白的GA信號傳導(dǎo),是水稻中第一個鑒定出的GTP結(jié)合蛋白(G蛋白)α亞基。d1突變體多表現(xiàn)為水稻株高矮化，莖稈增粗；葉片短且寬，谷粒小而圓，節(jié)間密集等。隨著研究的深入，功能也逐步清晰。異三聚體G蛋白存在于多種真核生物中，由G蛋白α亞基(D1)、β亞基和γ亞基3個亞基構(gòu)成。在通常狀態(tài)下，這3個亞基結(jié)合在一起，直到一個配基被G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)檢測到，一起參與GA應(yīng)答以及信號傳導(dǎo)[13-14]。此外，水稻矮稈突變體d2、d11、d61等被證實為BR生物合成或信號傳導(dǎo)相關(guān)基因發(fā)生突變所致[15-17]；而d27、d10、d14、d3、d53則被證實為與SLs生物合成或信號傳導(dǎo)相關(guān)基因發(fā)生突變所致[9,18-19]。水稻株高除受一些主基因控制之外，也受大量微效數(shù)量基因控制，關(guān)于水稻株高相關(guān)的QTL定位也有大量研究報道[20-22]。因此，水稻株高調(diào)控具有極其復(fù)雜的遺傳機制，鑒定、解析新的矮稈、半矮稈資源仍然是分子生物學(xué)和遺傳育種學(xué)的關(guān)注熱點。

本研究以矮稈小粒水稻瀟湘矮為研究對象，從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)等角度分析了其矮稈小粒特征，并對其矮稈小?；蜻M行了圖位克隆和功能驗證，為瀟湘矮在水稻育種中的應(yīng)用潛力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

矮稈小粒水稻瀟湘矮(Xiaoxiang’ai,XXA)為水稻育種中自然突變產(chǎn)生，具有穩(wěn)定的矮化、小粒表型[23]。瀟湘矮與半矮稈品種日本晴、02428、熱研1號和Y01衍生的F1及F2群體用來對矮稈小?；蜻M行遺傳分析。從日本晴與瀟湘矮的F2群體中選高稈單株連續(xù)與瀟湘矮回交3代并自交，選擇出株高類似日本晴的BC3F2單株為瀟湘矮的高稈近等基因系NIL(NIP)。矮稈小?；蚨ㄎ蝗后w為瀟湘矮與NIL(NIP)雜交的F2群體。所有材料均于正季種植于中國水稻研究所杭州富陽試驗基地，種植與管理方法同大田生產(chǎn)。

1.2 外源赤霉素(GA3)和油菜素內(nèi)酯(BR)處理

NIL(NIP)和瀟湘矮種子用1%次氯酸鈉消毒，浸種、催芽各24 h后，選取芽長一致的20粒種子

于含梯度濃度GA3(0、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L)和BL(0、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L)的50%MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，30℃下持續(xù)光照培養(yǎng)1或2周(GA3為1周，BR處理2周)后，測量每株幼苗第2葉葉鞘長度。每個濃度梯度設(shè)置3個重復(fù)。

1.3 基因定位與候選基因分析

由《社會管理和公共服務(wù)綜合標(biāo)準(zhǔn)化試點細(xì)則（試行）》② 2013年7月，標(biāo)準(zhǔn)委、教育部等25部委印發(fā)《社會管理和公共服務(wù)綜合標(biāo)準(zhǔn)化試點細(xì)則（試行）》，細(xì)則中第二條對“社會管理和公共服務(wù)綜合標(biāo)準(zhǔn)化試點”的定義作了詳細(xì)解釋。引申得出，社會管理和公共服務(wù)綜合標(biāo)準(zhǔn)化是采用綜合標(biāo)準(zhǔn)化方法，開展以制定標(biāo)準(zhǔn)、組織實施標(biāo)準(zhǔn)、對標(biāo)準(zhǔn)實施進行監(jiān)督為主要內(nèi)容，以實現(xiàn)管理規(guī)范、服務(wù)質(zhì)量良好、公眾滿意度高為目標(biāo)，促進提高社會管理科學(xué)化水平、推動基本公共服務(wù)均等化、加強保障和改善民生的活動。

從瀟湘矮和NIL(NIP)衍生的F2群體中挑選出矮稈小粒的隱性單株，提取其DNA。首先分析瀟湘矮與NIL(NIP)之間的多態(tài)性SSR標(biāo)記，之后利用22株F2矮稈小粒的隱性單株調(diào)查每個多態(tài)性標(biāo)記與瀟湘矮矮稈小粒性狀之間的連鎖關(guān)系，對突變體基因進行初步定位。最后以786株F2矮稈小粒單株為材料，用新開發(fā)的6對SSR或InDel多態(tài)性標(biāo)記對矮稈小?；蜻M行精細(xì)定位(表1)。利用水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(Rice Genome Annotation Project)對精細(xì)定位區(qū)間進行基因預(yù)測，并通過對候選基因進行序列分析，最終確定瀟湘矮矮稈小粒候選基因。

1.4 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因

以PCR引物lv-1(序列：TTTGGATCC ATG GGCTCATCCTGTAGCAG，TTTGTCGACTCAAG TTCCTTCCCTGGAGC)從NIL(NIP)中擴增瀟湘矮矮稈小粒候選基因完整基因組序列，利用限制線內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ將其克隆到雙元表達載體pCUbi1390載體上。利用農(nóng)稈菌介導(dǎo)法將候選基因(啟動子為玉米Ubi啟動子)轉(zhuǎn)入瀟湘矮中。水稻愈傷組織誘導(dǎo)、分化，轉(zhuǎn)化、篩選等方法參見文獻[24]。

表1 本研究中基因定位所用引物Table 1.Primers for mapping in the study.

1.5 RNA提取與熒光定量PCR

分別以3周大小的瀟湘矮以及互補轉(zhuǎn)基因家系幼苗為材料，利用提取RNA試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)提取地上部分總RNA，用Primer premier 5設(shè)計D1定量PCR引物，前引物為ATTG ATGGCAGGTTGGATTA，后引物為GTTTCCTGA ATGGCTGGGTC；內(nèi)參Ubquitin定量PCR引物，前引物為F(CTTGGTCGTGTCCCGT)，后引物為R(TCCATGCTGCTCTACCAC)。實驗儀器為高通量實時熒光定量PCR系統(tǒng)LightCycler?480Ⅱ，通過特定的熒光定量PCR產(chǎn)物的溶解曲線的單峰來判定引物的特異性，適合進行定量PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 瀟湘矮表型以及形態(tài)學(xué)分析

瀟湘矮株高從苗期開始就明顯矮于其近等基因系，成熟后其株高約為NIL(NIP)的60%，同時穗長變短，穗型緊湊，粒型為小圓粒型(圖1-A～E)。另外，瀟湘矮的結(jié)實率、千粒重、粒長相比其近等基因系也顯著下降，其中千粒重約為NIL(NIP)的45%，而有效穗數(shù)、粒寬等與NIL(NIP)差異不明顯(圖1-F～J)。比較植株各節(jié)間長度發(fā)現(xiàn)，相對于近等基因系，XXA植株主莖的第1、2和3節(jié)間及穗長都顯著短于NIL(NIP)(圖2-A、B)。

2.2 瀟湘矮對GA3、BR敏感性分析

水稻株高的調(diào)控多與植物激素如赤霉素、油菜素內(nèi)酯等的合成、代謝有關(guān)[5]。我們對瀟湘矮及其NIL(NIP)設(shè)置了GA3和BR的梯度濃度處理(圖3)。結(jié)果顯示，施加外源BR后，瀟湘矮與NIL(NIP)的第2葉葉鞘長度并沒有明顯改變(圖3-B)，說明調(diào)控瀟湘矮株高的基因可能與BR合成無關(guān)。不同于BR處理，瀟湘矮和NIL(NIP)的株高對GA3具有敏感性，隨著GA3濃度的逐漸上升，它們第2葉葉鞘長度逐漸增加，雖然瀟湘矮第2葉葉鞘的長度始終短于NIL(NIP)，但是它們對GA3的響應(yīng)速率基本一致(圖3-A)。

2.3 瀟湘矮矮稈小粒的遺傳學(xué)分析及基因定位

我們將瀟湘矮與半矮稈表型的日本晴、熱研1號、0248、Y01雜交獲得F1組合，結(jié)果顯示所有F1組合植株都表現(xiàn)為半矮稈正常株型，其衍生的4個F2群體中正常半矮稈與類似瀟湘矮的矮稈小粒株型分離，比例符合3∶1(表2)。因此，我們推測相對于日本晴等半矮稈水稻品種，瀟湘矮發(fā)生了單基因突變，其矮稈小粒表型符合單隱性核基因控制的遺傳規(guī)律，并將該突變體基因暫命名為xxa。同時，通過連續(xù)回交及雜交，我們構(gòu)建了株型表現(xiàn)為正常半矮稈植株的近等基因系NIL(NIP)。對從瀟湘矮和NIL(NIP)衍生的F2群體中挑選出的22株矮化小粒突變體單株進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)矮稈小粒性狀與第5染色體長臂上SSR標(biāo)記RM182402、RM18457存在連鎖。利用從F2中選出的96株矮化小粒單株將突變體基因初步定位于RM18420和RM18450間約2 cM的區(qū)間內(nèi)(圖4-A)。通過加密標(biāo)記，并從F2中共挑選786株矮化小粒單株，突變體基因xxa最終被定位在第5染色體的InDel標(biāo)記F81和F82間約70 kb區(qū)間的物理距離內(nèi)(圖4-A)。利用國際水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(Rice Genome Annotation Project)分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)間包含8個開放閱讀框(ORF，圖4-A)。其中，第5個ORF被注釋為株高基因D1(LOC_Os05g26890)。D1編碼G蛋白的α亞基，參與依賴G蛋白的GA信號傳導(dǎo)，該基因突變后導(dǎo)致植株矮化粒型變小[13-14]。對瀟湘矮和NIL(NIP)的D1基因序列比對發(fā)現(xiàn)，在瀟湘矮中D1的第5和12外顯子分別有1個堿基的替換和3個

圖1 瀟湘矮(XXA)及其近等基因系NIL(NIP)的表型分析Fig.1.Phenotype analysis of XXA and NIL(NIP).

圖2 瀟湘矮與近等基因系NIL(NIP)主莖穗長、節(jié)間長度Fig.2.The internode and panicle length comparison in XXA and NIL(NIP).

圖3 瀟湘矮與NIL(NIP)幼苗期第2葉葉鞘對外源赤霉素(A)和油菜素內(nèi)酯(B)的響應(yīng)Fig.3.Elongation of the second leaf sheath in response to gibberellin(A)and brassinolide(B)in NIL(NIP)and XXA plants.

表2 日本晴、熱研1號、0248、Y01和瀟湘矮雜交組合F2株高的分離情況Table 2.Segregation of combination Nipponbare/XXA,Reyan 1/XXA,0248/XXA and Y01/XXA.

圖4 矮稈小粒基因的精細(xì)定位與候選基因分析Fig.4.Fine mapping and positional cloning of the candidate gene.

堿基的缺失，其中第5外顯子1個堿基的替換屬于無義突變，并沒有導(dǎo)致氨基酸的任何改變，而第12外顯子3個堿基的缺失導(dǎo)致1個賴氨酸的缺失(圖4-B)。因此，我們推測瀟湘矮矮稈小粒性狀是D1基因突變所致。

2.4 轉(zhuǎn)基因互補驗證

為了進一步驗證瀟湘矮矮稈小粒性狀是D1基因突變所致，我們擴增NIL(NIP)基因組中的D1基因序列，構(gòu)建互補載體pCUbi1390-D1,通過農(nóng)稈菌介導(dǎo)法導(dǎo)入瀟湘矮中，讓NIL(NIP)的D1基因在Ubi啟動子的驅(qū)動下在瀟湘矮中表達。對轉(zhuǎn)基因T0陽性家系(D1/XXA)中D1基因表達水平分析發(fā)現(xiàn)，D1轉(zhuǎn)基因和NIL(NIP)表達水平顯著高于瀟湘矮。表型分析發(fā)現(xiàn)，相對于瀟湘矮，轉(zhuǎn)基因陽性家系D1/XXA-1表現(xiàn)為株高變高，穗型變大，穗長及第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ節(jié)間長度顯著變長，粒長顯著增加，粒寬無明顯變化(圖5)。說明瀟湘矮矮稈小粒性狀是D1基因突變所致。

3 討論

圖5 轉(zhuǎn)基因功能互補Fig.5.Phenotype analysis of complementary plants(D1/XXA).

本研究通過對育種過程中自然突變的矮稈小粒材料瀟湘矮進行了形態(tài)學(xué)以及遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了瀟湘矮矮稈小粒性狀符合單隱性基因控制的遺傳規(guī)律。通過構(gòu)建近等基因系及定位群體，對矮稈小?；蜻M行了圖位克隆。結(jié)果表明瀟湘矮矮稈小粒性狀是D1基因突變所致。水稻中最早報道的矮稈小粒突變體d1正是Dwarf 1(D1)基因突變所致。迄今，水稻報道的d1突變體有20多種，主要由大片段缺失、單堿基的突變、移碼突變導(dǎo)致翻譯提前終止等[5,25]。本研究中新發(fā)現(xiàn)的瀟湘矮為d1的新等位突變體(第12個外顯子處有3個堿基缺失導(dǎo)致一個1個賴氨酸的缺失)。生物信息學(xué)分析表明，瀟湘矮突變位點正好位于G蛋白α亞基(G_alpha)功能域，可能影響G蛋白偶聯(lián)受體的信號傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致矮稈圓小粒表型。D1的功能喪失除了導(dǎo)致水稻的矮化外，還伴有其他性狀，如：莖稈增粗；葉片短且寬，葉色暗綠；穗形直立，著粒緊密，谷粒小而圓；節(jié)間密集，有時第2節(jié)間不伸長等[25-28]。我們發(fā)現(xiàn)瀟湘矮株高明顯矮于其近等基因系NIL(NIP)，粒型小圓，穗型變小，且第2節(jié)間長度明顯短于NIL(NIP)(圖2)。前人研究表明d1矮稈突變體對外源赤霉素刺激不敏感，即外源赤霉素不能誘導(dǎo)其株高恢復(fù)正常[25]。本研究卻顯示瀟湘矮對GA3表現(xiàn)出一定程度的敏感性，施加外源GA3可以部分恢復(fù)瀟湘矮的株高(圖3)，該結(jié)果表明除D1外，可能還存在其株高相關(guān)基因(如半矮稈基因等)共同在調(diào)控瀟湘矮的株高等表型。前人的研究推測控制瀟湘矮矮稈小粒性狀的可能有2對隱性基因，其中1對為已知的半矮稈基因sd1，且存在一個未知的半矮稈基因[23]。本研究中日本晴和瀟湘矮的背景親本均為半矮稈材料，它們均含有半矮稈基因sd1。因此，在半矮稈遺傳背景下得出結(jié)論瀟湘矮的矮稈性狀主要由d1控制。而前者提到的控制瀟湘矮矮稈小圓粒的未知基因很有可能就是d1。此外，最新研究發(fā)現(xiàn)D1可能參與水稻干旱脅迫調(diào)控途徑，D1新的等位突變體rga1對干旱脅迫的敏感性降低，干旱處理14 d后，葉片仍為暗綠色且直立，而野生型葉片黃化并萎蔫[29]。因此，D1的突變體rga1在培育抗旱水稻的分子育種中具有重要應(yīng)用價值。

本研究中穩(wěn)定遺傳矮稈小粒水稻瀟湘矮，其籽粒很小，千粒重只有12 g左右，因此，我們可以將其導(dǎo)入不育系中，雜交制種時小粒不育系與恢復(fù)系混播、混種、混收，最后通過機械篩選去除大?；謴?fù)系種子留下小粒雜交種子，而小粒性狀為隱性核基因控制，雜種F1所結(jié)種子粒型正常，不影響產(chǎn)量。因此利用瀟湘矮的矮稈小?；蚩梢詫崿F(xiàn)水稻雜交制種全程機械化，具有重要的實踐意義。

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Morphological and Molecular Genetic Analysis of a Dwarf and Small Grain Rice Variety Xiaoxiang’ai

Lü Yusong1,#,XIE Yunfeng1,2,#,SHENG Zhonghua1,WU Yawen1,TANG Shaoqing1,HU Peisong1, WEI Xiangjin1,*

(1State Key Laboratory of Rice Biology/Key Laboratory of Rice Biology and Breeding of Ministry of Agriculture,China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006,China;2College of Life and Environmental Sciences,Hangzhou Normal University,Hangzhou 310036,China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author,E-mail:weixiangjin@caas.cn)

【Objective】To uncover the genetic mechanism of a dwarf and small grain variety Xiaoxiang’ai(XXA),and lay an important theoretical foundation in rice dwarfing breeding.【Method】Rice variety XXA characterized as a dwarf and small grain phenotype was derived from natural mutation under breeding process.The agronomic traits of XXA were investigated.Its sensibility to phytohormone was analyzed under GA3and BR treatments at various concentrations. Genetic analysis of XXA with different varieties and fine mapping of xxa gene from the F2population derived from the cross between near-isogenic lines NIL(NIP)and XXA were done.Furthermore,complementary assay was performed to confirm the candidate gene.【Result】The XXA shows short spikes and compact panicles,with significant decrease in 1000-grain weight under GA3and BR treatments,we found that XXA is partially sensitive to GA3,whereas insensitive to BR.The segregation behavior in each of the derived F2populations between XXA and either varieties was consistent with the Mendelian monogenic ratio of 3∶1.The xxa gene was finally narrowed down to a 70 kb physical region between the InDel markers F81 and F82 on chromosome 5.Within this region,eight open reading frames(ORFs)were predicted, of which,ORF5(LOC_Os05g26890)has been annotated as a Dwarf1 gene(D1).Furthermore,sequence analysis of all the region revealed that there are only two mutation sites including one 1-bp nonsense mutation in the 5th exon and a 3-bp deletion that resulted in a lysine deletion in the 12th exon of D1.The complementary assay showed that the abnormal phenotype of XXA can be recovered.【Conclusion】The dwarf and small grain phenotype is probably associated with GA3metabolism.The abnormal phenotype is mainly controlled by a single recessive gene.The D1 indisputably corresponds to mutation phenotype of XXA.

rice;dwarf and small grain;gene mapping;mechanized propagation

S511.024獻標(biāo)識碼：A

：1001-7216(2017)03-0238-09

2016-11-24；修改稿收到日期：2017-02-06。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31471472)；國家重點研發(fā)計劃資助項目(2016YFD0101801)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY14C30009)。