2株乳酸菌的生長(zhǎng)和潛在益生菌特性

楊靜，馬如慧，楊智茜，徐爽，李鐸，陳蘭明*

（1.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海海洋大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海201306；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

2株乳酸菌的生長(zhǎng)和潛在益生菌特性

楊靜1，馬如慧1，楊智茜1，徐爽1，李鐸2，陳蘭明1*

（1.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海海洋大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海201306；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

通過研究和比較2株乳酸菌——植物乳桿菌D28（Lactobacillus plantarumD28)和糞腸球菌B21（Enterococcus faeciumB21)的生長(zhǎng)曲線，對(duì)NaCl和膽鹽的耐受性，對(duì)人工胃液和人工腸液的耐受性，以及它們的體外抗氧化能力和膽鹽水解酶活性，判斷其是否具有益生菌特性，以期為后期菌株功能研究提供理論基礎(chǔ)。生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)表明，L. plantarumD28的最大生長(zhǎng)速度出現(xiàn)在18 h左右，而E.faeciumB21為16 h左右。起始pH對(duì)2株菌生長(zhǎng)的影響很大，L.plantarumD28的最適生長(zhǎng)pH為5.5～7.0，而E.faeciumB21為pH 6.0～7.0。耐受性試驗(yàn)表明：E.faeciumB21對(duì)NaCl和膽鹽的耐受性較好，高于L.plantarumD28；L.plantarumD28在人工胃液（pH 2.0，180 min）和人工腸液（pH 8.0，240 min）中的菌群存活率均顯著高于E.faeciumB21。采用DPPH（二苯基苦基苯肼）自由基清除率來測(cè)定2株菌的體外抗氧化活性，結(jié)果表明，2株菌均具有一定的抗氧化活性，且L.plantarumD28的抗氧化活性（34.86%）顯著高于B21（25.32%）。采用茚三酮法測(cè)定菌株的膽鹽水解酶活性發(fā)現(xiàn)，E.faeciumB21的膽鹽水解酶活性（0.415 U/ mg）顯著高于L.plantarumD28（0.114 U/mg）。綜上表明，L.plantarumD28和E.faeciumB21均具有一定的益生特性，且這2個(gè)菌株均可應(yīng)用于乳酸菌降低膽固醇活性的研究，且L.plantarumD28還可以用于應(yīng)用乳酸菌提高體內(nèi)抗氧化活性的進(jìn)一步研究中。

乳酸菌；生長(zhǎng)特性；抗氧化活性；膽鹽水解酶活性

SummaryProbiotics are defined as“l(fā)iving micro-organisms which,upon ingestion in certain numbers,exert health benefits beyond inherent basic nutrition”.Recent reports have confirmed that probiotics can provide a variety of beneficial health effects, which are strain dependent.The regulation effect of probiotics was based on tolerance of acid environment in the stomach,and resistance to bile salt and trypsin in the small intestine.Most of lactic acid bacteria(LAB)are considered as probiotics,and have been widely used as dietary additives in cultured dairy foods and other fermentation products.The source of LAB may be naturally fermented food or human and animal intestines.

In this study,two strains were isolated from Chinese traditional food(Northeast pickle and stinky beans),and identified asLactobacillus plantarumD28 andEnterococcus faeciumB21 by 16S rRNA gene sequences,respectively.The growth and potential probiotic characteristics of the two lactic acid bacteria strains were further investigated.

Growth curve and the effect of initial pH on the growth were studied by spectrophotometry method.Meanwhile,the resistance characteristics were investigated,including sodium chloride(NaCl),bile salt,artificial gastric juice and artificial intestinal juice.In addition,antioxidant activity and bile salt hydrolase activity(BSH)in vitrowere determined by scavenging DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)free radical and ninhydrin method,respectively.

The results of growth curve showed that the growth rate ofL.plantarumD28 was faster thanE.faeciumB21 under the same culture condition,and the stationary growth phase ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 occurred at 18 h and 16 h, respectively.The growth rate of the two strains was affected by different initial pH;pH ranges of 5.5-7.0 and 6.0-7.0 were most favorite initial pH forL.plantarumD28 andE.faeciumB21,respectively.Moreover,L.plantarumD28 had a good tolerance against NaCl(5%)and bile salt(0.15%)in vitro,andE.faeciumB21 had a better tolerance against NaCl(8%)and bile salt (0.45%).Time-dependent behavior was found in the bacterial survival amount under the artificial gastric juice(pH 2.0)and artificial intestinal juice(pH 8.0)conditions.After treatment with artificial gastric juice(pH 2.0)for 180 min,the survival rate ofL.plantarumD28 was higher thanE.faeciumB21,remaining 41.33 lg(CFU/mL)and 8.33 lg(CFU/mL),respectively.Moreover, similar result was found with treatment of artificial intestinal juice(pH 8.0)for 240 min,36.33 lg(CFU/mL)and 18.67 lg(CFU/ mL)forL.plantarumD28 andE.faeciumB21,respectively.In addition,the two strains had certain antioxidant activityin vitro, andL.plantarumD28 had a higher DPPH free radical scavenging activity(34.86%)than that ofE.faeciumB21(25.32%). Besides,both of the two stains had bile salt hydrolase(BSH)activity,andE.faeciumB21(0.415 U/mg)had a higher BSH activity than that ofL.plantarumD28(0.114 U/mg).

In conclusion,the growth rate of the two strains is affected by different initial pH,andL.plantarumD28 has a higher growth rate thanE.faeciumB21.L.plantarumD28 andE.faeciumB21 both have tolerance to acid,bile salt,and NaCl,and are able to survive under the conditions of artificial gastric juice and artificial intestine juice.Therefore,bothL.plantarumD28 andE.faeciumB21 can be used as candidate for probiotic strains and application for lowering cholesterol research,andL.plantarumD28 can especially be applied to antioxidant-related research.

益生菌是指當(dāng)攝入一定數(shù)量后，能以活菌狀態(tài)到達(dá)胃腸道的單一或特定微生物的混合物。作為促進(jìn)機(jī)體健康的有益菌[1]，益生菌具有增強(qiáng)人體免疫力、調(diào)節(jié)腸道健康、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、降低膽固醇、緩解肥胖、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、減肥等功能[2-6]。為了發(fā)揮其在人體中的有益作用，益生菌必需可以耐受胃中的酸性環(huán)境，抵抗小腸中存在的膽鹽和胰酶，從而順利到達(dá)人體腸道，黏附并定殖在腸道內(nèi)，進(jìn)而發(fā)揮其益生作用[7-8]。目前，一些應(yīng)用于益生菌產(chǎn)品的菌株由于較弱的耐酸、耐膽鹽能力，從而影響了其在機(jī)體腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用[9]。

本實(shí)驗(yàn)室（農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）從傳統(tǒng)發(fā)酵食品——東北泡菜和臭豆子中分離出優(yōu)勢(shì)菌株，并通過16s RNA測(cè)序鑒定，分別為植物乳桿菌D28（Lactobacillus plantarumD28）和糞腸球菌B21（EnterococcusfaeciumB21）。為了更好地開發(fā)和利用這2個(gè)菌株，我們對(duì)其生長(zhǎng)特性、部分益生特性（耐酸、耐NaCl和耐膽鹽特性，耐受人工胃液和人工腸液特性，體外抗氧化和膽鹽水解酶活性）進(jìn)行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

植物乳桿菌D28（L.plantarumD28）分離自東北泡菜，糞腸球菌B21（E.faeciumB21）分離自臭豆子。在MRS（de Man-Rogosa-Sharpe）固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h的菌落形態(tài)如圖1所示：L.plantarumD28菌落凸起，呈圓形，表面光滑，細(xì)密，呈黃色；E. faeciumB21菌落凸起，呈圓形，表面光滑，細(xì)密，色白。革蘭氏染色結(jié)果均為陽性。

圖1 植物乳桿菌D28和糞腸球菌B21在MRS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 on MRS agar plate

1.1.2 試劑

MRS固體和液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限公司）；胃蛋白酶（活性為1∶3 000）、胰酶（1∶250）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；牛膽鹽和瓊脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉和溴甲酚紫（上海生工生物工程股份有限公司）；DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯基苦基苯肼）（Sigma公司，美國(guó)）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)）；TGL-16C型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PL2002電子天平（Mettler-Toledo公司，瑞士）；PHX-DHS-X型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；pHS-3C pH儀（上海雷磁儀器廠）；LDZX-30FA型立式壓力蒸汽式滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；Bioruptor?UCD200超聲波破碎儀（Diagenode公司，比利時(shí)）。

1.2 菌株培養(yǎng)

將待測(cè)試的乳酸菌菌株以1%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，置于37oC厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，連續(xù)培養(yǎng)2代，得到新鮮培養(yǎng)物，備用。

1.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將經(jīng)過2次傳代培養(yǎng)18 h至對(duì)數(shù)期的新鮮培養(yǎng)物按0.1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入MRS培養(yǎng)基中，每隔2 h取樣測(cè)定D600nm值；3次重復(fù)。

1.4 起始pH值對(duì)生長(zhǎng)的影響

將經(jīng)過2次傳代培養(yǎng)的新鮮乳酸菌培養(yǎng)物在6 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）（pH 7.4）離心洗滌3次（避免帶入接種物中的酸性物質(zhì)改變pH），然后按照接種率1%（體積分?jǐn)?shù)）接種到不同起始pH值的MRS液體培養(yǎng)基中，在37oC下靜置培養(yǎng)18 h，測(cè)定培養(yǎng)物在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（D600nm），以判斷起始pH值對(duì)生長(zhǎng)的影響；3次重復(fù)。

1.5 耐受性測(cè)定

將經(jīng)過2次傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的新鮮乳酸菌培養(yǎng)物在4 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用無菌PBS（pH 7.4）離心洗滌3次后，用等量無菌PBS懸浮，備用。

1.5.1 對(duì)NaCl和膽鹽的耐受性

按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量分別將菌株接入到含有不同濃度NaCl或膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基（添加溴甲酚紫）中，在37oC下靜置培養(yǎng)18 h，觀察培養(yǎng)物的產(chǎn)酸變色情況，從而判斷測(cè)試菌株對(duì)NaCl和膽鹽的耐受性；8次重復(fù)。

1.5.2 對(duì)人工胃液的耐受性

參照CHARTERIS等[9]的方法，將0.2 mL細(xì)胞懸液（1×108CFU/mL）接種于膜過濾除菌（0.22 μm）的1.0 mL人工胃液（pH 2.0）和0.3 mL NaCl中，充分混勻，并在37oC恒溫水浴槽中處理，分別于人工胃液處理1、90和180 min后取樣，梯度稀釋，以標(biāo)準(zhǔn)平板法計(jì)數(shù)（稀釋倍數(shù)為1×10－10）；3次重復(fù)。

1.5.3 對(duì)人工腸液的耐受性

參照CHARTERIS等[9]的方法，將0.2 mL細(xì)胞懸液（1×108CFU/mL）接種于膜過濾除菌（0.22 μm）的人工小腸液（pH 8.0）和0.3 mL NaCl中，充分混勻，并在37oC恒溫水浴槽中處理，分別于人工小腸液處理1和240 min后取樣，梯度稀釋，以標(biāo)準(zhǔn)平板法計(jì)數(shù)（稀釋倍數(shù)為1×10－10）；3次重復(fù)。

1.6 清除DPPH自由基的能力測(cè)定

參考LIN等[10]的方法，略微改動(dòng)。將保存的乳酸菌菌株在MRS培養(yǎng)基中2次傳代培養(yǎng)活化，然后按1%（體積分?jǐn)?shù)）接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37oC下培養(yǎng)16～18 h，得到乳酸菌培養(yǎng)物；取1 mL細(xì)胞培養(yǎng)物于6 000 r/min、4oC下離心10 min，收集菌體細(xì)胞沉淀，并用PBS（pH 7.4）洗滌2次，并重新懸浮調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×109CFU/mL（D600nm=1.1），即為乳酸菌的完整細(xì)胞（intact cells,IC）。將獲得的完整細(xì)胞用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞（在功率300 W條件下，冰浴超聲處理5 s，間隔5 s，持續(xù)時(shí)間10 min），然后以4oC、8 000 r/min離心10 min，棄沉淀得到的上清液即為乳酸菌的無細(xì)胞提取物（intracellular cell-free extracts,CFE）。

參照LIN等[11]的方法，略微改動(dòng)。分別取800 μL樣品與1 mL新配制的DPPH溶液（含0.2 mmol/L無水乙醇）于2 mL棕色離心管中混合均勻，置于室溫下避光反應(yīng)30 min，然后將反應(yīng)物以6 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定樣品在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值（As），對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品，其吸光度值記為Ab。對(duì)DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：DPPH清除率=(Ab-As)/Ab×100%。

1.7 膽鹽水解酶活性測(cè)定

乳酸菌菌株無細(xì)胞提取物（CFE）的膽鹽水解酶（bile salt hydrolase,BSH）活性可以通過測(cè)定膽鹽酰胺鍵水解產(chǎn)生的氨基酸的量來確定[12-13]。參考LIONG等[12]的方法，稍做修改，用于測(cè)定菌體胞內(nèi)BSH活性。步驟如下：將過夜培養(yǎng)的細(xì)胞離心分離（4oC，8 000 r/min，10 min），用0.1 mol/L PBS（pH 7.0）洗滌2次，然后再懸浮于PBS（pH 7.0）中，以調(diào)整菌體的D600nm為3～5；加入二硫蘇糖醇10 mmol/L用以減少酶的氧化，隨后用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，功率調(diào)整到H位置，時(shí)間10 min，超聲處理為5 s的開/關(guān)（on/ off）循環(huán)交替，將樣品置于水冷卻器內(nèi)保持在4oC下超聲處理，在4oC、8 000 r/min下離心10 min后，棄沉淀得到的上清液即為CFE，儲(chǔ)存在－20oC冰箱中。取10 μL CFE樣品，加入180 μL PBS（0.1 mol/L，pH 6.0）、10 μL?；撬崮扄}（10 mmol/L）和10 μL液體石蠟，混勻后置于37oC孵育30 min，然后立即加入200 μL質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為15%的三氯乙酸終止反應(yīng)（以反應(yīng)后加入牛磺酸膽鹽的樣品作為對(duì)照組），混合均勻，離心10 min（離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速，4oC），得到上清液；取100 μL上清液（樣品/對(duì)照）與1.9 mL茚三酮試劑［0.5 mL茚三酮按1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的比例溶解于pH 5.5的0.5 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中］充分混合，并與1.2 mL甘油和0.2 mL 0.5 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.5）混合，振蕩混勻，沸水浴14 min，然后在自來水中冷卻3 min，測(cè)定在570 nm處的吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)曲線用甘氨酸制備。BSH的酶活單位表示在單位時(shí)間內(nèi)、單位質(zhì)量總蛋白質(zhì)中的粗酶使?；悄懰崴猱a(chǎn)生氨基酸的物質(zhì)的量。蛋白質(zhì)濃度用Bradford蛋白測(cè)定試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）測(cè)定，并用牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

從圖2可以看出：L.plantarumD28在培養(yǎng)最初的4 h內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)18 h時(shí)D600nm達(dá)到最大，為1.591，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期；E.faeciumB21在培養(yǎng)最初的6 h內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)16 h時(shí)D600nm達(dá)到最大，為0.872，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期；同時(shí)，在相同培養(yǎng)條件下，L.plantarumD28的生長(zhǎng)速度顯著高于E. faeciumB21。

圖2 植物乳桿菌D28和糞腸球菌B21在液體MRS培養(yǎng)基圖2中的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 in MRS Fig.2 medium

2.2 不同初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)情況的影響

分別將L.plantarumD28和E.faeciumB21接種到不同起始pH（2.0～7.0）的MRS液體培養(yǎng)基中，結(jié)果（圖3）表明：L.plantarumD28的最適pH為5.5～7.0，E.faeciumB21的最適pH為6.0～7.0；菌株在低pH值環(huán)境下生長(zhǎng)受到抑制，但仍有一定的存活量，且在pH 4.0～5.5時(shí)，L.plantarumD28的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于E.faeciumB21。

圖3 不同起始pH值對(duì)植物乳桿菌D28和糞腸球菌B21生圖3長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different initial pH on the growth ofL.plantarumD28 Fig.3 andE.faeciumB21

2.3 對(duì)NaCl耐受性測(cè)定結(jié)果

由表1可知：L.plantarumD28和E.faeciumB21在含0%～8.5%NaCl的MRS培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，但隨著NaCl含量的升高，2株菌的生長(zhǎng)逐漸受到抑制；2株菌均可以耐受5%及以下的NaCl，而菌株B21在6.5%～8%NaCl中的耐受性高于D28。

2.4 對(duì)膽鹽耐受性測(cè)定結(jié)果

從表2可知：L.plantarumD28和E.faeciumB21在含牛膽鹽0%～0.45%的MRS培養(yǎng)基中均可以生長(zhǎng)；隨著膽鹽含量的升高，L.plantarumD28和E. faeciumB21的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，且菌株D28在高含量膽鹽環(huán)境中的耐受性明顯低于B21。

2.5 對(duì)人工胃液的耐受性測(cè)定結(jié)果

由表3可知：與對(duì)照相比，在人工胃液（pH 2.0）處理開始階段，L.plantarumD28和E.faeciumB21的數(shù)量沒有明顯差別；當(dāng)人工胃液處理90 min后，L.plantarumD28和E.faeciumB21的存活率降低，分別為176.00 lg(CFU/mL)和102.33 lg(CFU/mL)；而當(dāng)處理180 min后，L.plantarumD28和E.faeciumB21的存活率銳減，但菌株D28的存活量高于B21，分別為41.33 lg(CFU/mL)和8.33 lg(CFU/mL)。

2.6 對(duì)人工腸液的耐受性測(cè)定結(jié)果

由表4可知：在人工腸液（pH 8.0）處理開始階段，L.plantarumD28和E.faeciumB21的數(shù)量沒有明顯差別；當(dāng)人工腸液處理240 min后，L.plantarumD28和E.faeciumB21的存活量降低，分別為36.33 lg(CFU/mL)和18.67 lg(CFU/mL)，且前者對(duì)人工腸液的耐受性高于后者。

表1 植物乳桿菌D28和糞腸球菌B21對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl的耐受性Table 1 Tolerance ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 against NaCl

表2 植物乳桿菌D28和糞腸球菌B21對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽的耐受性Table 2 Tolerance ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 against bile salt

表3 植物乳桿菌D28和糞腸球菌B21對(duì)人工胃液的耐受能力Table 3 Tolerance ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 against artificial gastric juice

表4 植物乳桿菌D28和糞腸球菌B21對(duì)人工腸液的耐受能力Table 4 Tolerance ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 against artificial gastric juice

2.7 對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

圖4顯示，2株試驗(yàn)菌完整細(xì)胞（IC）對(duì)DPPH自由基的清除能力均低于無細(xì)胞提取物（CFE），且L. plantarumD28（34.86%）無細(xì)胞提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力顯著高于E.faeciumB21（25.32%）（P＜0.01），但其無細(xì)胞提取物的DPPH自由基清除能力仍小于50%。

2.8 膽鹽水解酶活性測(cè)定結(jié)果

圖5表明，2株試驗(yàn)菌均具有較好的BSH活性，其中E.faeciumB21的BSH活性為0.415 U/mg，顯著高于L.plantarumD28（0.114 U/mg）（P＜0.01）。

3 討論

微生物生長(zhǎng)曲線分為適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)時(shí)期，在一般微生物試驗(yàn)中，通常采用微生物生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期中后期和穩(wěn)定期的菌液。在本研究中，L.plantarumD28的生長(zhǎng)速度高于E. faeciumB21，在MRS培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)18 h和16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；培養(yǎng)基的起始pH對(duì)菌株的影響很大，在pH 4.0及以下環(huán)境下2株菌的生長(zhǎng)受到抑制，但還是有一定的存活量。

膽鹽是由肝細(xì)胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合而形成的鈉鹽或鉀鹽。目前，耐受膽鹽被認(rèn)為是篩選潛在益生菌菌株的基本標(biāo)準(zhǔn)[14]。前期研究表明，乳酸菌如果能夠在胃腸道中存活和增殖，必須能夠耐受5%左右的NaCl和0.3%的膽鹽環(huán)境[15]。在本試驗(yàn)中，L.plantarumD28可以耐受6%的NaCl，而E. faeciumB21可以耐受8%的NaCl；但0.20%的膽鹽即可抑制L.plantarumD28的生長(zhǎng)，而E.faeciumB21可以耐受0.45%的膽鹽。

圖4 植物乳桿菌D28和糞腸球菌B21對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging capacity ofL.plantarumD28 andE.Fig.4faeciumB21

圖5 植物乳桿菌D28和糞腸球菌B21的膽鹽水解酶活性Fig.5 Bile salt hydrolase activity ofL.plantarumD28 andE.faeciumFig.5 B21

人體只有攝入含有1×107CFU/g以上的乳酸桿菌對(duì)其身體健康才會(huì)有益[14]。但是人體內(nèi)的胃和腸道環(huán)境都具有明顯的抗菌特性，大多數(shù)菌株經(jīng)消化道進(jìn)入胃腸道以后是否能夠抵抗人體內(nèi)惡劣的胃和小腸環(huán)境，是乳酸菌在胃腸道中能否存活和正常發(fā)揮生理作用的先決條件[16]。在本試驗(yàn)中，L. plantarumD28和E.faeciumB21均具有一定的抗氧化活性，且前者顯著高于后者。

DPPH法簡(jiǎn)單、快捷、靈敏并且重復(fù)性好，是評(píng)估菌株抗氧化能力最被廣泛使用的方法。在本試驗(yàn)中，L.plantarumD28和E.faeciumB21均具有一定的抗氧化活性，且L.plantarumD28的活性顯著高于E.faeciumB21。

研究表明，L.plantarum91的BSH活性為0.299 U/mg[17]，且乳酸菌的BSH活性與降低膽固醇水平成正比。在本試驗(yàn)中，E.faeciumB21表現(xiàn)出了顯著的?；悄懰崴饽芰?，能夠產(chǎn)生BSH，具有較高的BSH酶比活力（0.415 U/mg），顯著高于L.plantarumD28。

4 結(jié)論

從發(fā)酵食品中篩選出的2株菌（L.plantarumD28和E.faeciumB21）具有不同的生長(zhǎng)特性，其生長(zhǎng)速度受培養(yǎng)基起始pH值的影響，且在相同培養(yǎng)條件下，L.plantarumD28的生長(zhǎng)速度快于E. faeciumB21；2株菌均具有NaCl和膽鹽耐受性，以及對(duì)人工胃液和人工腸液的耐受性，兩者均具有一定的益生菌特性；2株菌均具有較好的體外抗氧化活性和BSH活性，且L.plantarumD28可作為抗氧化菌株進(jìn)行相關(guān)研究。此外，由于這2株菌均有較好的BSH活性，可以作為降低膽固醇的菌株進(jìn)行相關(guān)研究。

[1]DALIRI E B M,LEE B H.New perspectives on probiotics in health and disease.Food Science and Human Wellness,2015,4(2): 56-65.

[2]LEE Y K.Effect of diet on gut microbiota profile and the implications for health and disease.Bioscience of Microbiota, Food and Health,2013,32(1):1-12.

[3]FEANZ C M P,HUCH M,MATHARA J M.African fermented foods and probiotics.International Journal of Food Microbiology,2014,190(3):84-96.

[4]WANG X,WU Q L,DENG K,et al.A novel method for screening of potential probiotics for high adhesion capacity.Journal of Dairy Science,2015,98(7):4310-4317.

[5]TANIDA M,SHEN J,MAEDA K,et al.High-fat-diet-inducedobesity is attenuated by probiotic strainLactobacillu sparacaseiST11(NCC2461)in rats.Obesity Research&Clinical Practice,2008,2(3):159-169.

[6]RATHER S A,POTHURAJU R,SHARMA R K,et al.Antiobesity effect of feeding probiotic dahi containingLactobacillus caseiNCDC 19 in high fat diet-induced obese mice.Society of Dairy Technology,2014,67(4):504-509.

[7]IYE H S,RAHMAT-ALI G R,Liong M T.Mechanisms of cholesterol removal by lactobacilli under conditions that mimic the human gastrointestinal tract.International Dairy Journal,2010,20(3):169-175.

[8]郭志華,楊洪.分離自藏靈菇的乳酸菌的益生特性.食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(1):151-154. GUO Z H,YANG H.Study on the probiotic of lactic acid bacteria from Tibet kefir.Food&Fermentation Industry,2013,39(1):151-154.(in Chinese with English abstract)

[9]CHARTERIS W P,KELLY P M,MORELLI L,et al. Development and application of anin vitromethodology todetermine the transit tolerance of potentially probioticLactobacillusandBifidobacteriumspecies in the upperhuman gastrointestinal tract.Journal of Application Microbiology,1998, 84(5):759-768.

[10]LIN M Y,YEN C L.Antioxidative ability of lactic acid bacteria.Journal of Agriculture and Food Chemistry,1999,47(4):1460-1466.

[11]LIN M Y,CHANG F J.Antioxidative effect of intestinal bacteriaBifidobacterium longumATCC 15708 andLactobacillus acidophilusATCC 4356.Digestive Diseases&Sciences,2000,45 (8):1617-1622.

[12]LIONG M T,SHAH N P.Bile salt deconjugation ability,bile salt hydrolase activity and cholesterol co-precipitation ability of lactobacilli strains.International Dairy Journal,2005,15(4):391-398.

[13]DONG Z,ZHANG J,LEN B,et al.A bile salt hydrolase gene ofLactobacillus plantarumBBE7with high cholesterol-removing activity.European Food Research&Technology,2012,235(3): 419-427.

[14]陳臣,郭本恒,陳衛(wèi),等.3株益生菌黏附性質(zhì)和機(jī)理的初步研究.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2007,19(6):492-495. CHEN C,GUO B H,CHEN W,et al.Preliminary study on the adhesive properties and mechanisms of three probiotic strains.Chinese Journal of Microbiology,2007,19(6):492-495.(in Chinese with English abstract)

[15]趙瑞香,李云瑞,孫俊良,等.嗜酸乳桿菌在模擬胃腸環(huán)境中抗性的研究.微生物學(xué)報(bào),2002,29(2):35-38. ZHAO R X,LI Y R,SUN J L,et al.Studies on the antagonistic properties ofLactobacillus acidophilusin the imitative gastroenteric environment.Microbiology,2002,29(2):35-38.(in Chinese with English abstract)

[16]ROSS G R,GUSILES C,OLISZEWSKI R,et al.Effects of probiotic administration in swine.Journal of Bioscience and Bioengineering,2010,109(6):545-549.

[17]KUMAR M,NAGPAL R,KUMAR R,et al.Cholesterol-lowering probiotics as potential biotherapeutics for metabolic diseases.Experimental Diabetes Research,2012,2012:902-917.

Growth of two lactic acid bacteria strains and their potential probiotic characteristics.

YANG Jing1,MA Ruhui1,YANG Zhixi1,XU Shuang1,LI Duo2,CHEN Lanming1*(1.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation,Ministry of Agriculture/College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

lactic acid bacteria;growth characteristics;antioxidant activity;bile salt hydrolase activity

TS 201.3

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.05.191

Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(2):239-246

上海市科委項(xiàng)目（B-9500-10-0004）。

陳蘭明（http://orcid.org/0000-0001-9537-8476），E-mail:lmchen@shou.edu.cn

（First author）：楊靜（http://orcid.org/000-0001-8929-5391），E-mail:yangjing621@126.com

2016-05-19；接受日期(Accepted):2016-06-12