改良LAMP快速檢測酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的研究

楊粵，張?zhí)N哲，張先舟，馬曉燕，張偉

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

改良LAMP快速檢測酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的研究

楊粵，張?zhí)N哲，張先舟，馬曉燕，張偉*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

建立改良環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的方法。以酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的16S rRNA基因保守區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，通過熒光曲線、瓊脂糖凝膠電泳和白色沉淀判定擴(kuò)增結(jié)果。同時，對LAMP引物特異性、靈敏度、檢出限進(jìn)行研究。LAMP法在61℃，60 min內(nèi)完成酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的檢測。2株酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌呈陽性結(jié)果，17株非酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌呈陰性結(jié)果，表明該種檢測方法具有高特異性。檢測純菌靈敏度為7.2 CFU/mL，對人工污染蘋果汁樣品中酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的檢出限是18 CFU/mL。LAMP法檢測酸土脂環(huán)酸芽胞桿有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌；16S rRNA；檢測

酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris，A.acidoterrestris）是引起果汁腐敗的主要菌種，是一種嗜酸耐熱、好氧型的革蘭氏陽性菌，其生存能力強(qiáng)，能經(jīng)受酸性條件下的巴氏殺菌過程而存活[1]。A. acidoterrestris在生長代謝時能產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚、2-6-二氯苯酚和2-6-二溴苯酚等物質(zhì)，影響果汁口感。嚴(yán)重的會在包裝物底部出現(xiàn)霧狀渾濁或白色沉淀，破壞果汁質(zhì)量和營養(yǎng)價值[2]。A.acidoterrestris在低濃度時很難檢出，因此一般在果汁產(chǎn)品流通后才會被發(fā)現(xiàn)[3]。在國際貿(mào)易中，果汁產(chǎn)品經(jīng)常會因A.acidoterrestris的污染而被大量的退貨，索賠的事件時有發(fā)生，這不但損害了國家的形象，而且給濃縮果汁產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。現(xiàn)在研究人員對A.acidoterrestris的研究主要集中在是利用防腐劑[1]，天然抗菌劑[5]，物理處理[6]等方法，在加工的過程中控制A.acidoterrestris在果汁中的生長，但是這些方法并不能保證果汁中不存在A.acidoterrestris。因此，建立一種高效、快速的檢測A.acidoterrestris的方法對于我國濃縮果汁產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義[7]。

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法是目前A.acidoterrestris在果汁行業(yè)公認(rèn)的檢測方法[8]，該種檢測方法程序復(fù)雜，勞動密集，至少需要3 d～5 d[9]?？焖贆z測A.acidoterrestris的方法有儀器檢測和分子檢測。其中，儀器檢測包括傅里葉紅外光譜[10]、高效液相色譜指紋圖譜法[11]和電子鼻技術(shù)[12]，儀器檢測實現(xiàn)了檢測的快速準(zhǔn)確，但是需要專業(yè)的操作人，且樣品前處理復(fù)雜。分子檢測包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[13]、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[14]。ELISA檢測靈敏度低且容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。PCR技術(shù)需要精密的溫度循環(huán)裝置，操作僅限于實驗室。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由日本生物學(xué)家Notomi T等[15]發(fā)明的一種新型的體外等溫擴(kuò)增特異核酸片段技術(shù)。該種檢測方法是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異的引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件（65℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸的高效擴(kuò)增。整個擴(kuò)增反應(yīng)在30 min～60 min內(nèi)可以擴(kuò)增出109～1010[16]倍靶序列拷貝。本試驗是在普通LAMP的基礎(chǔ)上，針對A.acidoterrestris的16S rRNA基因保守區(qū)域設(shè)計引物，在反應(yīng)體系中添加了結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBR GreenⅠ，利用實時熒光監(jiān)測儀對反應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)測，建立了A.acidoterrestris快速的檢測方法，為檢測A. acidoterrestris提供了一種更加新型、便捷的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

本試驗共用菌19株，試驗菌株見表1。

表1 實驗菌株Table 1 Strains in this study

1.1.2 主要儀器與試劑

實時熒光監(jiān)測儀（ESE Quant Tube Scanner）：德國Stockach公司；PCR擴(kuò)增儀（Whatman T Gradient基因擴(kuò)增儀）：德國Biometra公司。

Bst DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）、限制性內(nèi)切酶、基因組DNA提取試劑盒：均購自于上海生工生物工程有限公司；SYBR GreenⅠ：購自北京天恩澤基因科技有限公司；Taq DNA polymerase、MgSO4、dNTPs：均購自北京全式金有限公司；LAMP和PCR引物合成：北京華大基因；所有的培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與果汁樣品

K氏培養(yǎng)基（酵母粉2.5 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂粉15.0 g、葡萄糖1.0 g、吐溫80 1.0 mL，溶于1 L無菌蒸餾水中，用蘋果酸調(diào)節(jié)pH（3.7+0.1），115℃滅菌30 min）；濃縮蘋果汁購自保定大型超市并經(jīng)PCR檢測為A.acidoterrestris陰性。

1.2 方法

1.2.1 酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的培養(yǎng)與基因組DNA的提取

取保藏的A.acidoterrestris（CICC10374）在K氏瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，44°C培養(yǎng)24 h，傳代培養(yǎng)2次。挑取傳代培養(yǎng)的單菌落接種至新鮮無菌的K氏液體培養(yǎng)基中，44°C，200 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

采用試劑盒法提取 A.acidoterrestris的基因組DNA，按照說明書操作。

1.2.2 引物設(shè)計

引物是LAMP反應(yīng)成功的關(guān)鍵[17]，本試驗根據(jù)Genebank中A.acidoterrestris 16S rRNA基因組已知序列（基因號：KC193183.1），利用在線軟件（http：//primerexplorer.jp/e/）設(shè)計了4條特異性引物，即F3、B3、FIP和BIP。

F3 GCTTGACATCCCTCTGACC B3 CGCCTTCCTCCGACTTAC

FIPCGACAACCAT GCACCACCT-GGTGCAGAGATGTACCTTC

BIP AGCTCGTGTCGTGAGATGTTG-AGTCCCCACCTCTACGTG

1.2.3 酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌實時熒光LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

建立A.acidoterrestris實時熒光LAMP檢測25 μL反應(yīng)體系，分別對反應(yīng)體系中的溫度、引物濃度、Bst DNA polymerase添加量、dNTPs添加量進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)溫度分別設(shè)置為：59、60、61、62、63℃；內(nèi)外引物比分別設(shè)置為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1；Bst DNA polymerase添加量分別設(shè)置為 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μL；dNTPs添加量分別設(shè)置為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL。確定最適反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

實時熒光LAMP可以通過三種方法分析擴(kuò)增產(chǎn)物：（1）利用實時熒光監(jiān)測儀，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定反應(yīng)結(jié)果；（2）瓊脂糖凝膠電泳；（3）觀察反應(yīng)管底部白色沉淀。

1.2.5 特異性分析

本試驗對2株A.acidoterrestris和17株非A.acidoterrestris進(jìn)行檢測。分別取表1中19株細(xì)菌過夜培養(yǎng)的菌懸液1 mL，用試劑盒法提取各個菌株基因組DNA作為模板，根據(jù)1.2.4建立的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，對LAMP引物進(jìn)行特異性分析。

1.2.6 靈敏度試驗

將A.acidoterrestris的標(biāo)準(zhǔn)菌經(jīng)K氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，利用平板菌落計數(shù)法，測得原菌液濃度為7.2×106CFU/mL。用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，并分別取各個稀釋倍數(shù)菌懸液1 mL，使用試劑盒法提取A.acidoterrestris基因組DNA，進(jìn)行LAMP和PCR靈敏性試驗。

1.2.7 人工污染蘋果汁樣品檢出限分析

人工污染果汁前，經(jīng)PCR法鑒定果汁中不含A. acidoterrestris。挑取K氏培養(yǎng)基上44°C培養(yǎng)12 h的A.acidoterrestris單菌落，制成一定濃度的菌懸液。選取菌懸液1 mL添加到蘋果汁中（25 mL蘋果汁樣品已溶于225 mL無菌生理鹽水中）。利用平板菌落計數(shù)法，測得人工污染蘋果汁樣品混合液中A.acidoterrestris的活菌數(shù)為1.8×105CFU/mL，用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋。分別取各個稀釋倍數(shù)污染樣品均質(zhì)液1 mL，使用試劑盒法提取A.acidoterrestris基因組DNA，進(jìn)行LAMP檢測，確定檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的建立。

按1.2.4所述對LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化。溫度優(yōu)化結(jié)果如圖1所示，當(dāng)反應(yīng)溫度為61°C時，出峰最早；引物比優(yōu)化結(jié)果如圖2所示，當(dāng)內(nèi)外引物比為4∶1時，出峰最早；Bst DNA聚合酶優(yōu)化結(jié)果如圖3所示，當(dāng)添加量為1.0 μL時，出峰最早；dNTPs優(yōu)化結(jié)果如圖4所示，當(dāng)dNTPs添加量為2.5 μL時，出峰最早。經(jīng)過對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最適反應(yīng)體系為：10 μmol/L FIP和BIP各1.6 μL，10 μmol/L F3和B3各0.4 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，8 000 U/mL的Bst DNA聚合酶1.0 μL，50 mmol/L Mg－SO4 2.5 μL，10×Bst DNA聚合酶緩沖液2.5 μL，DNA模板1 μL，SYBR GreenⅠ（400×稀釋）0.5 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL反應(yīng)體系。最佳反應(yīng)溫度61℃，反應(yīng)時間為90 min（根據(jù)擴(kuò)增情況，反應(yīng)可隨時終止）。

擴(kuò)增產(chǎn)物的判定可以通過實時熒光監(jiān)測儀、瓊脂糖凝膠電泳和觀察反應(yīng)管底部白色沉淀。首先利用實時熒光監(jiān)測儀可以隨時觀看擴(kuò)增結(jié)果，陰性無起峰現(xiàn)象，陽性會有明顯的擴(kuò)增曲線（如圖5 A）。其次通過瓊脂糖凝膠電泳觀看擴(kuò)增結(jié)果，陽性會有梯形條帶（如圖5 B）。最后可以通過觀察反應(yīng)管底部白色沉淀，判斷擴(kuò)增結(jié)果，陽性結(jié)果反應(yīng)管會變渾濁或有少量白色沉淀產(chǎn)生（如圖5 C）。3種判定結(jié)果一樣，證明反應(yīng)管1未發(fā)生擴(kuò)增，反應(yīng)管2發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)。

圖1 反應(yīng)溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of temperature

圖2 引物優(yōu)化Fig.2 Optimization of primer

圖3 Bst DNA聚合酶優(yōu)化Fig.3 Optimization of Bst DNA polymerase

圖4 dNTPs優(yōu)化Fig.4 Optimization of dNTPs

2.2 LAMP產(chǎn)物的酶切分析結(jié)果

通過理論推導(dǎo)可知，對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，產(chǎn)生的片段大小應(yīng)為270 bp和180 bp。本實驗中，選用限制性內(nèi)切酶NaeI對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切得到的片段大小與理論值相符（如圖6）。

2.2 LAMP引物特異性分析

圖5 LAMP擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 The results of amplification by LAMP

圖6 LAMP產(chǎn)物酶切結(jié)果分析Fig.6 Enzyme digestion analysis of LAMP

采用2.1建立的反應(yīng)體系，對2株A.acidoterrestris以及17株非A.acidoterrestris進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7所示。通過實時熒光曲線可知僅有2株A.acidoterrestris有明顯的擴(kuò)增曲線，即發(fā)生特異性擴(kuò)增，其他菌株均無明顯的擴(kuò)增曲線（如圖7A～7C）。通過瓊脂糖凝膠電泳可知，僅2株A.acidoterrestris出現(xiàn)梯形條帶，其他菌株均沒有出現(xiàn)梯形條帶（如圖7D）。通過觀察沉淀可知，僅2株A.acidoterrestris有白色沉淀產(chǎn)生，其他菌株無白色沉淀（如圖7E）。3種檢測方法得到結(jié)果相同，證明本實驗中的LAMP引物具有特異性。

2.3 酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌LAMP檢測的靈敏性試驗

酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌LAMP檢測的靈敏性試驗見圖8。

如圖8所示，A.acidoterrestris（CICC10374）濃度為7.2×106CFU/mL～7.2×100 CFU/mL時，反應(yīng)呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線（圖8 A），瓊脂糖凝膠電泳有梯形條帶產(chǎn)生（圖8 B），反應(yīng)管底部有白色沉淀產(chǎn)生（圖8 C）。當(dāng)A.acidoterrestris的濃度為7.2×10－1CFU/mL時，反應(yīng)無典型的擴(kuò)增曲線（圖8 A），瓊脂糖凝膠電泳無梯形條帶產(chǎn)生（圖8 B），反應(yīng)管底部無白色沉淀產(chǎn)生（圖8 C）。同時采用PCR法對A.acidoterrestris的靈敏度進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖8D所示。當(dāng)A.acidoterrestris（CICC10374）濃度為7.2×106CFU/mL～7.2×102CFU/mL時，有擴(kuò)增條帶，當(dāng)A.acidoterrestris（CICC10374）濃度為7.2×101CFU/mL～7.2×10－1CFU/mL時，無擴(kuò)增條帶。因此，LAMP法檢測A.acidoterrestris的靈敏度為7.2× 100 CFU/mL，是PCR檢測法的100倍。

圖7 LAMP引物特異性檢測結(jié)果Fig.7 The specificity of the LAMP primer

圖8 酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌靈敏性試驗Fig.8 The sensitivity of A.acidoterrestris

2.4 人工污染檢出限的確定

當(dāng)人工污染果汁樣品中A.acidoterrestris濃度為1.8×105CFU/mL～18 CFU/mL時，反應(yīng)呈現(xiàn)出典型的擴(kuò)增曲線（圖9 A），瓊脂糖凝膠電泳有梯形條帶產(chǎn)生（圖9 B），反應(yīng)管底部有白色沉淀（圖9 C）。當(dāng)A.acidoterrestris濃度為1.8×100 CFU/mL時，反應(yīng)無擴(kuò)增曲線（圖9 A），瓊脂糖凝膠電泳無梯形條帶產(chǎn)生（圖9 B），試管無白色沉淀（圖9 C）。結(jié)果表明，LAMP法檢測人工污染蘋果汁中A.acidoterrestris污染果汁的檢出限為1.8×101CFU/mL。

3 結(jié)論

圖9 蘋果汁酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的檢出限分析Fig.9 Detection limit of LAMP for A.acidoterrestris in apple juice

酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌被稱為嗜酸嗜熱細(xì)菌，可以經(jīng)受巴氏殺菌而在果汁中存活，給果汁行業(yè)帶來一系列問題[18]。因此，建立一種快速檢測A.acidoterrestris方法勢在必行。李建科等[13]建立的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測蘋果汁中A.acidoterrestris檢出限為105CFU/mL。2014年王周立等[14]基于PCR法建立了快速檢測A. acidoterrestris的研究，確定在檢出限低于10 CFU/mL。陳靜等[19]采用普通的LAMP技術(shù)，實現(xiàn)了檢測靈敏度為4.5×101CFU/mL。本實驗建立的改良LAMP檢測A. acidoterrestris與上述幾種快速檢測方法具有明顯的優(yōu)勢。首先在普通LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)上添加熒光染料SYBR GreenⅠ，使得檢測的靈敏度明顯提高；其次該種檢測方法對擴(kuò)增產(chǎn)物的判定可以通過熒光曲線，瓊脂糖凝膠電泳和裸眼觀察擴(kuò)增反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀，鑒定結(jié)果簡單，可依據(jù)各個檢測機(jī)構(gòu)的條件而選擇不同的判定方法。另外，LAMP引物的設(shè)計是針對靶基因DNA上6個特定的區(qū)域而設(shè)計的4條引物，保證了擴(kuò)增的特異性。但是，在操作時需要注意防污染，避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

從研究結(jié)果可知，基于LAMP技術(shù)改良的檢測方法靈敏度為7.2×100CFU/mL，是普通PCR檢測的10倍。對人工污染蘋果的檢出限為1.8×101CFU/mL，實現(xiàn)了快速高效的檢測。因此，改良的LAMP法檢測酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌操作簡便、耗時少、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢，適合在食品部門得到推廣和應(yīng)用。

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Development of Loop-mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of Alicyclobacillus acidoterrestris

YANG Yue，ZHANG Yun-zhe，ZHANG Xian-zhou，MA Xiao-yan，ZHANG Wei*
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

Development of loop-mediated isothermal amplification method was established to detect for Alicyclobacillus acidoterrestris（A.acidoterrestris）．Taking A.acidoterrestris 16S rRNA gene specific sequence as the target sequence，the primer sequence was designed.The reaction conditions were optimized and results observed by fluorescence curve，agarose gel electrophoresis and turbidity.The specificity，sensitivity and detection limit were detected by this method.The detection could be complished at 61°C within 60 min by LAMP.The specificity of the assay was confirmed using 2 A.acidoterrestris strains and 17 non-A.acidoterrestris strains.The detection sensitivity and detection limit were 7.2 CFU/mL，18 CFU/mL，respectively.The advantages of simple operation，high specificity and sensitivity of LAMP maked it to apply in future.

loop-mediated isothermal amplification（LAMP）；Alicyclobacillus acidoterrestris；16S rRNA；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.038

2016-08-25

楊粵（1991—），女（漢），在讀研究生，研究方向：有害微生物檢測與控制。