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    低氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)鼠胚成骨細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)探討

    2017-05-18 01:28:08施華麗
    關(guān)鍵詞:常氧組氯化促進(jìn)作用

    施華麗

    (浙江醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校, 浙江 杭州 310053)

    低氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)鼠胚成骨細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)探討

    施華麗

    (浙江醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校, 浙江 杭州 310053)

    目的探討低氧誘導(dǎo)因子-1α參與介導(dǎo)的鼠胚成骨細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)。方法由本文作者與某醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室合成完成鼠胚成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定;行成骨細(xì)胞低氧狀態(tài)下培養(yǎng)。結(jié)果經(jīng)氯化鈷處理后,低氧組Caspase-3mRNA和HIF-1α的表達(dá)呈漸趨增加表現(xiàn),具統(tǒng)計(jì)差異(P<0.05),經(jīng)觀(guān)察,除第0d外,均較常氧組高(P<0.05),而各時(shí)間段常氧組變化不明顯(P>0.05)。Bcl-2mRNA表達(dá)呈下降顯示,除0d外,均較常氧組低(P<0.05),各時(shí)間段常氧組變化無(wú)差異(P>0.05)。結(jié)論氯化鈷可對(duì)低氧狀態(tài)化學(xué)模擬,使成骨細(xì)胞有大量的HIF-1α表達(dá),其可通過(guò)對(duì)Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)調(diào)節(jié),對(duì)成骨細(xì)胞凋亡加以促進(jìn),且此種促進(jìn)作用與細(xì)胞缺氧的時(shí)間具密切相關(guān)性。

    低氧誘導(dǎo)因子-1α;鼠胚成骨細(xì)胞;凋亡試驗(yàn)

    骨折愈合有眾多細(xì)胞參與,機(jī)制較為復(fù)雜,所處的愈合階段不同,參與的細(xì)胞也存在較大差異,但以一些骨系細(xì)胞為主,如破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。骨折發(fā)生后,創(chuàng)傷處呈低氧狀態(tài),在骨折愈合過(guò)程中,低氧誘導(dǎo)因子-1α起著重要的調(diào)控作用[1]。本次研究從細(xì)胞凋亡角度展開(kāi)探討,了解在氯化鈷誘導(dǎo)的化學(xué)模擬低氧條件下,對(duì)鼠胚成骨細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行研究,探討其凋亡途徑,現(xiàn)回顧結(jié)果如下。

    1 資料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和儀器、試劑

    由Gibco公司對(duì)高糖DMEM培養(yǎng)基提供,由大連寶生物公司對(duì)DL2000DNA Marker提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其余試劑由某醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心及PCR實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.2 方法

    (1)由本文作者與某醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室合成完成鼠胚成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定;(2)成骨細(xì)胞低氧狀態(tài)下培養(yǎng):取第3代傳代培養(yǎng)的細(xì)胞,培養(yǎng)液為含125umol/L終濃度氯化鈷的DMEM,行不同時(shí)間的培養(yǎng),對(duì)缺氧情況化學(xué)模擬;(3)依據(jù)RNA提取盒相關(guān)操作步驟,對(duì)總RNA提取,行OD260、OD280吸光值測(cè)定,對(duì)RNA提取結(jié)果檢測(cè)。(4)從GeneBank中查找 GAPDH等序列,對(duì)引物設(shè)計(jì)。利用TaKaRa一步法檢測(cè)半定量RT-PCR;(3)測(cè)定PCR:取PCR產(chǎn)物5微摩爾,實(shí)施2%瓊脂糖凝膠電泳操作,在紫外燈下實(shí)施細(xì)致觀(guān)察,經(jīng)凝膠掃描系統(tǒng)實(shí)施光密度計(jì)分掃描,計(jì)算HIF-1a等與CAPDH光密度積分比值,并完成相關(guān)定量分析。(4)抽取蛋白質(zhì)及分析Western blot:對(duì)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的相關(guān)細(xì)胞收獲,用三去污裂解液重懸細(xì)胞,并行3~5 min反復(fù)吹打,完成混勻操作后,于4度條件下,行溫育20 min操作,在12000轉(zhuǎn)離心操作20 min,將上清取出,作為細(xì)胞總蛋白質(zhì),在-70度分裝儲(chǔ)存。取蛋白質(zhì)樣品50~100 μg與等體積上樣緩沖液混合,變性5 min,于8%或12%聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中加載,以恒壓60 v電泳至溴酚藍(lán)達(dá)凝膠底邊,將凝膠取出,用電轉(zhuǎn)儀行轉(zhuǎn)移1~3 h操作,室溫封閉8%脫脂奶粉2 h,分別取Caspase-3多克隆抗體、人兔抗鼠Bcl-2于4度條件下溫育過(guò)液,后取酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫溫育2 h,ECL顯色,對(duì)結(jié)果觀(guān)察。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用spss13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn),P<0.05具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    2 結(jié)果

    經(jīng)氯化鈷處理后,低氧組Caspase-3mRNA和HIF-1α的表達(dá)呈漸趨增加表現(xiàn),具統(tǒng)計(jì)差異(P<0.05),經(jīng)觀(guān)察,除第0 d外,均較常氧組高(P<0.05),而各時(shí)間段常氧組變化不明顯(P>0.05)。Bcl-2mRNA表達(dá)呈下降顯示,除0d外,均較常氧組低(P<0.05),各時(shí)間段常氧組變化無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 各時(shí)間段RT-PCR測(cè)得的相關(guān)指標(biāo)表達(dá)

    3 討論

    骨折愈合病理生理過(guò)程均較復(fù)雜,骨折發(fā)生時(shí),常造成程度不等的骨折端及附近血管、骨膜受損,促使骨折端局部呈缺氧、缺血狀況,心氧分壓在創(chuàng)傷中可呈0~2%降低[2]。后機(jī)體經(jīng)各種機(jī)制,可促使骨折部位發(fā)生再血管化,使此部位血供漸趨提高,正常的氧分壓得以恢復(fù)。機(jī)體需再血管化的時(shí)間通常約1~2周。但創(chuàng)傷發(fā)生后,在氧濃度下降時(shí),復(fù)雜的骨再生過(guò)程即已開(kāi)始。在缺氧過(guò)程中,機(jī)體會(huì)有一種由低氧信號(hào)參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子-HIF-1α表達(dá)。多項(xiàng)研究已證實(shí),HIF-1α在骨折愈合過(guò)程中,可通過(guò)對(duì)VEGF的表達(dá)誘導(dǎo),對(duì)骨折處血管生成加以促進(jìn),進(jìn)而加快骨折愈合進(jìn)程[3]。此外,在骨折愈合早期,在成骨細(xì)胞凋亡進(jìn)程中,HIF-1α可能發(fā)揮中樞紐帶價(jià)值。

    細(xì)胞凋亡主要經(jīng)2種途徑,屬細(xì)胞自身程序性死亡,一種是死亡依賴(lài)途徑,由 Caspase家族的分子參與,以Caspase-3最為常見(jiàn);另一種為線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑,由Bcl-2分子參與。Caspase-3屬對(duì)凋亡有促進(jìn)作用分子,而B(niǎo)cl-2屬對(duì)凋亡抑制的分子。據(jù)相關(guān)研究示,依據(jù)細(xì)胞類(lèi)型差異,HIF-1α對(duì)細(xì)胞凋亡除有促進(jìn)作用產(chǎn)生外,也有抑制作用產(chǎn)生[4-5]。如HIF-1α可經(jīng)結(jié)合ARNT形成二聚體,進(jìn)而對(duì)多數(shù)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制,在腫瘤侵襲過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用;相反,HIF-1α對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞、椎間盤(pán)細(xì)胞的凋亡具一定的促進(jìn)作用。本次研究結(jié)果也證實(shí),相較常氧組,低氧環(huán)境下的成骨細(xì)胞有較高的發(fā)生凋亡的比例,故低氧環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用。

    綜上,氯化鈷可對(duì)低氧狀態(tài)化學(xué)模擬,使成骨細(xì)胞有大量的HIF-1α表達(dá),其可通過(guò)對(duì)Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)調(diào)節(jié),對(duì)成骨細(xì)胞凋亡加以促進(jìn),且此種促進(jìn)作用與細(xì)胞缺氧的時(shí)間具密切相關(guān)性。

    [1] Paveenarat Aukkarasongsup,Naoto Haruyama,Tsutomu Matsumoto,et al.Periostin inhibits hypoxia-induced apoptosis in human periodontal ligament cells via TGF-β signaling[J].BBRC,2013,441 (1):126-132.

    [2] 周 年,黃 偉,廖軍義,等.低氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2誘導(dǎo)的干細(xì)胞成軟骨、成骨分化的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2014/12.

    [3] 趙煥新,李曉宇,姚 紅,等.低氧后處理誘導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)上調(diào)減輕H9c2心肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧損傷[J].生理學(xué)報(bào),2013/03.

    [4] 潘星辰,周韶璋,戴 輝,等.低氧誘導(dǎo)因子-1α mRNA在克唑替尼誘導(dǎo)H2228細(xì)胞凋亡中的作用[J].廣東醫(yī)學(xué),2014/13.

    [5] 景紹武,趙志軍,景尚華,等.低氧誘導(dǎo)因子-1α與鼻咽癌臨床病理特征相關(guān)性Meta分析[J].中華腫瘤防治雜志,2015/07.

    浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目項(xiàng)目編號(hào):2014KYA049。

    本文編輯:彭晚林

    R-332

    B

    ISSN.2095-8242.2017.12.2373.02

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