Bcl-2和PCNA表達(dá)在大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用*

毛挺挺， 鄭亞華， 方紅波， 謝魯吉， 張偉丹， 姜麗萍

(1寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院， 浙江 寧波 325000； 2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院， 上海 200092)

Bcl-2和PCNA表達(dá)在大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用*

毛挺挺1， 鄭亞華1， 方紅波1， 謝魯吉1， 張偉丹1， 姜麗萍2△

(1寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院， 浙江 寧波 325000；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院， 上海 200092)

目的： 探討B(tài)cl-2、PCNA等蛋白表達(dá)在成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的意義。方法: 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成肌細(xì)胞進(jìn)行分組，結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)預(yù)處理2 h及過氧化氫處理，分為正常對(duì)照(control)組、單純bFGF組、氧化應(yīng)激組(H2O2組)和干預(yù)組(bFGF+H2O2組)。免疫組化檢測(cè)Bcl-2和Bax陽(yáng)性沉積顆粒；免疫熒光觀察成肌細(xì)胞形態(tài)及Bcl-2和Bax熒光表達(dá)；Western blot檢測(cè)Bcl-2、PCNA等蛋白表達(dá)情況。結(jié)果: 免疫熒光及免疫組化結(jié)果顯示，與氧化應(yīng)激組比較，干預(yù)組Bcl-2表達(dá)增加，Bax表達(dá)減少；Western blot顯示，干預(yù)組Bcl-2和PCNA水平增加，Bax水平降低。結(jié)論: 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠成肌細(xì)胞損傷參與肌細(xì)胞病理進(jìn)程。Bcl-2和PCNA表達(dá)上調(diào)可減輕成肌細(xì)胞損傷程度。

深部組織損傷； 氧化應(yīng)激； L6成肌細(xì)胞； 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

以往壓瘡研究集中于局部皮損及破潰范圍，往往忽視皮膚完整性深部組織損傷(deep tissue injury，DTI)的發(fā)生。近年來研究顯示，壓瘡受累組織尤以肌層最易損傷[1]。缺血再灌注為DTI形成重要機(jī)制，大量氧自由基及肌細(xì)胞損傷等病理反應(yīng)集中于缺血再灌注過程之中，并在DTI惡化進(jìn)程中起到重要作用[2-3]。目前已有報(bào)道顯示，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)能夠有效緩解大鼠深部肌組織損傷[4]，然而尚未有研究闡明bFGF與壓瘡肌細(xì)胞氧化應(yīng)激間的關(guān)系。因此，本研究通過體外模擬壓瘡氧化應(yīng)激過程，檢測(cè)Bcl-2、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)等蛋白表達(dá)，探討bFGF具體作用，以期在細(xì)胞水平為壓瘡肌組織損傷防治提供一定思路。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠成肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，采用含1%青/鏈霉素及10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhbFGF)由溫州生物與天然藥物研究所提供；過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)購(gòu)自Sigma；胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素和DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為Gibco產(chǎn)品；Hoechst 33258購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；兔單克隆抗Bcl-2、Bax抗體，鼠單克隆抗PCNA、GAPDH抗體及實(shí)驗(yàn)中所用的 II 抗羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、羊抗兔IgG-HRP、驢抗兔IgG-FITC均由Santa Cruz提供。

2 主要方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)為指數(shù)增長(zhǎng)期后，統(tǒng)一換液。根據(jù)有無H2O2及bFGF干預(yù)可分為4組：正常對(duì)照(control)組、單純bFGF組、氧化應(yīng)激組(H2O2組；H2O2濃度及作用時(shí)間的確定參照文獻(xiàn)研究方法及我們前期體外DTI細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建過程[5-6])和干預(yù)組(bFGF+H2O2組；bFGF濃度綜合參考文獻(xiàn)[7-8]選擇)。正常對(duì)照組不做任何處理；單純bFGF組提前給予100 μg/L bFGF 2 h；氧化應(yīng)激組采用100 μmol/L H2O2培養(yǎng)基處理4 h；干預(yù)組給予100 μg/L bFGF預(yù)給2 h后，加入100 μmol/L H2O2繼續(xù)孵育4 h。

2.2 SABC免疫組化 采用SABC法，4%多聚甲醛固定，3% H2O2-甲醇溶液抑制內(nèi)源性過氧化物酶，5% BSA封閉30 min，Bax和Bcl-2的 I 抗?jié)舛染鶠?1∶200，常規(guī)設(shè)立陰性對(duì)照(用PBS代替 I 抗)，于4 ℃冰箱過夜。滴加1∶1 000稀釋的 II 抗，置于37 ℃恒溫箱孵育2 h。PBS洗去未結(jié)合抗體，DAB顯色，中性樹膠封片，陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色顆粒沉積。

2.3 Bcl-2和Bax免疫熒光染色 4%多聚甲醛4 ℃固定，Triton X-100靜置15 min后，5% BSA室溫封閉15 min，滴加1∶200稀釋的Bax I 抗，4 ℃過夜。PBS 洗去未結(jié)合抗體(5 min×3次)，避光滴加1∶300稀釋的熒光 II 抗，黑色濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h。Hoechst 復(fù)染1 min，PBS清洗 5 min×3次，滴加抗熒光淬滅劑并封片，熒光顯微鏡下拍片。染色結(jié)果Hoechst為藍(lán)色，以此定位肌細(xì)胞核；FITC熒光 II抗呈綠色，標(biāo)記Bcl-2和Bax蛋白，隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野(×400)，采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件，統(tǒng)計(jì)任意單位內(nèi)平均熒光強(qiáng)度。

2.4 Western blot 收集不同批次成肌細(xì)胞，加裂解液后刮取蛋白液，離心取上清，采用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白濃度。通過SDS-PAGE 分離蛋白后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST洗去脫脂奶粉(7 min×3次)，兔單克隆Bcl-2、Bax抗體及鼠單克隆PCNA抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜7 min×3次，HRP標(biāo)記IgG II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，最后加入BeyoECL Plus顯色液于凝膠成像儀器曝光。GAPDH作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。運(yùn)用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，以相對(duì)值定量表達(dá)各蛋白。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：Bcl-2和Bax免疫陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要位于胞漿。正常對(duì)照組及單純bFGF組成肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量Bcl-2陽(yáng)性顆粒，少數(shù)細(xì)胞為Bax陽(yáng)性表達(dá)；氧化應(yīng)激組Bcl-2陽(yáng)性顆粒銳減，Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加；bFGF干預(yù)后，Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞增多，Bax表達(dá)隨之減少，見圖1、表1。

2 成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax免疫熒光表達(dá)情況

正常成肌細(xì)胞形態(tài)為梭形或成纖維樣，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，Bax熒光強(qiáng)度低，Bcl-2熒光強(qiáng)。應(yīng)激組肌細(xì)胞Bax熒光表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)收縮明顯，細(xì)胞突起變短或消失。bFGF干預(yù)后，成肌細(xì)胞Bax陽(yáng)性蛋白表達(dá)顯著減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，見圖2、表2。

Figure 1.Bcl-2 and Bax expression in rat myoblasts detected by immunohistochemistry (×200).

圖1 各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白免疫組化結(jié)果

表1 各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax免疫組化結(jié)果

Table 1.The relative expression of Bcl-2 and Bax in rat myoblasts detected by immunohistochemistry (Mean±SD.n=3)

GroupBcl-2BaxControl1.00±0.041.00±0.13bFGF1.05±0.161.16±0.14H2O2 0.35±0.12** 2.27±0.23**bFGF+H2O20.86±0.05##1.14±0.10##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsH2O2.

3 Bcl-2、Bax和PCNA等蛋白的表達(dá)水平

正常對(duì)照組及單純bFGF組Bax蛋白呈現(xiàn)低水平表達(dá)，Bcl-2和PCNA蛋白水平較高。氧化應(yīng)激組成肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)顯著增加，同時(shí)PCNA和Bcl-2蛋白水平降低。給予bFGF干預(yù)后，Bcl-2和PCNA表達(dá)增加，Bax蛋白水平下調(diào)，見圖3、表3。

討 論

壓瘡深部組織損傷為壓瘡中組織嚴(yán)重?fù)p傷類型，其發(fā)生隱匿、后期極易進(jìn)展為難愈性創(chuàng)面。近年來研究顯示，缺血再灌注生成氧自由基致使肌組織繼發(fā)性損傷為DTI關(guān)鍵所在[9]。過氧化氫是機(jī)體細(xì)胞氧化應(yīng)激主要成分之一，目前已應(yīng)用于體外DTI相關(guān)研究[10-11]。本實(shí)驗(yàn)基于前期結(jié)果[5]，以100 μmol/L叔丁基過氧化氫作用4 h為氧化應(yīng)激組，在此基礎(chǔ)上探討bFGF對(duì)大鼠成肌細(xì)胞Bcl-2、PCNA等蛋白影響。

Figure 2.Bcl-2 and Bax expression in rat myoblasts detected by immunofluorescence (×400).

圖2 各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

表2 各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax熒光表達(dá)情況

Table 2.The relative expression of Bcl-2 and Bax in rat myoblasts detected by immunofluorescence (Mean±SD.n=3)

GroupBcl-2BaxControl1.00±0.141.00±0.07bFGF0.97±0.031.07±0.06H2O20.40±0.04**1.51±0.16**bFGF+H2O20.70±0.13##0.82±0.02##

**P<0.01vscontrol;##P< 0.01vsH2O2.

Figure 3.The protein levels of Bcl-2, Bax and PCNA in the rat myoblasts detected by Western blot.

圖3 成肌細(xì)胞Bcl-2、Bax和PCNA蛋白表達(dá)

研究表明，Bcl-2家族蛋白在壓瘡早期肌肉組織受損中具有重要作用，隨著Bcl-2/Bax比值的降低，組織損傷逐漸加重[12]。本實(shí)驗(yàn)氧化應(yīng)激組Bax水平上升而Bcl-2蛋白呈下降趨勢(shì)，這與張恩等[13]在III期壓瘡潰瘍創(chuàng)面中發(fā)現(xiàn)Bax蛋白增加，Bcl-2減少結(jié)果一致。在對(duì)氧化應(yīng)激組成肌細(xì)胞應(yīng)用bFGF進(jìn)行干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)增加明顯，Bax水平下降，提示bFGF上調(diào)Bcl-2/Bax比值有助于降低成肌細(xì)胞損傷，然而損傷減輕也有可能與bFGF上調(diào)細(xì)胞損傷耐受閾或是成肌細(xì)胞本身增殖活性增高相關(guān)。

PCNA是一種分子量為36 kD的細(xì)胞核蛋白，在細(xì)胞周期中同DNA合成一致，為細(xì)胞從G0、G1期進(jìn)入S期的前提[14]。PCNA在各種損傷中常存在表達(dá)下降現(xiàn)象，而損傷恢復(fù)期伴隨該指標(biāo)的增加。bFGF是一種廣譜促有絲分裂的生長(zhǎng)因子[15]。在小型豬全層皮膚缺損創(chuàng)面的研究中，陳濤等[16]發(fā)現(xiàn)bFGF可通過上調(diào)PCNA表達(dá)刺激 DNA合成，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖與遷移，加速創(chuàng)面修復(fù)。傳統(tǒng)觀念中骨骼肌為已分化組織，不具備再生能力，近年來在肌組織基底膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在著具有增殖活性的成肌細(xì)胞，在燒傷應(yīng)激等損傷恢復(fù)過程中通過PCNA結(jié)合細(xì)胞微觀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞能夠增殖融入肌纖維內(nèi)，以維持肌組織體積與功能的穩(wěn)定[17]。本實(shí)驗(yàn)氧化應(yīng)激組成肌細(xì)胞PCNA含量處于較低水平，這可能與氧自由基攻擊位于核小體中組蛋白成分，造成DNA損傷后引起成肌細(xì)胞損傷增加有關(guān)，同時(shí)氧化應(yīng)激本身可破壞成肌細(xì)胞的微環(huán)境。王雅一等[18]報(bào)道PCNA可與蛋白因子結(jié)合參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)以及細(xì)胞損傷等過程。通過外源性bFGF的干預(yù)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)bFGF可上調(diào)成肌細(xì)胞PCNA和Bcl-2表達(dá)，這可能與外源性bFGF結(jié)合成肌細(xì)胞膜表面受體，通過轉(zhuǎn)入具有增殖活性的細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮生物學(xué)功能有關(guān)。

表3 各組成肌細(xì)胞Bcl-2、Bax和PCNA蛋白表達(dá)水平

*P<0.01vscontrol;#P<0.01vsH2O2.

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)bFGF能夠減少氧化應(yīng)激過程中成肌細(xì)胞Bax蛋白水平，同時(shí)增加Bcl-2、PCNA表達(dá)，為bFGF在壓瘡深部組織損傷的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與新思路。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of Bcl-2 and PCNA expression in rat myoblast injury induced by hydrogen peroxide

MAO Ting-ting1, ZHENG Ya-hua1, FANG Hong-bo2, XIE Lu-ji1, ZHANG Wei-dan1, JIANG Li-ping2

(1NingboMedicalCenterLihuiliEasternHospital,Ningbo325000,China;2XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China.E-mail:lipingj@shsmu.edu.cn)

AIM: To explore the role of Bcl-2 and PCNA expression in the injury of rat myoblasts induced by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: Rat myoblasts at growth phase were divided into 4 groups based on basic fibroblast growth factor (bFGF) and H2O2levels: normal control group, bFGF group, model group (H2O2group) and treatment group (bFGF+H2O2group). The expression of Bcl-2 and Bax was observed by immunohistochemistry and fluorescence methods. The protein levels of Bax, Bcl-2 and PCNA were determined by Western blot. RESULTS: Compared with model group, both immunofuorescence and fluorescence in treatment group showed enhanced Bcl-2 and low expression of Bax. Furthermore, the results of Western blot showed up-regulated PCNA and Bcl-2 protein and decreased Bax expression in treatment group.CONCLUSION: Oxidative stress results in the pathologic changes of myoblasts, and the up-regulation of Bcl-2 and PCNA may attenuate myoblast injury.

Deep tissue injury; Oxidative stress; L6 myoblasts; Basic fibroblast growth factor

1000- 4718(2017)05- 0935- 05

2016- 08- 11

2017- 02- 08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81372064); 上海市教委護(hù)理高原學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.028

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