過表達(dá)PGRN抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷

尚立群， 張永慶， 苗 毅， 楊淑梅

(陜西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)一科， 陜西 西安 710068)

過表達(dá)PGRN抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷

尚立群△， 張永慶， 苗 毅， 楊淑梅

(陜西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)一科， 陜西 西安 710068)

目的： 探討顆粒體蛋白前體(progranulin，PGRN)對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的人肺泡上皮A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥的影響。方法: 實驗分為4 組：對照(control)組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞；LPS組用LPS(10 mg/L)處理；PGRN+LPS組在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PGRN 質(zhì)粒后加入LPS處理；pcDNA3.1+LPS組在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒后加入LPS處理。MTT試劑盒檢測細(xì)胞活力；BrdU摻入實驗檢測細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；RT-qPCR和Western blot分別檢測PGRN的mRNA和蛋白表達(dá)；Western blot檢測caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、p65和p-IκB-α的蛋白水平。結(jié)果: 與對照組相比，LPS組的細(xì)胞增殖率下降(P<0.05)，凋亡率上升(P<0.05)，caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，p65和p-IκB-α的蛋白水平增加(P<0.05)，與LPS組相比，PGRN+LPS組的細(xì)胞增殖率上升(P<0.05)，凋亡率下降(P<0.05)，caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，p65和p-IκB-α的蛋白水平降低(P<0.05)。結(jié)論: PGRN過表達(dá)可以減輕LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞增殖、凋亡異常及炎癥因子產(chǎn)生等損傷，這可能與PGRN參與調(diào)控NF-κB信號通路有關(guān)。

顆粒體蛋白前體； 脂多糖； 肺泡上皮細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； NF-κB信號通路

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/成人呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由多種致病因素(如創(chuàng)傷、感染、缺血/再灌注、燒傷等)導(dǎo)致的一種嚴(yán)重的炎癥綜合征，病死率高達(dá)50%～70%，病理特征主要為肺泡上皮細(xì)胞的急性損傷[1]。因此, 作為肺上皮屏障，肺泡上皮細(xì)胞是否能得到有效的修復(fù)是治療ALI/ARDS的關(guān)鍵。顆粒體蛋白前體(progranulin，PGRN)是由 593個氨基酸組成的多功能的生長因子，表達(dá)于多種組織及快速增殖的細(xì)胞中，包括上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及免疫細(xì)胞等[2]，在組織損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退行性病變等方面發(fā)揮重要的作用[2-5]。大量的研究表明，PGRN能通過調(diào)節(jié)不同的信號通路，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、銀屑病等多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要的抗炎作用，但其對肺泡上皮細(xì)胞損傷是否起保護作用尚不清楚。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)是存在于革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中以脂多糖為主的成分，可以引起ALI/ARDS[6-7]，所以本研究采用LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞，探討PGRN過表達(dá)對肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響及作用機制。

材 料 和 方 法

1 藥品、試劑和主要設(shè)備

脂多糖(Sigma)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶(Gibco)；Trizol(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq mixture(TaKaRa)；RIPA 細(xì)胞裂解液、PMSF、核蛋白抽提試劑盒和BCA 蛋白含量測定試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)；抗caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH等 I 抗抗體(Santa Cruz)；抗PGRN、p65和p-IκB-α等 I 抗抗體(Millipore)；II抗抗體(Pierce)；MTT檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)；5-溴-2’-脫氧尿苷(5-bromo-2’-deoxyuridine， BrdU; Sigma)；抗BrdU抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；ELISA法IL-1β、IL-6和TNF-α檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)；7300實時PCR擴增系統(tǒng)(Applied Biosystem)；Western blot設(shè)備、酶聯(lián)免疫檢測儀購自(Bio-Raid)；流式細(xì)胞儀(BD)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及LPS處理 人肺泡上皮細(xì)胞A549為本實驗室保存細(xì)胞株，人肺上皮細(xì)胞株 HPAEpiC 購自ATCC。均用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞融合到80%～90%的時候，用0.25%(含EDTA)的胰酶進行消化傳代。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板, 在對數(shù)生長期加入LPS，使其終濃度為10 mg /L，處理24 h后收集細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-EGFP載體為本實驗室保留。通過PCR擴增人的全長PGRN cDNA，然后將其連接到pcDNA3.1-EGFP載體中，得到pcDNA3.1-PGRN(含EGFP)載體。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到60%后，用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-PGRN或pcDNA3.1-EGFP分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。6 h后，原培養(yǎng)基更換為新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后用LPS處理細(xì)胞24 h用于后續(xù)實驗。

2.3 實驗分組 實驗分為4組：對照(control)組,為正常培養(yǎng)的細(xì)胞；LPS組,用LPS(10 mg /L)處理24 h的細(xì)胞；PGRN+LPS組,細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PGRN質(zhì)粒24 h后，加入LPS處理24 h；pcDNA3.1+LPS組,細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒24 h后，加入LPS處理24 h。

2.4 RT-qPCR實驗 根據(jù)Trizol試劑說明書提取各組細(xì)胞總RNA，并測試RNA濃度和純度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，以cDNA為模板檢測PGRN的mRNA 水平。PGRN的上游引物序列為5’-GGACAGTACTGAAGACTCTG-3’，下游引物序列為5’-GGATGGCAGCTTGTAATGTG-3’。PCR 擴增體系為20 μL，包括10 μL 2×的SYBR Premix Ex Taq mixture，0.2 μmol /L的引物，2 μL的2倍稀釋的cDNA 和RNA-free ddH2O。反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，36個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法比較分析各組mRNA 水平的變化。

2.5 Western blot實驗 使用含有1% PMSF的RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA 蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。取適量樣品進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將總蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h后，分別加入抗PGRN、caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、p-IκB-α和GAPDH等 I 抗4 ℃孵育過夜，洗膜5 min×3次；加入相應(yīng) II 抗室溫孵育2 h，洗膜5 min×4次。經(jīng)Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描，以GAPDH作為內(nèi)參照，灰度分析目的蛋白/GAPDH的相對表達(dá)量。用核蛋白抽提試劑盒提取各組細(xì)胞核蛋白，同上述方法檢測核內(nèi)p65的表達(dá)水平。

2.6 MTT法檢測細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種于96孔板，分別根據(jù)細(xì)胞分組作不同處理，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h。隨后棄上清，每孔中加入100 μL的DMSO并輕輕震蕩10 min使其充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm波長下的吸光度(A)。

2.7 BrdU 摻入實驗 將細(xì)胞接種于置有蓋玻片的24 孔板上，分別根據(jù)細(xì)胞分組作不同處理，在處理后的每孔中加入10 μmol/L BrdU，孵育2 h。然后經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用BrdU抗體在37 ℃孵育2 h，再用熒光 II 抗孵育1 h。最后用DAPI 染細(xì)胞核后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。隨機選擇5個視野，計算BrdU陽性(BrdU+)細(xì)胞數(shù)，取平均值。BrdU+細(xì)胞比例=紅色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用0.25%胰酶(不含EDTA)消化各組細(xì)胞，離心收集。PBS洗滌細(xì)胞2次(離心1 000 r/min，5 min)。加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液吹打懸浮細(xì)胞后，分別加入5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI染色，輕輕搖勻后置室溫閉光孵育15 min。每管再加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，于1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

2.9 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平 將細(xì)胞接種于6孔板，根據(jù)細(xì)胞分組作不同處理后，收集細(xì)胞，1 000×g離心10 min，取上清液，-20 ℃保存。用ELISA試劑盒說明書步驟分別檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

每組實驗均重復(fù)至少3次，計量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組間差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PGRN的過表達(dá)

用Western blot和RT-qPCR方法檢測LPS誘導(dǎo)細(xì)胞中以及轉(zhuǎn)染過表達(dá)PGRN質(zhì)粒后PGRN的表達(dá)變化，可見A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致，與對照組相比，LPS組PGRN的mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比，PGRN+LPS組PGRN的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而pcDNA3.1+LPS組PGRN的mRNA和蛋白水平無顯著變化，見圖1。

Figure 1.The expression of PGRN in the A549 cells (A, B) and HPAEpiC cells (C， D). A, D: the mRNA levels of PGRN were detected by RT-qPCR; B, D: the protein levels of PGRN were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖1 PGRN在A549和HPAEpiC細(xì)胞中的表達(dá)

2 PGRN過表達(dá)促進肺泡上皮細(xì)胞增殖

MTT實驗和BrdU摻入實驗檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力和增殖的影響。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致，與對照組相比，LPS組的細(xì)胞活力和增殖率顯著下降(P<0.05)。與LPS組相比，PGRN+LPS組的細(xì)胞活力和增殖率顯著升高(P<0.05)，而pcDNA3.1+LPS組的細(xì)胞活力和增殖率無顯著變化，見圖2。

Figure 2.PGRN overexpression promoted the proliferation in LPS-induced A549 cells (A, B) and HPAEpiC cells (C, D). A, C: the cell viability was detected by MTT assay; B, D: the cell proliferation was assessed by BrdU incorporation assay. The proliferating cells were BrdU+cells as indicated by arrows. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖2 PGRN過表達(dá)促進肺泡上皮細(xì)胞增殖

3 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡

為了檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的凋亡水平。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞中結(jié)果一致，與對照組相比，LPS組的凋亡率顯著增加(P<0.05)。PGRN+LPS組的凋亡率與LPS組相比顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的影響

為了檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，我們進一步用Western blot方法檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致，與對照組相比，LPS組caspase-3和Bax的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2的蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比，過表達(dá)PGRN顯著下調(diào)caspase-3和Bax的蛋白水平(P<0.05)，顯著上調(diào)Bcl-2的蛋白水平(P<0.05)，見圖4。

5 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)

為了檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的影響，我們用ELISA和Western blot方法檢測了IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致，與對照組相比，LPS處理顯著上調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平(P<0.05)。與LPS組相比，PGRN+LPS組IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平下降，且差異具有顯著性(P<0.05)，見圖5。

6 PGRN過表達(dá)抑制NF-κB信號通路

為了檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的影響，我們用Western blot方法檢測了p65和p-IκB-α的蛋白水平。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致，與對照組相比，LPS組p65和p-IκB-α的蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與LPS組相比，PGRN+LPS組p65和p-IκB-α的蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖6。

Figure 3.PGRN overexpression inhibited LPS-induced cell apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖3 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

Figure 4.The effects of PGRN overexpression on the levels of apoptosis-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖4 PGRN過表達(dá)影響LPS誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

討 論

ALI/ARDS是多種病因所致的一種急性呼吸衰竭，其發(fā)病率和病死率居高不下。ALI/ARDS的發(fā)病機制至今尚不明確，其核心病變表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞的損傷。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可分化為Ⅰ型上皮細(xì)胞，合成分泌肺泡表面活性物質(zhì)，參與氧化代謝，作為某些激素的靶細(xì)胞等多種生物學(xué)功能[8]，其功能特性決定了研究肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷機制在ALI/ ARDS的治療和預(yù)防中具有重要的意義。大量研究表明，PGRN不但能夠調(diào)節(jié)機體正常的發(fā)展，在增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程都發(fā)揮重要的作用。近期研究表明，PGRN能夠減輕LPS誘導(dǎo)的ALI模型小鼠的肺損傷，說明PGRN可能是治療和預(yù)防ALI/ARDS的一個重要靶基因[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞中，PGRN 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低，說明PGRN過表達(dá)可能能夠減輕LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷。本研究通過轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-PGRN 質(zhì)粒，探討PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞損傷的影響及調(diào)控機制。

Figure 5.PGRN overexpression inhibited the production of inflammatory factors in A549 cells (A, B) and HPAEpiC cells (C, D). A, C: the concentrations of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the cell culture supernatant were measured by ELISA; B, D: the protein levels of L-1β, IL-6 and TNF-α were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖5 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生

Figure 6.PGRN overexpression inhibited LPS-induced NF-κB signaling activation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖6 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活

有研究表明，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的快速增殖是保持肺泡連續(xù)性，維護屏障功能和限制氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵因素。若其增生活躍，肺泡壁能迅速得以修復(fù)，重建肺泡上皮功能[10]。PGRN作為一種生長因子，能促進細(xì)胞增殖，并在快速生長的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[11]。本研究結(jié)果表明，LPS處理減緩A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的增殖，而PGRN過表達(dá)能夠顯著促進細(xì)胞增殖。臨床和動物實驗表明，在ALI發(fā)生的不同時期均有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞過度凋亡將會加重ALI的病理變化[12]。氣管內(nèi)注入LPS致ALI小鼠損傷后6 h即可檢測到凋亡的肺泡上皮細(xì)胞[13]。本研究表明，LPS誘導(dǎo)A549和HPAEpiC細(xì)胞凋亡，而PGRN過表達(dá)能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果說明PGRN過表達(dá)能夠緩解LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷，促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。Caspase-3的激活被認(rèn)為是不同途徑引起凋亡的共同通路。Bcl蛋白家族，包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax, 都是線粒體凋亡通路的經(jīng)典標(biāo)記分子。我們發(fā)現(xiàn)，PGRN過表達(dá)顯著抑制LPS誘導(dǎo)的caspase-3和Bax的表達(dá)，同時能夠上調(diào)Bcl-2的水平，說明PGRN抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，可能是通過抑制線粒體凋亡通路而發(fā)揮作用。

炎癥反應(yīng)也是ALI中內(nèi)環(huán)境紊亂的一個重要因素。在LPS引發(fā)ALI的肺灌洗液中，伴有顯著的中性粒細(xì)胞浸潤，而且促炎因子表達(dá)增加。有研究表明，PGRN在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI中發(fā)揮重要的抗炎作用。PGRN能顯著抑制小鼠體質(zhì)量減輕，降低死亡率，并呈劑量依賴性地降低促炎因子的表達(dá)[9]。我們的實驗結(jié)果表明，與對照組相比，LPS組的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著上調(diào)，說明LPS誘導(dǎo)了A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。當(dāng)過表達(dá)PGRN后，發(fā)現(xiàn)與LPS組相比，IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低，說明 PGRN過表達(dá)可以降低LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)。Tang等[14]研究表明，PGRN作為腫瘤壞死因子受體 (tumor necrosis factor receptor，TNFR) 的一種新配體，通過與TNF-α競爭TNFR1/2[15]而拮抗TNF-α介導(dǎo)的NF-κB 等信號通路，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病中發(fā)揮抗炎作用。大量實驗結(jié)果表明，NF-κB在ALI發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[16]，作為轉(zhuǎn)錄因子參與機體的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致肺泡細(xì)胞損傷。本文研究結(jié)果顯示，PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活，說明PGRN可能通過調(diào)控NF-κB信號通路緩解LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究表明PGRN 過表達(dá)能夠緩解LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞增殖凋亡異常、炎性因子產(chǎn)生等損傷，提示PGRN可能是參與調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞生理功能的重要因子。深入研究 PGRN在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中的作用及作用機制，有助于更深入地了解ALI/ARDS的發(fā)病機制，并為治療ALI/ARDS提供新的思路。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

PGRN over-expression inhibits LPS-induced alveolar epithelial cell injury

SHANG Li-qun, ZHANG Yong-qing, MIAO Yi, YANG Shu-mei

(DepartmentofRespiratoryMedicine,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China.E-mail:shangliqunslq@163.com)

AIM: To investigate the effects of progranulin (PGRN) on the proliferation, apoptosis and inflammatory responses in lipopolysaccharide (LPS)-induced human alveolar epithelial A549 cells and HPAEpiC cells.METHODS: The cells were divided into 4 groups: control group (the normal cultured cells), LPS group [the cells were treated with LPS (10 mg/L)]， PGRN+LPS group (the cells were transfected with pcDNA3.1-PGRN plasmids and then treated with LPS)， and pcDNA3.1+LPS group (the cells were transfected with pcDNA3.1-EGFP plasmids and then treated with LPS). The cell viability was measured by MTT assay, cell proliferation was measured by BrdU incorporation assay, and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expression of PGRN at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blot. The protein levels of caspase-3, Bcl-2, Bax, IL-1β, IL-6, TNF-α, p65 and p-IκB-α were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the cell proliferation rate was decreased (P<0.05), and the apoptotic rate was increased (P<0.05) in LPS group. The protein levels of caspase-3 and Bax were significantly up-regulated (P<0.05)， and the expression of Bcl-2 was down-regulated (P<0.05). The protein levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were significantly up-regulated (P<0.05), and the protein levels of p65 and p-IκB-α were enhanced (P<0.05). Compared with LPS group, the cell proliferation rate was increased (P<0.05), and the apoptotic rate was decreased (P<0.05) in PGRN+LPS group. The protein levels of caspase-3 and Bax were significantly down-regulated (P<0.05), and the expression of Bcl-2 was up-regulated (P<0.05). The protein levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were significantly down-regulated (P<0.05), and the protein levels of p65 and p-IκB-α were decreased (P<0.05). CONCLUSION: PGRN over-expression may alleviate LPS-induced abnormal proliferation, apoptosis and inflammatory cytokine production in the A549 cells and HPAEpiC cells, which may be associated with the regulation of NF-κB signaling pathway.

Progranulin; Lipopolysaccharide; Alveolar epithelial cells; Cell proliferation; Apoptosis; NF-κB signaling pathway

1000- 4718(2017)05- 0877- 07

2016- 09- 18

2017- 02- 16

R563.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.018

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