• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    過表達(dá)PGRN抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷

    2017-05-18 12:53:34尚立群張永慶楊淑梅
    中國病理生理雜志 2017年5期
    關(guān)鍵詞:肺泡試劑盒通路

    尚立群, 張永慶, 苗 毅, 楊淑梅

    (陜西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)一科, 陜西 西安 710068)

    過表達(dá)PGRN抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷

    尚立群△, 張永慶, 苗 毅, 楊淑梅

    (陜西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)一科, 陜西 西安 710068)

    目的: 探討顆粒體蛋白前體(progranulin,PGRN)對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的人肺泡上皮A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥的影響。方法: 實驗分為4 組:對照(control)組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞;LPS組用LPS(10 mg/L)處理;PGRN+LPS組在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PGRN 質(zhì)粒后加入LPS處理;pcDNA3.1+LPS組在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒后加入LPS處理。MTT試劑盒檢測細(xì)胞活力;BrdU摻入實驗檢測細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;RT-qPCR和Western blot分別檢測PGRN的mRNA和蛋白表達(dá);Western blot檢測caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、p65和p-IκB-α的蛋白水平。結(jié)果: 與對照組相比,LPS組的細(xì)胞增殖率下降(P<0.05),凋亡率上升(P<0.05),caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),Bcl-2的蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),p65和p-IκB-α的蛋白水平增加(P<0.05),與LPS組相比,PGRN+LPS組的細(xì)胞增殖率上升(P<0.05),凋亡率下降(P<0.05),caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05),Bcl-2的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05),p65和p-IκB-α的蛋白水平降低(P<0.05)。結(jié)論: PGRN過表達(dá)可以減輕LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞增殖、凋亡異常及炎癥因子產(chǎn)生等損傷,這可能與PGRN參與調(diào)控NF-κB信號通路有關(guān)。

    顆粒體蛋白前體; 脂多糖; 肺泡上皮細(xì)胞; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞凋亡; NF-κB信號通路

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/成人呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由多種致病因素(如創(chuàng)傷、感染、缺血/再灌注、燒傷等)導(dǎo)致的一種嚴(yán)重的炎癥綜合征,病死率高達(dá)50%~70%,病理特征主要為肺泡上皮細(xì)胞的急性損傷[1]。因此, 作為肺上皮屏障,肺泡上皮細(xì)胞是否能得到有效的修復(fù)是治療ALI/ARDS的關(guān)鍵。顆粒體蛋白前體(progranulin,PGRN)是由 593個氨基酸組成的多功能的生長因子,表達(dá)于多種組織及快速增殖的細(xì)胞中,包括上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及免疫細(xì)胞等[2],在組織損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退行性病變等方面發(fā)揮重要的作用[2-5]。大量的研究表明,PGRN能通過調(diào)節(jié)不同的信號通路,在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、銀屑病等多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要的抗炎作用,但其對肺泡上皮細(xì)胞損傷是否起保護作用尚不清楚。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)是存在于革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中以脂多糖為主的成分,可以引起ALI/ARDS[6-7],所以本研究采用LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞,探討PGRN過表達(dá)對肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響及作用機制。

    材 料 和 方 法

    1 藥品、試劑和主要設(shè)備

    脂多糖(Sigma);Lipofectamine 2000(Invitrogen);DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)和胰蛋白酶(Gibco);Trizol(Invitrogen);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq mixture(TaKaRa);RIPA 細(xì)胞裂解液、PMSF、核蛋白抽提試劑盒和BCA 蛋白含量測定試劑(碧云天生物技術(shù)研究所);抗caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH等 I 抗抗體(Santa Cruz);抗PGRN、p65和p-IκB-α等 I 抗抗體(Millipore);II抗抗體(Pierce);MTT檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司);5-溴-2’-脫氧尿苷(5-bromo-2’-deoxyuridine, BrdU; Sigma);抗BrdU抗體(武漢博士德生物工程有限公司);ELISA法IL-1β、IL-6和TNF-α檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific);7300實時PCR擴增系統(tǒng)(Applied Biosystem);Western blot設(shè)備、酶聯(lián)免疫檢測儀購自(Bio-Raid);流式細(xì)胞儀(BD)。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及LPS處理 人肺泡上皮細(xì)胞A549為本實驗室保存細(xì)胞株,人肺上皮細(xì)胞株 HPAEpiC 購自ATCC。均用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞融合到80%~90%的時候,用0.25%(含EDTA)的胰酶進行消化傳代。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板, 在對數(shù)生長期加入LPS,使其終濃度為10 mg /L,處理24 h后收集細(xì)胞。

    2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-EGFP載體為本實驗室保留。通過PCR擴增人的全長PGRN cDNA,然后將其連接到pcDNA3.1-EGFP載體中,得到pcDNA3.1-PGRN(含EGFP)載體。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到60%后,用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-PGRN或pcDNA3.1-EGFP分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。6 h后,原培養(yǎng)基更換為新的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后用LPS處理細(xì)胞24 h用于后續(xù)實驗。

    2.3 實驗分組 實驗分為4組:對照(control)組,為正常培養(yǎng)的細(xì)胞;LPS組,用LPS(10 mg /L)處理24 h的細(xì)胞;PGRN+LPS組,細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PGRN質(zhì)粒24 h后,加入LPS處理24 h;pcDNA3.1+LPS組,細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒24 h后,加入LPS處理24 h。

    2.4 RT-qPCR實驗 根據(jù)Trizol試劑說明書提取各組細(xì)胞總RNA,并測試RNA濃度和純度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA,以cDNA為模板檢測PGRN的mRNA 水平。PGRN的上游引物序列為5’-GGACAGTACTGAAGACTCTG-3’,下游引物序列為5’-GGATGGCAGCTTGTAATGTG-3’。PCR 擴增體系為20 μL,包括10 μL 2×的SYBR Premix Ex Taq mixture,0.2 μmol /L的引物,2 μL的2倍稀釋的cDNA 和RNA-free ddH2O。反應(yīng)程序如下:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,36個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt法比較分析各組mRNA 水平的變化。

    2.5 Western blot實驗 使用含有1% PMSF的RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白,BCA 蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。取適量樣品進行SDS-PAGE電泳分離蛋白,然后將總蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h后,分別加入抗PGRN、caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、p-IκB-α和GAPDH等 I 抗4 ℃孵育過夜,洗膜5 min×3次;加入相應(yīng) II 抗室溫孵育2 h,洗膜5 min×4次。經(jīng)Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描,以GAPDH作為內(nèi)參照,灰度分析目的蛋白/GAPDH的相對表達(dá)量。用核蛋白抽提試劑盒提取各組細(xì)胞核蛋白,同上述方法檢測核內(nèi)p65的表達(dá)水平。

    2.6 MTT法檢測細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種于96孔板,分別根據(jù)細(xì)胞分組作不同處理,每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL,37 ℃孵育4 h。隨后棄上清,每孔中加入100 μL的DMSO并輕輕震蕩10 min使其充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm波長下的吸光度(A)。

    2.7 BrdU 摻入實驗 將細(xì)胞接種于置有蓋玻片的24 孔板上,分別根據(jù)細(xì)胞分組作不同處理,在處理后的每孔中加入10 μmol/L BrdU,孵育2 h。然后經(jīng)4%多聚甲醛固定后,用BrdU抗體在37 ℃孵育2 h,再用熒光 II 抗孵育1 h。最后用DAPI 染細(xì)胞核后,激光共聚焦顯微鏡下觀察。隨機選擇5個視野,計算BrdU陽性(BrdU+)細(xì)胞數(shù),取平均值。BrdU+細(xì)胞比例=紅色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

    2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用0.25%胰酶(不含EDTA)消化各組細(xì)胞,離心收集。PBS洗滌細(xì)胞2次(離心1 000 r/min,5 min)。加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液吹打懸浮細(xì)胞后,分別加入5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI染色,輕輕搖勻后置室溫閉光孵育15 min。每管再加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液,于1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

    2.9 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平 將細(xì)胞接種于6孔板,根據(jù)細(xì)胞分組作不同處理后,收集細(xì)胞,1 000×g離心10 min,取上清液,-20 ℃保存。用ELISA試劑盒說明書步驟分別檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    每組實驗均重復(fù)至少3次,計量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析,各組間差異比較采用單因素方差分析,以P<0.05為有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 PGRN的過表達(dá)

    用Western blot和RT-qPCR方法檢測LPS誘導(dǎo)細(xì)胞中以及轉(zhuǎn)染過表達(dá)PGRN質(zhì)粒后PGRN的表達(dá)變化,可見A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致,與對照組相比,LPS組PGRN的mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比,PGRN+LPS組PGRN的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05),而pcDNA3.1+LPS組PGRN的mRNA和蛋白水平無顯著變化,見圖1。

    Figure 1.The expression of PGRN in the A549 cells (A, B) and HPAEpiC cells (C, D). A, D: the mRNA levels of PGRN were detected by RT-qPCR; B, D: the protein levels of PGRN were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

    圖1 PGRN在A549和HPAEpiC細(xì)胞中的表達(dá)

    2 PGRN過表達(dá)促進肺泡上皮細(xì)胞增殖

    MTT實驗和BrdU摻入實驗檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力和增殖的影響。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致,與對照組相比,LPS組的細(xì)胞活力和增殖率顯著下降(P<0.05)。與LPS組相比,PGRN+LPS組的細(xì)胞活力和增殖率顯著升高(P<0.05),而pcDNA3.1+LPS組的細(xì)胞活力和增殖率無顯著變化,見圖2。

    Figure 2.PGRN overexpression promoted the proliferation in LPS-induced A549 cells (A, B) and HPAEpiC cells (C, D). A, C: the cell viability was detected by MTT assay; B, D: the cell proliferation was assessed by BrdU incorporation assay. The proliferating cells were BrdU+cells as indicated by arrows. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

    圖2 PGRN過表達(dá)促進肺泡上皮細(xì)胞增殖

    3 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡

    為了檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響,流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的凋亡水平。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞中結(jié)果一致,與對照組相比,LPS組的凋亡率顯著增加(P<0.05)。PGRN+LPS組的凋亡率與LPS組相比顯著降低(P<0.05),見圖3。

    4 PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的影響

    為了檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響,我們進一步用Western blot方法檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致,與對照組相比,LPS組caspase-3和Bax的蛋白水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2的蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比,過表達(dá)PGRN顯著下調(diào)caspase-3和Bax的蛋白水平(P<0.05),顯著上調(diào)Bcl-2的蛋白水平(P<0.05),見圖4。

    5 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)

    為了檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的影響,我們用ELISA和Western blot方法檢測了IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致,與對照組相比,LPS處理顯著上調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平(P<0.05)。與LPS組相比,PGRN+LPS組IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平下降,且差異具有顯著性(P<0.05),見圖5。

    6 PGRN過表達(dá)抑制NF-κB信號通路

    為了檢測PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的影響,我們用Western blot方法檢測了p65和p-IκB-α的蛋白水平。A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的檢測結(jié)果一致,與對照組相比,LPS組p65和p-IκB-α的蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05);與LPS組相比,PGRN+LPS組p65和p-IκB-α的蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05),見圖6。

    Figure 3.PGRN overexpression inhibited LPS-induced cell apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

    圖3 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

    Figure 4.The effects of PGRN overexpression on the levels of apoptosis-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

    圖4 PGRN過表達(dá)影響LPS誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

    討 論

    ALI/ARDS是多種病因所致的一種急性呼吸衰竭,其發(fā)病率和病死率居高不下。ALI/ARDS的發(fā)病機制至今尚不明確,其核心病變表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞的損傷。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可分化為Ⅰ型上皮細(xì)胞,合成分泌肺泡表面活性物質(zhì),參與氧化代謝,作為某些激素的靶細(xì)胞等多種生物學(xué)功能[8],其功能特性決定了研究肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷機制在ALI/ ARDS的治療和預(yù)防中具有重要的意義。大量研究表明,PGRN不但能夠調(diào)節(jié)機體正常的發(fā)展,在增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程都發(fā)揮重要的作用。近期研究表明,PGRN能夠減輕LPS誘導(dǎo)的ALI模型小鼠的肺損傷,說明PGRN可能是治療和預(yù)防ALI/ARDS的一個重要靶基因[9]。本研究發(fā)現(xiàn),在LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞中,PGRN 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低,說明PGRN過表達(dá)可能能夠減輕LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷。本研究通過轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-PGRN 質(zhì)粒,探討PGRN過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞損傷的影響及調(diào)控機制。

    Figure 5.PGRN overexpression inhibited the production of inflammatory factors in A549 cells (A, B) and HPAEpiC cells (C, D). A, C: the concentrations of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the cell culture supernatant were measured by ELISA; B, D: the protein levels of L-1β, IL-6 and TNF-α were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

    圖5 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生

    Figure 6.PGRN overexpression inhibited LPS-induced NF-κB signaling activation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

    圖6 PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活

    有研究表明,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的快速增殖是保持肺泡連續(xù)性,維護屏障功能和限制氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵因素。若其增生活躍,肺泡壁能迅速得以修復(fù),重建肺泡上皮功能[10]。PGRN作為一種生長因子,能促進細(xì)胞增殖,并在快速生長的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[11]。本研究結(jié)果表明,LPS處理減緩A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的增殖,而PGRN過表達(dá)能夠顯著促進細(xì)胞增殖。臨床和動物實驗表明,在ALI發(fā)生的不同時期均有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,細(xì)胞過度凋亡將會加重ALI的病理變化[12]。氣管內(nèi)注入LPS致ALI小鼠損傷后6 h即可檢測到凋亡的肺泡上皮細(xì)胞[13]。本研究表明,LPS誘導(dǎo)A549和HPAEpiC細(xì)胞凋亡,而PGRN過表達(dá)能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果說明PGRN過表達(dá)能夠緩解LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷,促進細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。Caspase-3的激活被認(rèn)為是不同途徑引起凋亡的共同通路。Bcl蛋白家族,包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax, 都是線粒體凋亡通路的經(jīng)典標(biāo)記分子。我們發(fā)現(xiàn),PGRN過表達(dá)顯著抑制LPS誘導(dǎo)的caspase-3和Bax的表達(dá),同時能夠上調(diào)Bcl-2的水平,說明PGRN抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡,可能是通過抑制線粒體凋亡通路而發(fā)揮作用。

    炎癥反應(yīng)也是ALI中內(nèi)環(huán)境紊亂的一個重要因素。在LPS引發(fā)ALI的肺灌洗液中,伴有顯著的中性粒細(xì)胞浸潤,而且促炎因子表達(dá)增加。有研究表明,PGRN在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI中發(fā)揮重要的抗炎作用。PGRN能顯著抑制小鼠體質(zhì)量減輕,降低死亡率,并呈劑量依賴性地降低促炎因子的表達(dá)[9]。我們的實驗結(jié)果表明,與對照組相比,LPS組的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著上調(diào),說明LPS誘導(dǎo)了A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。當(dāng)過表達(dá)PGRN后,發(fā)現(xiàn)與LPS組相比,IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低,說明 PGRN過表達(dá)可以降低LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)。Tang等[14]研究表明,PGRN作為腫瘤壞死因子受體 (tumor necrosis factor receptor,TNFR) 的一種新配體,通過與TNF-α競爭TNFR1/2[15]而拮抗TNF-α介導(dǎo)的NF-κB 等信號通路,在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病中發(fā)揮抗炎作用。大量實驗結(jié)果表明,NF-κB在ALI發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[16],作為轉(zhuǎn)錄因子參與機體的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng),從而導(dǎo)致肺泡細(xì)胞損傷。本文研究結(jié)果顯示,PGRN過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活,說明PGRN可能通過調(diào)控NF-κB信號通路緩解LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷。

    綜上所述,本研究表明PGRN 過表達(dá)能夠緩解LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和HPAEpiC細(xì)胞增殖凋亡異常、炎性因子產(chǎn)生等損傷,提示PGRN可能是參與調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞生理功能的重要因子。深入研究 PGRN在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中的作用及作用機制,有助于更深入地了解ALI/ARDS的發(fā)病機制,并為治療ALI/ARDS提供新的思路。

    [1] 高 陽, 劉 斌, 哈尼再爾·熱合曼, 等. 黑木耳多糖對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織的保護作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(9): 1704-1708.

    [2] Kanazawa M, Kawamura K, Takahashi T, et al. Progra-nulin[J]. Nihon Rinsho, 2016, 74(4):579-582.

    [3] 趙 霞, 韓世愈. 顆粒蛋白前體在免疫和感染及炎癥中的研究進展 [J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2014, 20(24):4445-4448.

    [4] 黃 闖, 黃 琨. 顆粒蛋白前體在炎癥性疾病中的作用研究進展 [J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2016, 32(2): 268-271.

    [5] Demorrow S. Progranulin: a novel regulator of gastrointestinal cancer progression[J]. Transl Gastrointest Cancer, 2013, 2(3): 145-151.

    [6] 李秀國, 延光海, 張永吉, 等. 1-磷酸鞘氨醇受體2抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(12):2239-2243.

    [7] 姜遠(yuǎn)旭, 徐世元, 張雪萍, 等. 右美托咪定聯(lián)合烏司他丁減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(1):96-101.

    [8] Yanagi S, Tsubouchi H, Miura A, et al. Breakdown of epithelial barrier integrity and overdrive activation of alveolar epithelial cells in the pathogenesis of acute respiratory distress syndrome and lung fibrosis [J]. Biomed Res Int, 2015, 2015:573210.

    [9] Guo Z, Li Q, Han Y, et al. Prevention of LPS-induced acute lung injury in mice by progranulin[J]. Mediators Inflamm, 2012, 2012:540794.

    [10]Wang X, Zhang L, Sun B. Neonatal type II alveolar epithelial cell transplant facilitates lung reparation in piglets with acute lung injury and extracorporeal life support[J]. Pediatr Crit Care Med, 2016, 17(4):e182-e192.

    [11]He Z, Bateman A. Progranulin gene expression regulates epithelial cell growth and promotes tumor growthinvivo[J]. Cancer Res, 1999, 59(13):3222-3229.

    [12]Galani V, Tatsaki E, Bai M, et al. The role of apoptosis in the pathophysiology of Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS): an up-to-date cell-specific review[J]. Pathol Res Pract, 2010, 206(3):145-150.

    [13]Xu M, Cao FL, Zhang YF, et al. Tanshinone IIA therapeutically reduces LPS-induced acute lung injury by inhibiting inflammation and apoptosis in mice[J]. Acta Pharmacol Sin, 2015, 36(2):179-187.

    [14]Tang W, Lu Y, Tian QY, et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice [J]. Science, 2011, 332(6028):478-484.

    [15]Jian J, Zhao S, Tian Q, et al. Progranulin directly binds to the CRD2 and CRD3 of TNFR extracellular domains[J]. FEBS Lett, 2013, 587(21):3428-3436.

    [16]魏海東, 張甲翠, 萬毅新. 核因子κB在急性肺損傷/成人呼吸窘迫綜合征中的作用及治療進展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2011, 17(24):3690-3693.

    (責(zé)任編輯: 盧 萍, 羅 森)

    PGRN over-expression inhibits LPS-induced alveolar epithelial cell injury

    SHANG Li-qun, ZHANG Yong-qing, MIAO Yi, YANG Shu-mei

    (DepartmentofRespiratoryMedicine,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China.E-mail:shangliqunslq@163.com)

    AIM: To investigate the effects of progranulin (PGRN) on the proliferation, apoptosis and inflammatory responses in lipopolysaccharide (LPS)-induced human alveolar epithelial A549 cells and HPAEpiC cells.METHODS: The cells were divided into 4 groups: control group (the normal cultured cells), LPS group [the cells were treated with LPS (10 mg/L)], PGRN+LPS group (the cells were transfected with pcDNA3.1-PGRN plasmids and then treated with LPS), and pcDNA3.1+LPS group (the cells were transfected with pcDNA3.1-EGFP plasmids and then treated with LPS). The cell viability was measured by MTT assay, cell proliferation was measured by BrdU incorporation assay, and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expression of PGRN at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blot. The protein levels of caspase-3, Bcl-2, Bax, IL-1β, IL-6, TNF-α, p65 and p-IκB-α were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the cell proliferation rate was decreased (P<0.05), and the apoptotic rate was increased (P<0.05) in LPS group. The protein levels of caspase-3 and Bax were significantly up-regulated (P<0.05), and the expression of Bcl-2 was down-regulated (P<0.05). The protein levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were significantly up-regulated (P<0.05), and the protein levels of p65 and p-IκB-α were enhanced (P<0.05). Compared with LPS group, the cell proliferation rate was increased (P<0.05), and the apoptotic rate was decreased (P<0.05) in PGRN+LPS group. The protein levels of caspase-3 and Bax were significantly down-regulated (P<0.05), and the expression of Bcl-2 was up-regulated (P<0.05). The protein levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were significantly down-regulated (P<0.05), and the protein levels of p65 and p-IκB-α were decreased (P<0.05). CONCLUSION: PGRN over-expression may alleviate LPS-induced abnormal proliferation, apoptosis and inflammatory cytokine production in the A549 cells and HPAEpiC cells, which may be associated with the regulation of NF-κB signaling pathway.

    Progranulin; Lipopolysaccharide; Alveolar epithelial cells; Cell proliferation; Apoptosis; NF-κB signaling pathway

    1000- 4718(2017)05- 0877- 07

    2016- 09- 18

    2017- 02- 16

    R563.1

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.018

    雜志網(wǎng)址: http://www.cjpp.net

    △通訊作者 Tel: 15991707660; E-mail: shangliqunslq@163.com

    猜你喜歡
    肺泡試劑盒通路
    小肺泡的大作用
    經(jīng)支氣管肺泡灌洗術(shù)確診新型冠狀病毒肺炎1例
    肺泡微石癥并發(fā)氣胸一例報道并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    鈣結(jié)合蛋白S100A8、S100A9在大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及作用
    GlobalFiler~? PCR擴增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗證
    Kisspeptin/GPR54信號通路促使性早熟形成的作用觀察
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細(xì)胞增殖
    通路快建林翰:對重模式應(yīng)有再認(rèn)識
    Hippo/YAP和Wnt/β-catenin通路的對話
    遺傳(2014年2期)2014-02-28 20:58:11
    91九色精品人成在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 丝袜美腿诱惑在线| 国产黄a三级三级三级人| 香蕉av资源在线| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲真实伦在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看 | 悠悠久久av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 波多野结衣高清无吗| 可以在线观看毛片的网站| 国产1区2区3区精品| 国产午夜福利久久久久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产区一区二久久| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产黄片美女视频| 国产av一区二区精品久久| 两个人视频免费观看高清| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲精品在线观看二区| 国产亚洲精品久久久久5区| 日本一区二区免费在线视频| 看黄色毛片网站| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲中文av在线| 好男人在线观看高清免费视频 | 视频区欧美日本亚洲| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 精品乱码久久久久久99久播| 男人的好看免费观看在线视频 | 日本成人三级电影网站| 久久中文看片网| 麻豆av在线久日| 99热这里只有精品一区 | 欧美成人免费av一区二区三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 97碰自拍视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 精品久久久久久成人av| 精品不卡国产一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 好男人在线观看高清免费视频 | 91av网站免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 又黄又粗又硬又大视频| 在线观看一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 中文字幕人成人乱码亚洲影| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲熟女毛片儿| 丰满的人妻完整版| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产精品精品国产色婷婷| bbb黄色大片| 免费在线观看日本一区| 自线自在国产av| 亚洲精品美女久久av网站| 黄片大片在线免费观看| 久久人妻av系列| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲成av人片免费观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产爱豆传媒在线观看 | 在线观看日韩欧美| 成人一区二区视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 色av中文字幕| 在线观看www视频免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 制服诱惑二区| 看黄色毛片网站| 国产男靠女视频免费网站| 免费高清在线观看日韩| 亚洲成国产人片在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 免费电影在线观看免费观看| 午夜老司机福利片| 91九色精品人成在线观看| 美女大奶头视频| 成人午夜高清在线视频 | 天堂√8在线中文| 久久久国产成人免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲全国av大片| 亚洲人成77777在线视频| e午夜精品久久久久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一进一出好大好爽视频| 一进一出抽搐动态| 日韩国内少妇激情av| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精华一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 自线自在国产av| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美大码av| 亚洲男人天堂网一区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 免费高清在线观看日韩| 亚洲男人天堂网一区| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩欧美免费精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 成人手机av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日韩欧美在线二视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一级毛片女人18水好多| 亚洲一区中文字幕在线| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 丁香六月欧美| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 高清毛片免费观看视频网站| 中文资源天堂在线| 精品国产美女av久久久久小说| 久久精品91无色码中文字幕| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲 国产 在线| 亚洲九九香蕉| www.精华液| 亚洲精品在线美女| 国产黄色小视频在线观看| www.精华液| 999久久久精品免费观看国产| 视频区欧美日本亚洲| 婷婷丁香在线五月| 悠悠久久av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 91大片在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线观看66精品国产| 十八禁网站免费在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久精品影院6| 国产视频内射| 亚洲色图av天堂| 久久精品影院6| 免费在线观看亚洲国产| 熟女电影av网| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产黄片美女视频| 淫秽高清视频在线观看| 国产高清videossex| 一区二区三区高清视频在线| 满18在线观看网站| 男男h啪啪无遮挡| 村上凉子中文字幕在线| 一本一本综合久久| 欧美精品啪啪一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| svipshipincom国产片| 老汉色∧v一级毛片| 91av网站免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精华霜和精华液先用哪个| 大香蕉久久成人网| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品乱码久久久久久99久播| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 露出奶头的视频| 亚洲avbb在线观看| www.自偷自拍.com| 麻豆av在线久日| 日日爽夜夜爽网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲五月色婷婷综合| 国产黄a三级三级三级人| 中出人妻视频一区二区| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲片人在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜激情av网站| 久久香蕉国产精品| 亚洲第一电影网av| 亚洲国产精品999在线| 午夜免费激情av| 9191精品国产免费久久| www.999成人在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美日韩乱码在线| 一级毛片高清免费大全| 18禁国产床啪视频网站| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美日韩乱码在线| 看黄色毛片网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产单亲对白刺激| 波多野结衣高清无吗| 丝袜人妻中文字幕| 岛国在线观看网站| or卡值多少钱| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜a级毛片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 曰老女人黄片| 极品教师在线免费播放| 国产激情欧美一区二区| 国产欧美日韩一区二区三| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久人人人人人| 午夜福利视频1000在线观看| 曰老女人黄片| 性色av乱码一区二区三区2| 免费观看精品视频网站| 亚洲第一青青草原| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲国产精品sss在线观看| 黄片大片在线免费观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久天堂一区二区三区四区| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲成人久久性| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av成人一区二区三| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美一级毛片孕妇| 精品人妻1区二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久精品国产亚洲av高清一级| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲成人久久爱视频| 在线观看免费视频日本深夜| 免费人成视频x8x8入口观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 天天添夜夜摸| 黄色毛片三级朝国网站| 十八禁网站免费在线| 日韩欧美在线二视频| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲成人久久爱视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久中文字幕一级| 麻豆一二三区av精品| 18禁国产床啪视频网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 男女午夜视频在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜视频精品福利| 青草久久国产| 一边摸一边做爽爽视频免费| 色精品久久人妻99蜜桃| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品九九99| 一本精品99久久精品77| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲欧美精品综合久久99| 久久久久久人人人人人| 最近在线观看免费完整版| 老汉色∧v一级毛片| 欧美zozozo另类| 午夜日韩欧美国产| 亚洲熟妇熟女久久| 我的亚洲天堂| 亚洲男人天堂网一区| 日韩欧美在线二视频| 亚洲国产精品999在线| 99久久国产精品久久久| 成人av一区二区三区在线看| 男人的好看免费观看在线视频 | 两个人免费观看高清视频| 亚洲免费av在线视频| 少妇粗大呻吟视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产黄色小视频在线观看| 午夜日韩欧美国产| 国产黄a三级三级三级人| 最新美女视频免费是黄的| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精华霜和精华液先用哪个| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜视频精品福利| 在线观看日韩欧美| ponron亚洲| 欧美成狂野欧美在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久精品国产综合久久久| 日韩三级视频一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 国产精品,欧美在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲国产看品久久| 成人三级做爰电影| 成人三级黄色视频| 国产成人欧美在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产97色在线日韩免费| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费看日本二区| 国产男靠女视频免费网站| 国产国语露脸激情在线看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 1024手机看黄色片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久香蕉激情| 一区二区三区高清视频在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲熟女毛片儿| 1024视频免费在线观看| 久久国产精品影院| 欧美zozozo另类| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久亚洲真实| 少妇 在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 1024视频免费在线观看| 亚洲三区欧美一区| 又大又爽又粗| 亚洲成人免费电影在线观看| 中国美女看黄片| 曰老女人黄片| 1024视频免费在线观看| 亚洲三区欧美一区| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美黑人巨大hd| 99国产精品一区二区三区| 欧美日韩乱码在线| 美女国产高潮福利片在线看| 夜夜爽天天搞| 在线观看免费视频日本深夜| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲片人在线观看| 亚洲第一电影网av| 99热只有精品国产| 精品国产乱子伦一区二区三区| 天堂动漫精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黄色毛片三级朝国网站| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲专区字幕在线| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成年版毛片免费区| 麻豆av在线久日| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 青草久久国产| 黄色 视频免费看| 母亲3免费完整高清在线观看| 一本精品99久久精品77| 精品久久久久久久久久久久久 | 91字幕亚洲| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费在线观看日本一区| 99re在线观看精品视频| 免费在线观看黄色视频的| 欧美日韩精品网址| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 大型av网站在线播放| 亚洲av片天天在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 国产亚洲欧美98| 亚洲成人久久性| 中亚洲国语对白在线视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜久久久在线观看| 男女午夜视频在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 黄频高清免费视频| 黄色成人免费大全| 成人手机av| 午夜视频精品福利| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久精品91蜜桃| 成年人黄色毛片网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 午夜免费成人在线视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产av一区二区精品久久| 最近最新中文字幕大全电影3 | 高清在线国产一区| АⅤ资源中文在线天堂| 国产亚洲精品av在线| 午夜亚洲福利在线播放| 少妇 在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 这个男人来自地球电影免费观看| 老司机靠b影院| 99热6这里只有精品| 欧美av亚洲av综合av国产av| 黄色丝袜av网址大全| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品电影一区二区三区| 欧美激情高清一区二区三区| 一二三四在线观看免费中文在| 青草久久国产| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久 成人 亚洲| 亚洲性夜色夜夜综合| 又黄又爽又免费观看的视频| 俺也久久电影网| 午夜福利高清视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 91老司机精品| av在线天堂中文字幕| 激情在线观看视频在线高清| 色综合婷婷激情| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 黄色 视频免费看| 午夜激情福利司机影院| 搡老岳熟女国产| 国产精品 欧美亚洲| 国产成年人精品一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲七黄色美女视频| 少妇 在线观看| 麻豆国产av国片精品| 日本五十路高清| 国产亚洲欧美精品永久| 深夜精品福利| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 身体一侧抽搐| 在线av久久热| 在线永久观看黄色视频| 一级毛片高清免费大全| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 啦啦啦 在线观看视频| 国产亚洲精品一区二区www| 夜夜爽天天搞| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费看日本二区| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 身体一侧抽搐| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 他把我摸到了高潮在线观看| 热re99久久国产66热| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲电影在线观看av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费观看精品视频网站| 日本a在线网址| 一区二区三区激情视频| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品久久久久久精品电影 | а√天堂www在线а√下载| 欧美成人午夜精品| 99久久国产精品久久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久青草综合色| 国产伦人伦偷精品视频| 在线观看www视频免费| 亚洲成a人片在线一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 真人做人爱边吃奶动态| 男女视频在线观看网站免费 | 女性生殖器流出的白浆| 日韩精品中文字幕看吧| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人三级黄色视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久99热这里只有精品18| 看片在线看免费视频| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩欧美 国产精品| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 人人妻人人看人人澡| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产黄a三级三级三级人| 757午夜福利合集在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产一区在线观看成人免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 日韩视频一区二区在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| e午夜精品久久久久久久| 久久中文看片网| 一本综合久久免费| 欧美乱妇无乱码| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲在线自拍视频| 满18在线观看网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 成人国语在线视频| 亚洲精品色激情综合| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 香蕉国产在线看| 成人三级黄色视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 18禁观看日本| svipshipincom国产片| 亚洲av电影在线进入| 少妇 在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 在线免费观看的www视频| 又黄又粗又硬又大视频| 国产熟女午夜一区二区三区| avwww免费| 久久久久久久久中文| 日韩高清综合在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品第一国产精品| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久久人人人人人| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美精品亚洲一区二区| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久久久久黄片| 757午夜福利合集在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 在线国产一区二区在线| 国产成人影院久久av| www.自偷自拍.com| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 怎么达到女性高潮| 90打野战视频偷拍视频| 一本综合久久免费| 色播亚洲综合网| 亚洲三区欧美一区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲av成人av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产视频内射| 久久精品影院6| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| www.999成人在线观看| 成年版毛片免费区| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产精品av久久久久免费| 999精品在线视频| 日韩欧美在线二视频| 亚洲九九香蕉| 国产精品综合久久久久久久免费| 伦理电影免费视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 自线自在国产av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲国产精品成人综合色| 日本五十路高清| 久久青草综合色| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产在线观看jvid| 精品高清国产在线一区| 香蕉国产在线看| 黄色女人牲交|