免疫磁珠酶催化新技術(shù)在H7N9流感病毒高靈敏檢測(cè)中的應(yīng)用

劉 鍵，王艷麗，趙 勇，，吳學(xué)敏，（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京0076；河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，河南鄭州5000；北京諾禾致源科技股份有限公司，北京迪安臨床檢驗(yàn)所有限公司，北京069）

·檢驗(yàn)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

免疫磁珠酶催化新技術(shù)在H7N9流感病毒高靈敏檢測(cè)中的應(yīng)用

劉 鍵1，王艷麗2，趙 勇1，3，吳學(xué)敏1，4（1中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100176；2河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，河南鄭州450002；3北京諾禾致源科技股份有限公司，4北京迪安臨床檢驗(yàn)所有限公司，北京102629）

目的：H7N9型禽流感是一種致病性較強(qiáng)的流感病毒亞型，該型流感病毒于2013年3月底在我國發(fā)現(xiàn)以來，已造成多人死亡，目前對(duì)此病毒還沒有疫苗，沒有特效藥，死亡率一直居高不下.在當(dāng)今病原體檢測(cè)的主要方法中，病原體培養(yǎng)分離法、核酸擴(kuò)增法以及ELISA方法靈敏度較高，但需要專業(yè)儀器設(shè)備和專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室；膠體金法檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便，但是，膠體金檢測(cè)靈敏度低.因而，結(jié)合當(dāng)前國內(nèi)外的最新科學(xué)發(fā)展，尋求一種快速、高靈敏、可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的新技術(shù)尤為迫切.方法：本研究結(jié)合海關(guān)口岸對(duì)傳染病病原體檢驗(yàn)檢疫的需求，利用納米磁顆粒具有酶催化活性的特點(diǎn)，結(jié)合免疫層析技術(shù)，以H7N9病原體為檢測(cè)樣本，分析該新技術(shù)對(duì)H7N9病原體檢測(cè)的敏感性與可靠性.結(jié)果：該新技術(shù)檢測(cè)的敏感度比膠體金法可提高12個(gè)數(shù)量級(jí).結(jié)論：該方法兼具膠體金技術(shù)的快速、簡(jiǎn)便、可現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，又具有高靈敏度的特性，具有發(fā)展為我國海關(guān)口岸檢驗(yàn)檢疫新技術(shù)平臺(tái)的潛力.

納米磁珠；酶催化作用；高靈敏；H7N9

0 引言

有史以來，傳染病一直侵?jǐn)_著人類，歷史上曾造成過幾次大的瘟疫，對(duì)人類的健康帶來了巨大的威脅.據(jù)世衛(wèi)組織報(bào)告（2012－12－20），在過去30多年時(shí)間里至少出現(xiàn)了30種人類新發(fā)傳染病，包括2003年爆發(fā)的SARS疫情（中國）、2014年爆發(fā)的埃博拉（Ebola）疫情（西非國家）［1］、2015年爆發(fā)的中東呼吸綜合征（MERS）疫情（韓國）［2－3］，2015年5月爆發(fā)的寨卡病毒（Zika）疫情（巴西）［4－5］，這些疫情的爆發(fā)均預(yù)示著人類將面臨更多新發(fā)或再發(fā)傳染病的挑戰(zhàn).流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，流感病毒顆粒外膜由兩種表面糖蛋白覆蓋，一種為血細(xì)胞凝集素（hemagglutinin，H），另一種為神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，N），H又分為15個(gè)亞型，N分為9個(gè)亞型.流感病毒可分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型流感依據(jù)流感病毒特征可分為HxNx共135種亞型，H7N9型禽流感就是其中一種致病性較強(qiáng)的亞型.該型流感病毒于2013年3月底在我國的上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)［6］.截至2016年1月10日，全國已確診該病134人，死亡37人，痊愈76人，病例分布于北京、上海、江蘇、浙江、安徽、山東、河南、臺(tái)灣、福建、東莞、汕尾等地.這種病和普通呼吸道疾病差不多，但是非常危險(xiǎn)，目前尚無疫苗、特效藥，死亡率一直居高不下，因此，研制該病的快速、高靈敏的檢測(cè)方法十分必要.

圖1 H7N9型禽流感病毒［6］

目前，病原體檢測(cè)的主要方法有培養(yǎng)分離法［7］、核酸擴(kuò)增法［8－9］、ELISA法［10］和膠體金試紙條檢測(cè)［11］等.在這些方法中，病原體培養(yǎng)分離法、核酸擴(kuò)增法以及ELISA方法靈敏度較高，但需要專業(yè)儀器設(shè)備和專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室；而膠體金法檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便，最有可能廣泛應(yīng)用于病原體現(xiàn)場(chǎng)篩查的海關(guān)口岸檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，但是，膠體金檢測(cè)靈敏度低，這一缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了其在檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域的大范圍應(yīng)用.免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)，它將磁珠特有的優(yōu)點(diǎn)與免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性結(jié)合于一體，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，滲透到醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域.免疫磁珠常應(yīng)用于生化樣品復(fù)雜組分的分離，可有效提高分離速度和富集效率［12－14］.2007年，中科院閻錫蘊(yùn)院士課題組發(fā)現(xiàn)磁納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）具有模擬過氧化物酶的催化功能（被命名為納米酶），能催化過氧化物酶的底物TMB（3，3'，5，5'?四甲基聯(lián)苯胺，3，3'，5，5'?Tetramethylbenzidine）、DAB（二氨基聯(lián)苯胺，3，3'?diaminobenzidine）、OPD（二氨基聯(lián)苯胺，3，3'?diaminobenzidine）顯色［15－16］，進(jìn)一步放大信號(hào)，這一發(fā)現(xiàn)拓展了磁納米材料在生物、醫(yī)學(xué)、檢測(cè)等多領(lǐng)域的應(yīng)用.2015年，該課題組又首次將磁納米顆粒的酶催化活性與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了埃博拉假病毒的高敏感檢測(cè)［17］.這些研究報(bào)道說明免疫磁珠酶催化技術(shù)有望提高現(xiàn)有膠體金免疫層析技術(shù)的敏感性，可為我國海關(guān)口岸檢驗(yàn)檢疫提供一種快速、簡(jiǎn)便、高敏感、可現(xiàn)場(chǎng)使用的新技術(shù).為了檢驗(yàn)這一新技術(shù)的可行性及其潛在的應(yīng)用前景，本研究以H7N9流感病毒為例，基于磁珠納米顆粒的酶催化放大特性，開展了免疫磁珠酶催化新技術(shù)在流感病毒高靈敏檢測(cè)中的應(yīng)用研究，并對(duì)比免疫磁珠層析與膠體金免疫層析的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)其在海關(guān)口岸檢測(cè)中的應(yīng)用前景.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器FeCl3·6H2O、醋酸鈉、乙二醇、乙醇（北京化學(xué)試劑廠），TMB顯色液（中杉金橋），高溫烘箱（天津泰斯特），透射電鏡（JEOL 2000FX 200KV，日本電子公司），酶聯(lián)免疫分析儀（Bio?Rad，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司），噴膜機(jī)（imagene technology，New Hampshire，USA），切條機(jī)（上海金標(biāo)）.

1.2 免疫磁珠酶催化新技術(shù)的設(shè)計(jì)思路利用磁珠納米顆粒酶催化的特性，采用膠體金試紙條類似的設(shè)計(jì)策略，將膠體金納米顆粒替換為具有酶活性的磁珠納米顆粒，與檢測(cè)抗體偶聯(lián)，從而構(gòu)建免疫磁珠抗體探針.當(dāng)免疫磁珠抗體探針與樣品中的H7N9病原體結(jié)合后，層析至試紙條的檢測(cè)線（T線，噴涂有H7N9的捕獲抗體）與對(duì)照線（C線，噴涂有羊抗鼠抗體）時(shí)，免疫磁珠抗體探針與H7N9的復(fù)合物就會(huì)與T線處的捕獲抗體、C線處的羊抗鼠抗體結(jié)合，從而在T線與C線形成磁珠納米顆粒的聚集，這時(shí)加入過氧化物酶的底物如DAB，由于磁珠納米顆粒的酶活性，就會(huì)催化DAB發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成大量棕褐色的沉淀，將檢測(cè)信號(hào)放大10～100倍，實(shí)現(xiàn)H7N9的快速高敏感檢測(cè)（圖2）.

圖2 高敏感免疫磁珠酶催化試紙條檢測(cè)技術(shù)

1.3 磁珠納米顆粒的合成與表征、酶活性測(cè)試根據(jù)水熱法的文獻(xiàn)報(bào)道［18］，合成磁珠納米顆粒.FeCl3·6H2O溶解于乙二醇中，然后加入一定量的醋酸鈉，混合后封裝于高壓反應(yīng)容器中，200℃反應(yīng)16 h，得到的產(chǎn)物用乙醇清洗3次，然后烘干保存.得到的磁珠納米顆粒用透射電鏡（JEOL 2000FX 200KV）表征其形態(tài)和均一性.另外，對(duì)合成的磁珠納米顆粒，測(cè)試其酶催化活性，實(shí)驗(yàn)過程：96孔板中，每100 μL TMB顯色液為一反應(yīng)體系，分別在每一反應(yīng)體系中加入0、0.5、1、2、4、8 μg的磁珠納米顆粒，每一濃度的反應(yīng)做3個(gè)重復(fù)，室溫反應(yīng)5 min后，酶聯(lián)儀讀取OD 652的吸光度值.

1.4 免疫磁珠抗體探針的制備免疫磁珠抗體探針的制備依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［19］，首先將5 mg的EDC（1?（3?二甲氨基丙基）?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽，1?（3?Dime?thylaminopropyl）?3?ethylcarbodiimidehydrochloride）（Sigma?Aldrich）與NHS（N?羥基琥珀酰亞胺，N?Hydroxysuccinimide）（Sigma?Aldrich）溶解于1 mL的去離子水中，然后將制備好的磁珠納米顆粒5 mg加入至上述混合溶液中；30 min后，用去離子水洗兩次磁珠納米顆粒，然后取100 μg／mL的H7N9鼠單克隆抗體M?H7N9（上海安研）與磁珠納米顆粒孵育反應(yīng)（pH6.0 NaAc溶液，4℃過夜或者37℃1 h）；反應(yīng)后用PBS清洗兩次，最后保存于PBS溶液中.

1.5 免疫磁珠酶催化試紙條的組裝免疫磁珠酶催化試紙條的組裝依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［20］，并做了少許改進(jìn)，具體為：首先將硝酸纖維素膜（Millipore）、吸水墊粘貼于背板（20.0 cm×2.5 cm）上，然后用噴膜機(jī)噴涂檢測(cè)線與對(duì)照線.檢測(cè)線噴涂H7N9兔多克隆抗體R?H7N9（上海安研），對(duì)照線噴涂羊抗鼠抗體（Sigma?Aldrich）.噴涂后放置于37℃干燥1 h，然后采用切條機(jī)切成25 mm×5 mm的試紙條，室溫干燥保存.

1.6 免疫磁珠酶催化試紙條對(duì)H7N9病原體的檢測(cè)

首先將免疫磁珠抗體探針稀釋到1%BSA?PBS中，然后取7 μL混合到70 μL梯度稀釋的待檢測(cè)H7N9滅活病毒的培養(yǎng)上清溶液（1∶2，1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000），混合后將制備好的免疫磁珠層析試紙條插入溶液中，層析反應(yīng)10～15 min后，取出試紙條放入DAB顯色液（Sigma?Aldrich）中反應(yīng)3～5 min，觀察試紙條T線、C線上的顏色信號(hào)，判斷檢測(cè)結(jié)果.同時(shí)測(cè)試膠體金試紙條對(duì)H7N9滅活病毒的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)流程同納米酶試紙條流程.

2 結(jié)果

2.1 磁珠納米顆粒的合成與表征合成的磁珠納米顆粒粒徑均一性較好，大小為200～250 nm（圖3）.

圖3 磁納米顆粒電鏡表征圖

對(duì)磁珠納米顆粒酶活性進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)OD 652的讀值，做出酶活性與所加磁珠納米顆粒量的對(duì)應(yīng)關(guān)系（表1，圖4），可以看出，在100 μL反應(yīng)體系中，當(dāng)加入4 μg磁珠納米顆粒時(shí)，基本達(dá)到最大反應(yīng)活性，當(dāng)再增加磁珠納米顆粒用量時(shí)，反應(yīng)活性增加較少.

表1 磁珠納米顆粒酶活性測(cè)試結(jié)果

圖4 磁珠納米顆粒酶活性測(cè)試分析

2.2 磁珠納米顆粒、膠體金試紙條對(duì)H7N9的檢測(cè)結(jié)果磁珠納米顆粒對(duì)H7N9滅活病毒最低的檢測(cè)限為1∶10000～1∶1000（1∶1000時(shí)信號(hào)非常明顯，1∶10000時(shí)也可看到檢出信號(hào)）.當(dāng)稀釋濃度為1∶100000時(shí)，不能夠檢出；而膠體金對(duì)H7N9滅活病毒最低的檢測(cè)限為1∶100，當(dāng)稀釋濃度為1∶1000時(shí)，不能夠檢出，說明磁珠納米顆粒酶活性試紙條的檢測(cè)敏感性比膠體金的高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)（圖5）.

圖5 磁珠納米顆粒、膠體金試紙條對(duì)H7N9的檢測(cè)

3 討論

本研究利用磁珠納米顆粒的酶催化活性，通過酶催化底物形成大量棕褐色沉淀，從而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的策略，研發(fā)了H7N9病原體的磁珠納米顆粒酶催化免疫層析試紙條檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫磁珠酶催化試紙條的檢測(cè)敏感性比目前通用的膠體金法高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，這種新的設(shè)計(jì)策略為提高免疫層析技術(shù)的靈敏度提供了新思路.但本研究所提出的這種新方法仍有改進(jìn)的地方，比如在免疫層析后，需要將試紙條浸入顯色液中反應(yīng)顯色，這個(gè)過程如能簡(jiǎn)化為顯色試劑直接滴加到試紙條上則可節(jié)約試劑也可節(jié)約時(shí)間，這也是本研究作者目前正在優(yōu)化的工作.總體來講，由于磁珠納米顆粒制備容易、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，疫磁珠酶催化試紙條可以被推廣為一種通用的檢測(cè)新技術(shù)，這也為流感病毒的快速、高靈敏檢測(cè)，為我國海關(guān)口岸的檢驗(yàn)檢疫及衛(wèi)生防控提供了一個(gè)新的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái).

4 致謝

感謝中國科學(xué)院生物物理研究所閻錫蘊(yùn)院士、段德民副研究員在課題實(shí)施過程中給予的建議和指導(dǎo).

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S855.3

A

2095?6894（2017）04?52?04

2016－12－13；接受日期：2016－12－30

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015IK319）

劉 鍵.副研究員.研究方向：傳染病檢測(cè).

E?mail：liuj9919＠163.com