湖北省黃岡地區(qū)嚙齒動(dòng)物攜帶漢坦病毒M片段基因特征分析

劉冰玉，倪向榮，冉從盾，唐 輝，陳禹銘，劉東瀛，楊占秋

（武漢大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所，病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2第一臨床學(xué)院，3第二臨床學(xué)院，湖北武漢430071）

·預(yù)防與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

湖北省黃岡地區(qū)嚙齒動(dòng)物攜帶漢坦病毒M片段基因特征分析

劉冰玉1，倪向榮2，冉從盾3，唐 輝2，陳禹銘2，劉東瀛1，楊占秋1

（武漢大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所，病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2第一臨床學(xué)院，3第二臨床學(xué)院，湖北武漢430071）

目的：探討湖北省黃岡地區(qū)野生嚙齒動(dòng)物自然感染漢坦病毒（hantavirus）情況及病毒基因分型特征.方法：2012～2013年秋冬季在湖北省黃岡地區(qū)的野外及居民區(qū)采用夾夜法捕鼠.對捕獲的動(dòng)物進(jìn)行分類鑒定，取其肺臟提取RNA，合成Seoul病毒（SEOV）和漢灘病毒（HTNV）特異性引物，以RT?PCR方法擴(kuò)增部分M片段核苷酸序列，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和序列同源性分析.結(jié)果：共捕獲嚙齒類動(dòng)物95只，其中褐家鼠75只（78.94%）.6份（8.00%）褐家鼠標(biāo)本SEOV陽性.系統(tǒng)發(fā)育分析關(guān)系顯示當(dāng)?shù)豐EOV屬于A組，與Z37株同源性為95.80%～96.30%（核苷酸），97.90%～100%（氨基酸）.黃胸鼠和黑線姬鼠SEOV和HTNV均為陰性.結(jié)論：湖北省黃岡地區(qū)的優(yōu)勢鼠種是褐家鼠，漢坦病毒型別主要是SEOV，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系屬于A組，且與疫苗株Z37同源性最高.該研究結(jié)果有助于為黃岡地區(qū)HFRS的預(yù)防提供理論依據(jù).

漢坦病毒；嚙齒動(dòng)物；基因；系統(tǒng)發(fā)育分析

0 引言

漢坦病毒（Hantavirus，HV）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，為有包膜的負(fù)鏈RNA病毒，其基因組由大（L）、中（M）、小（S）三個(gè)片段組成，分別編碼RNA聚合酶，包膜表面糖蛋白Gn和Gc，以及核衣殼蛋白.包膜表面糖蛋白Gn和Gc上有多個(gè)抗原表位，因此M片段有較大的進(jìn)化壓力［1］，變異度較大.

HV感染人類后能引起腎綜合征出血熱（hemor?rhagic fever with renal syndrome，HFRS）和漢坦病毒肺綜合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS）.亞洲地區(qū)主要以HFRS為主［2］.目前，在全世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)HV有23個(gè)種和30個(gè)暫定的種［3］.HV的自然宿主是嚙齒動(dòng)物，食蟲目動(dòng)物和蝙蝠［4－5］.作為自然宿主，其被感染后無明顯癥狀，病毒在體內(nèi)繁殖，通過排泄物或氣溶膠把病毒排出體外并被人類接受，導(dǎo)致感染［6］.研究認(rèn)為，自然宿主長期攜帶病毒而不患病，只不斷向外排毒，是因?yàn)椴《鹃L期在中間宿主上生活，為了適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境而相應(yīng)改變了其遺傳物質(zhì)，完成病毒與自然宿主的共進(jìn)化，最終導(dǎo)致了一種HV對應(yīng)一種或親緣相近的幾種自然宿主.即在HV的進(jìn)化中，共分化［7］和宿主轉(zhuǎn)移［7］均起到重要作用［8］.

在我國，HFRS主要由HV中的漢灘病毒（Han?taan virus，HTNV）和漢城病毒（Seoul virus，SEOV）兩型病毒引起，這兩型病毒的主要自然宿主分別是黑線姬鼠和褐家鼠.由于HV與宿主動(dòng)物間的對應(yīng)關(guān)系，宿主動(dòng)物的類型及其感染情況決定了疫區(qū)流行病毒的型別和流行強(qiáng)度.因此，弄清當(dāng)?shù)亓餍械腍V基因型別是采取有效防制策略的先決和必要條件.

近年來，每年全球約有30 000人感染HV而致?。?］，中國是受HV危害最嚴(yán)重的國家［10］，而湖北省又是HFRS流行區(qū)［11－13］，黃岡地區(qū)則是其主要疫區(qū)之一，但是該疫區(qū)內(nèi)流行的HV的基因型尚不明確.為了研究該地區(qū)宿主動(dòng)物攜帶HV的陽性率和基因分型特點(diǎn)，本研究在2012～2013年捕獲宿主動(dòng)物，并對其攜帶的HV進(jìn)行了M片段擴(kuò)增、測序以及核酸和蛋白序列分析.

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本采集2012～2013年秋冬季在黃岡地區(qū)HFRS流行疫點(diǎn)周圍的野外及居民區(qū)采用夾夜法，晚放晨取捕鼠.對捕獲的鼠類經(jīng)分類鑒定和登記后，無菌解剖采集鼠肺標(biāo)本，放置于液氮中保存待檢.

1.2 引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank中HV基因序列，參考Liu等文獻(xiàn)［13］，針對HTNV、SEOV分別設(shè)計(jì)兩對M片段特異性引物.SEOV引物（nt 53?490）：SEO?M32F／SEO?M343R，SEO?M238F／M511R；HTNV（nt 61?496）引物：HTN?M40F／HTN?M282R和HTN?M255F／M517R（表1）.

表1 漢坦病毒M片段特異性RT?PCR引物

1.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）及測序用RNAprep Tissue Kit（Qiagen）從鼠肺中提取RNA.用隨機(jī)引物和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶（Promega）合成cDNA.用上述引物擴(kuò)增部分M片段，并設(shè)置陽性對照（SEOV，HTNV病毒標(biāo)準(zhǔn)株），陰性對照（水）.具體擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒（Qiagen）進(jìn)行純化.用ABI 3730自動(dòng)測序儀測序.

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析用BioEdit軟件進(jìn)行基因序列比對及同源性分析，用MrBayes3.1軟件進(jìn)行種系發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.其他用于比較的HV序列來自于GenBank數(shù)據(jù)庫.

2 結(jié)果

2.1 嚙齒動(dòng)物采集在黃岡地區(qū)居民區(qū)及野外共捕獲嚙齒類動(dòng)物95只，其中褐家鼠75只，黃胸鼠14只，黑線姬鼠6只.褐家鼠占總數(shù)的78.94%，為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢鼠種.

2.2 RT?PCR在75份褐家鼠中，有6份（8.00%）標(biāo)本SEOV特異性RT?PCR陽性（圖1），并進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序.全部褐家鼠標(biāo)本HTNV特異性RT?PCR均為陰性.14份黃胸鼠和6份黑線姬鼠標(biāo)本，SEOV和HTNV特異性RT?PCR均為陰性.

圖1 SEOV陽性樣本M片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析和同源性分析用SEOV部分M片段核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2.黃岡地區(qū)6份SEOV陽性褐家鼠標(biāo)本，編號(hào)分別為：MQ1?12，MQ1?14，MQ1?15，MQ2，MQ2?17，MQ2?20，在系統(tǒng)發(fā)育樹中均屬于SEOV的A組.其中4份標(biāo)本（MQ1?12，MQ1?14，MQ1?15，MQ2?17）有較高的相似度（核苷酸序列相似度為98.80%～100%，氨基酸序列相似度為98.60%～100%）（表2）.另2份標(biāo)本（MQ2?2，MQ2?20）與這4份標(biāo)本的相似度為核苷酸序列相似度為94.50%～95.60%，氨基酸序列相似度為97.20%～100%.黃岡地區(qū)SEOV與其他SEOV代表株（80?39，R22，Z37，L99）相比較，相似度為核苷酸序列94.50%～96.30%，氨基酸序列95.80%～100%，與Z37病毒同源性最高（核苷酸序列95.80%～96.30%，氨基酸序列97.90%～100%）.

表2 黃岡地區(qū)嚙齒動(dòng)物攜帶SEOV與其他SEOV代表株的核苷酸、氨基酸序列相似度（%）

圖2 SEOV部分M片段基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

湖北省黃岡地區(qū)位于湖北省東部、大別山南麓、長江中游北岸.北接河南、東連安徽、南與鄂州、黃石、九江隔江相望.黃岡北部和東部為大別山低山丘陵，海拔多在500～800米；中部為海拔100～250米的丘陵崗地；南部為長江沖積平原，多湖泊.黃岡市自北向南逐漸傾斜、東北部與豫皖交界為大別山脈，主脊呈西北?東南走向.黃岡屬亞熱帶大陸性季風(fēng)氣候，江淮小氣候區(qū)，四季光熱界線分明.其生態(tài)環(huán)境適于鼠類繁殖，是湖北省HFRS的主要疫區(qū)之一.

Zhang等［14］關(guān)于湖北省HFRS流行病學(xué)的研究表明，黃岡地區(qū)的HFRS年發(fā)病率，1980～1989年為（5～30）／10 000，1990～1999年和2000～2009年降低為（0～5）／10 000.湖北省HFRS空間?時(shí)間分布的分析表明，在2000～2003年黃岡最有可能為HFRS的聚集地.黃岡地區(qū)HFRS發(fā)病季節(jié)，1980～1989年為秋冬季＞70%，1990～1999年和2000～2009年秋冬季發(fā)病占30%～70%.HTNV相關(guān)的HFRS發(fā)病高峰在秋冬季，而SEOV相關(guān)的HFRS發(fā)病高峰在春季.以上HFRS發(fā)病高峰時(shí)間的變化提示，在上世紀(jì)80年代，黃岡地區(qū)HFRS主要是由HTNV引起的，而從上世紀(jì)90年代到2009年，SEOV引起的HFRS比例升高.

本研究開展了黃岡地區(qū)嚙齒動(dòng)物攜帶HV的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)貎?yōu)勢鼠種為褐家鼠，其次還有黃胸鼠和黑線姬鼠.RT?PCR檢測褐家鼠的HV攜帶率為8.00%，所攜帶病毒均為SEOV.本研究未檢測到黃胸鼠和黑線姬鼠攜帶HV.提示黃岡地區(qū)HV的自然宿主以褐家鼠為主，病毒分型以SEOV為主.

Lin等［15］關(guān)于SEOV的分析表明，所有國外以及中國的大多數(shù)SEOV在系統(tǒng)發(fā)育樹中屬于A組，而中國山區(qū)的SEOV構(gòu)成了B，C和D組.A組SEOV起源于中國，然后擴(kuò)散到歐洲和世界范圍.本研究對黃岡地區(qū)嚙齒動(dòng)物攜帶HV進(jìn)行了部分M片段基因測序，系統(tǒng)發(fā)育分析.發(fā)現(xiàn)黃岡地區(qū)6只褐家鼠攜帶的SEOV均屬于A組，而并未發(fā)現(xiàn)屬于B、C和D組的SEOV.同源性分析提示黃岡地區(qū)SEOV與Z37病毒株同源性最高.

SEOV主要由褐家鼠攜帶，能引起輕型HFRS，導(dǎo)致人群隱性感染的幾率高于HTNV.近幾年HV流行病學(xué)研究表明我國某些其他地區(qū)也是以SEOV為主［16］.這提示隨著我國城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加快，由褐家鼠攜帶的SEOV的流行有逐漸擴(kuò)大的趨勢.

本研究應(yīng)用RT?PCR、基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析的方法，從分子生物學(xué)的角度證實(shí)了黃岡地區(qū)嚙齒動(dòng)物攜帶的HV以SEOV為主，從而為本地區(qū)HFRS的預(yù)防控制提供了科學(xué)依據(jù).

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Genetic analysis of M segment in hantavirus?es carried by wild rodents from the Huang?gang area，Hubei province

LIU Bing?Yu1，NI Xiang?Rong2，RAN Cong?Dun3，TANG Hui2，CHEN Yu?Ming2，LIU Dong?Ying1，YANG Zhan?Qiu11Institute of Medical Virology，State Key Laboratory of Virology，School of Basic Medical Sciences，2The First Clinical School，3The Second Clinical School，Wuhan University，Wuhan 430071，China

AIM：To study the infection and genotyping charac?teristics of hantavirus in wild rodents from the Huanggang area in Hubei province，China.METHODS：Rodents were captured in residential area and fields with night trapping method in Huang?gang，Hubei province during autumn and winter from 2012 to 2013.The species of rodents were identified.Then RNA was extracted from lung tissues.Partial M segments of Seoul virus（SEOV）and hantaan virus（HTNV）were detected by using specific RT?PCR.PCR products were sequenced.Phylogenetic relationship and sequence homology were analyzed by using Mr?Bayes 3.1 and BioEdit.RESULTS：A total of 95 rodents were captured，including 75（78.94%）Rattus norvegicus.Six（80%）Rattus norvegicus were identified to be SEOV positive.Phyloge?netic analysis revealed that the SEOV in Huanggang belongs to the phylogroup A.The nucleotide sequence identities between SEOV in Huanggang and stain Z37 were 95.80%to 96.30%，and amino acid sequence identities were 97.90%to 100%.Rattus flavipectus and Apodemus agrarius were both identified to be SEOV negative and HTNV negative.CONCLUSION：The dominant rodent spe?cies was Rattus norvegicus in Huanggang，Hubei province.The predominant hantaviruses carried by these rodents were SEOV，which belonged to phylogroup A，and were closely related with strain Z37.This research is helpful for the prevention of HFRS in Huanggang area，Hubei province，China.

hantavirus；rodent；gene；phylogenetic analysis

R373.9

A

2095?6894（2017）04?48?04

2017－01－12；接受日期：2017－01－28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81371865，81402728）

劉冰玉.碩士.研究方向：漢坦病毒分子流行病學(xué).

E?mail：563318929＠qq.com

楊占秋.教授.研究方向：漢坦病毒進(jìn)化與變異.

E?mail：zqyang＠whu.edu.cn