細葉石斛離體快速繁殖研究

劉清,包英華*,毛怡霏,黎幸欣,白音

細葉石斛離體快速繁殖研究

劉清,包英華*,毛怡霏,黎幸欣,白音

（韶關學院英東生命科學學院,廣東韶關512005）

為了解決細葉石斛自然繁殖率低、市場種源短缺的問題，采用細葉石斛種子為材料，通過無菌萌發(fā)、原球莖增殖、原球莖分化和生根壯苗等離體快速繁殖過程獲得組培苗.實驗結果表明：1/2 MS+6%馬鈴薯粉培養(yǎng)基適合于原球莖形成和增殖；1/2 MS+6%馬鈴薯粉+0.8%花寶1號培養(yǎng)基可用于細葉石斛的原球莖分化和生根壯苗.共培養(yǎng)6～8月，細葉石斛組培苗的株高、莖粗、分蘗數、葉片數、根數和根長等指標分別達到4.43 cm、0.16 cm、1.76株、8.20片、5.48條和2.16 cm，而且栽后成活率可達97.94%.

細葉石斛；植物組織培養(yǎng)技術；離體再生；組培苗

細葉石斛(Dendrobium hancockiiRolfe)又名石竹、草石斛、黃草［1］，為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物.莖直立，質地較硬，圓柱形或紡錘形，通常分枝；葉互生，狹長圓形，基部具革質鞘；總狀花序具1~2朵花，花質地厚，具香氣，金黃色，花期5~6月［2］.生于海拔700~1 500 m的山地林中樹干上或山谷巖石上.分布于陜西秦嶺以南、甘肅南部、河南、湖北東南部、湖南東南部、廣西西北部、四川南部至東北部，貴州南部至西南部，云南東南部等地區(qū)［2］.

細葉石斛是藥兼觀賞兩用植物.首先它是黃草石斛(又稱川石斛)細黃草的主要來源植物之一［3-5］，莖入藥性寒、味甘，有滋陽清熱、養(yǎng)胃生津之功效.陳云龍等［6］研究結果表明，細葉石斛莖中總多糖含量較高，其水溶性提取物強烈拮抗苯腎上腺素所致的大鼠胸主動脈血管收縮作用.其次是細葉石斛的觀賞價值極高，其花姿優(yōu)雅，花色鮮艷，氣味芳香，生命力旺盛，被喻為“四大觀賞洋花”之一，可作盆栽觀賞.李崇輝等［7］實驗結果指出，細葉石斛花中的主要揮發(fā)性成分為3-蒈烯，3-蒈烯是花、果香氣的重要成分之一，是重要的香料資源，也有很好的藥用活性［8］.

由于受到環(huán)境因素制約和人為過度采伐，細葉石斛野生資源日趨瀕危，而其需求量卻日益增大.因此，加強細葉石斛自然資源保護及擴大種植面積是目前最重要的研究課題.利用植物離體培養(yǎng)技術，進行細葉石斛離體培養(yǎng)和保存，可以提高其繁殖率，也可以縮短栽培的時間，有利于細葉石斛種質資源的保存.

本文以細葉石斛種子為實驗材料，采用植物組織離體培養(yǎng)技術，在無激素培養(yǎng)基上對其種子進行離體培養(yǎng)，經過原球莖形成、原球莖增殖、原球莖分化及壯苗等過程，獲得細葉石斛組培苗，再將組培苗煉苗后移栽到栽培基質中，觀察記錄其成活率.以期為細葉石斛今后的開發(fā)利用，即其植物組織離體培養(yǎng)技術與規(guī)?；N植栽培相結合擴大生產提供實驗依據.

1試驗材料

細葉石斛果實若干顆，采自于韶關學院石斛種質資源圃.

2主要儀器和試劑

儀器：立式壓力蒸汽滅菌器(1575S-34)，接種器械滅菌器(JB-CJ-1500U)，超凈工作臺(JB110222-05)，電熱干燥箱(21118068)，光照培養(yǎng)架、電子天平，游標卡尺等.

試劑：MS培養(yǎng)基，馬鈴薯粉，花寶1號.

3實驗方法

3.1培養(yǎng)基配制與滅菌法

采用潘瑞熾等法［9］配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基種類見表1.培養(yǎng)基分裝后，121℃高壓滅菌30 min，將其冷卻凝固，放置3 d，若無污染現象，即可使用.將所用工具清洗干凈，晾干，用布條包扎后，在121℃高壓滅菌30 min后，放入烘箱中烘干，備用.

3.2種子表面消毒和接種法

挑選飽滿、未裂開的蒴果，用自來水沖洗15 min，輕輕擦拭表面.在超凈工作臺上，將洗凈的蒴果用75%乙醇浸泡60 s，無菌水沖洗2~3次；再用0.1%升汞浸泡10~12 min，無菌水沖洗5~6次，吸干蒴果表面水分，備用.用解剖刀切開果實，將種子分別接種于培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2上進行培養(yǎng).培養(yǎng)室溫度為26±2℃，光照強度為2 000~2 500 lx，光照時間12 h/d.每隔15 d觀察一次.

3.3原球莖和小苗轉接法

種子培養(yǎng)經30 d后形成原球莖.原球莖形成后將其轉接于培養(yǎng)基2上，進行原球莖增殖培養(yǎng).每隔30 d轉接一次相同新鮮培養(yǎng)基上(共轉接2次).增殖的原球莖再轉接于培養(yǎng)基3上，進行叢生芽形成和壯苗生根培養(yǎng).每隔60 d將小苗轉接一次相同新鮮培養(yǎng)基上(共轉接2次)，每瓶接6~8叢，3~5株為一叢.培養(yǎng)條件和觀察法與3.2相同.

3.4組培苗測量法

待組培苗長到約5 cm時，挑選出50瓶組培苗.將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，每瓶取5叢苗為一組，測量和記錄各組組培苗的株高(cm)、長勢情況、莖粗(cm)、葉片數(片)、葉片顏色、根長(cm)、根數(條)、根顏色和分蘗數(個)等指標.數據采用SPSS21.0軟件進行處理和分析，結果用“均值±標準差”表示.

3.5組培煉苗和移栽法

甁苗在種植石斛溫室大棚內放置10 d進行煉苗.移栽時洗凈組培苗根部，浸泡于低濃度多菌靈液中約30 s，晾干根部表明的水分，然后把組培苗分為10~15株/叢移栽在基質上.移栽叢距和行距約為10 cm×10 cm.移栽7d內空氣濕度要保持在90%左右，利于幼苗成活.7 d后空氣水分含量保持濕度在70~80%，促使苗生根發(fā)芽，用濕溫度計測量濕度和溫度.移栽135 d后，統(tǒng)計組培苗的成活率.

表1培養(yǎng)基種類

4結果與分析

4.1細葉石斛原球莖形成和增殖培養(yǎng)

將細葉石斛種子分別接種于培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2上，一顆果實內的種子約接種于13瓶培養(yǎng)基(見表2、圖1中A、B、C).培養(yǎng)約30 d后開始形成原球莖(見圖1中D)，原球莖呈小圓錐狀.共培養(yǎng)60 d后發(fā)現，培養(yǎng)基1上的部分種子不萌發(fā)，顏色逐變淡黃色(見圖1中E)，故淘汰，淘汰率達30%，已形成的原球莖，顏色淡綠色，體積較??；培養(yǎng)基2上的種子均可形成深綠色且較大的原球莖(見圖1中F).培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2上形成的原球莖，均轉接于新鮮配制的培養(yǎng)基2上，進行原球莖增殖培養(yǎng)(見圖1中G).增殖培養(yǎng)60 d后，原球莖顏色變深綠色，且原球莖頂端有葉原基突起，并逐步分化成綠色叢生芽，有些還生出白色短根(見圖1中H).

表2細葉石斛原球莖形成情況

圖1細葉石斛原球莖形成和增殖分化情況

4.2細葉石斛無根苗生根和壯苗培養(yǎng)

將培養(yǎng)基2上形成的細葉石斛無根苗，約長到1.0 cm時，轉接于培養(yǎng)基3上，進行無根苗的生根和壯苗培養(yǎng)，每瓶接6~8叢(3~5株/叢)(圖2中A、B).每隔60 d轉接于新鮮配制的培養(yǎng)基3上，共轉接2次，培養(yǎng)出組培苗(圖2中C).培養(yǎng)結果表明，培養(yǎng)基3上，無根苗長勢好，健壯，整齊，顏色為深綠色，生根率也高，根顏色為白色逐漸變?yōu)闇\綠色，質地較硬(圖2中D).

圖2細葉石斛無根苗轉接和生根壯苗情況

4.3細葉石斛組培苗培養(yǎng)過程中的污染問題

在細葉石斛種子萌發(fā)形成原球莖、原球莖增殖和分化及生根壯苗過程中，均會出現細菌和霉菌污染問題，且污染率較高.細菌污染在接種后1~2 d即可發(fā)現，霉菌污染則在3~10 d后出現.細菌污染后培養(yǎng)基表面呈現粘液狀物，培養(yǎng)材料的生長發(fā)育被受限制，逐漸黃化或褐化死亡(見圖3中A、B)；真菌污染則培養(yǎng)基表面長出肉眼可看出的不同顏色霉菌，培養(yǎng)材料一旦被真菌污染，真菌菌落會迅速增殖，覆蓋整個培養(yǎng)基或材料表面，導致培養(yǎng)材料死亡(見圖3中C、D).

注：A：原球莖細菌污染；B：組培苗細菌污染；C：原球莖真菌污染；D：組培苗真菌污染.

統(tǒng)計結果表明，細葉石斛種子接種后在培養(yǎng)基1和2上的污染率分別可達11.25%和10.31%；原球莖增殖培養(yǎng)過程中的污染率可達12.37%；生根壯苗過程中的污染率可達6.21%.

4.4細葉石斛組培苗品質分析

共培養(yǎng)6~8月后，可觀察細葉石斛組培苗的定性和定量特征.結果表明，培養(yǎng)基3上，組培苗長勢比較好，較整齊，莖較粗壯，葉片深綠色，根基部淺綠色，上部淺黃色.組培苗株高、莖粗、分蘗數、葉片數、根數和根長等指標分別達到4.43 cm、0.16 cm、1.76株、8.20片、5.48條和2.16 cm(見圖4中A、B).移栽后約60 d，細葉石斛組培苗開始長出新芽和新根，根系逐漸變得粗壯.在栽后135 d的統(tǒng)計結果表明，培養(yǎng)基3上培育出的組培苗成活率可達97.94%(見圖4中C、D).

圖4細葉石斛組培苗測量和栽后成活情況

5結論

通過對細葉石斛種子作材料，進行其離體快速繁殖研究，可以為保護細葉石斛種質資源和擴大種植提供參考依據.本文研究發(fā)現，細葉石斛組培苗的培養(yǎng)可以采用無激素培養(yǎng)基，但需要有機附加物的添加.添加馬鈴薯粉能夠促進細葉石斛種子形成原球莖和原球莖增殖概率，同時添加馬鈴薯粉和花寶1號可以促進細葉石斛原球莖出叢生芽和無根苗的生根效率.

實驗結果表明，1/2 MS+6%馬鈴薯粉培養(yǎng)基上細葉石斛原球莖形成和增殖快，原球莖呈深綠色，這與莫昭展等［10-11］的在1/2 MS添加不同激素的培養(yǎng)基上細葉石斛原球莖增殖較快，但原球莖水漬狀明顯，有玻璃化傾向結果有所差別，說明激素對細葉石斛原球莖形成和增殖雖然促進作用，但原球莖的玻璃化和褐化問題產生也有一定的影響.

在實驗過程中出現的污染問題，主要來源于首先接種室潔凈度不夠，培養(yǎng)基滅菌不徹底或滅菌完后培養(yǎng)瓶蓋變松；其次是接種時實驗操作不規(guī)范和人員走動頻繁造成的.因此，細葉石斛組培苗工廠化生產時，應注意上述污染來源.

本實驗由于時間所限，細葉石斛組培苗培養(yǎng)整個過程中所用的培養(yǎng)基種類比較少，對其他的基本培養(yǎng)基和有機附加物對其影響今后再需要進一步實驗.

參考文獻：

［1］黎明,劉保國,衛(wèi)紅,等.細葉石斛營養(yǎng)器官的解剖學研究[J].河南農業(yè)科學,2005(5):58-61.

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［3］沙文蘭,羅金裕.中藥石斛鑒定研究I.石斛原植物和藥材的調查[J].藥學學報,1980,15(6):351-357.

［4］吉占和.中國石斛屬的初步研究[J].植物分類學報,1980,18(4):472.

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［6］陳云龍,張銘,何國慶,等.細葉石斛有效成分分析及其水溶性提取物的血管舒張活性[J].植物資源與環(huán)境學報,2003,12(1):6-9.

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［8］何麗芝,王婧,趙振東,等.3-蒈烯資源及其生物活性應用研究進展[J].林產化學與工業(yè),2011,31(3):122-126.

［9］潘瑞熾.植物細胞工程[M].廣州：廣東高等教育出版社,2008.

［10］莫昭展,林鳳華,韋江萍.細葉石斛原球莖和叢生芽增殖的研究[J].玉林師范學院學報,2007,28(3):61-64.

［11］莫昭展,施福軍,梁海清,等.細葉石斛原球莖組培褐化抑制與試管苗生根[J].林業(yè)科技開發(fā),2009,23(2):22-24.

The Study of In-vitro Rapid Propagation ofDendrobiumhancockiiRolfe

LIU Qing,BAO Ying-hua*,MAO Yi-fei,LI Xing-xin,BAI Yin
（Yingdong College of Life Sciences,Shaoguan University,Shaoguan 512005,Guangdong,China）

The natural reproduction rate ofDendrobiumhancockiiRolfe was low and the lack of provenance on the market.It used the seeds ofD.hancockiiRolfe as material and methods of aseptic germination,protocorm multiplication and differentiation,rooting and growth-promoting to assist in solving these problems.The results show that the culture medium 1/2 MS+6%potato starch is suitable for formation and multiplication of protocorm.1/2 MS+6%of patatostarch and 8%of No.1 Huabao can be used for the differentiation of protocorm and rooting and growth-promoting.The plant height,stem diameter,tiller number,leaf number,root number,root length of tissue culture seeding ofD.hancockiiRolfe are 4.43 cm,0.16 cm,1.76,8.20,5.48 and 2.16 cm respectively，and the survival rate is 97.94%after transplanting.

DendrobiumhancockiiRolfe;plant tissue culture technology;in vitro regeneration;tissue culture seeding

Q94%

A%%%

1007-5348（2017）03-0077-05

（責任編輯：閆文龍）

2017-03-15

廣東省科技計劃項目(2013B040200015)；2015廣東省“質量工程”項目；2016年廣東省省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目(201610576027).

劉清(1994-)，廣東信宜人，韶關學院英東生命科學學院生物科學專業(yè)2013級學生.*通訊作者.