西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)組織分布的研究

顏紅+歐陽婷+楊瓊梁+向彪+夏新華

[摘要] 研究西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的組織分布。按劑量10mg·kg^-1給予健康sD大鼠單劑量尾靜脈注射西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂質(zhì)體、西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體，分別于給藥5，15，30，45，60，120，240，360 min后采集大鼠全血和心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、腦、胸腺組織，采用HPLC測(cè)定血漿和各組織中西瑞香素的濃度。對(duì)比3組制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)刻單位質(zhì)量肝臟中西瑞香素的含量均以西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體組為高；所有時(shí)間點(diǎn)西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體對(duì)肝臟的靶向指數(shù)DTI值均大于西瑞香素普通脂質(zhì)體，西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體在肝組織的AUC和C分別為西瑞香素溶液的2.23，5.22倍。表明西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體能夠在肝臟部位濃集，具有顯著的肝臟靶向性。

[關(guān)鍵詞]西瑞香素；半乳糖化脂質(zhì)體；肝靶向；組織分布

西瑞香素，化學(xué)名為7-羥基-6-甲氧基-3，7-.雙香豆素酯，為香豆素類化合物，廣泛存在于豆科、瑞香科及蕓香科等種屬植物中。文獻(xiàn)報(bào)道西瑞香素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞AGZY-83-a，人喉癌細(xì)胞Hep2，人肝癌細(xì)胞HepG2均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。此外，西瑞香素還有抗炎鎮(zhèn)痛和抗病毒等生物活性，但該藥物在水中溶解度差，在一定程度上限制了其應(yīng)用。脂質(zhì)體是一種可將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層形成的薄膜中間所得的超微型球體載體，具有保護(hù)藥物、降低藥物毒性、提高制劑穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)在將西瑞香素制備成脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上，研究西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、腦和胸腺等組織的分布特性，為其進(jìn)一步研究開發(fā)與臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料

Agilent 1200型高效液相系統(tǒng)（美國安捷倫公司，包括G1311A型泵、G1314B型紫外檢測(cè)器、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器）；Thenn0 hypersil BDS色譜柱（4.6mmx250mm，5 Ixm）（美國Therm0）；WH-2微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司）；ZEN3600納米粒度及電位分析儀（英國Malvern公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華有限公司）；Sonic Dismembrator Model 500超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（美國Fisher Scientific公司）；FM70A制冰機(jī)（意大利Grant公司）；ZEN3600納米粒度及電位分析儀（英國Malvem公司）；YY/T0657-2008立式高速冷凍離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）；TD6臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；可調(diào)式移液器20—200，200～1 000 IxL（大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；BTl25D分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；氮?dú)獯蹈蓛x（自制）；一次性使用無菌注射器（圣光醫(yī)用制品有限公司）；玻璃勻漿器（海門市華凱實(shí)驗(yàn)玻璃儀器有限公司）；SK2200HP超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

西瑞香素（中國食品藥品檢定研究院，含量99.4%，批號(hào)111758-201101）；補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110739-201115）；0.9%氯化鈉注射液[回音必集團(tuán)（江西）東亞制藥有限公司]；大豆磷脂Lipoid S100（德國Lipoid公司）；膽固醇（SIGMA公司）；磷酸鹽緩沖劑（粉劑，0.01 mol·L^-1，pH 7.4，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；二甲亞砜（DMSO，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；1，2.丙二醇、乙醇為生化級(jí)，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

健康SD大鼠，雄性，體重（300±20）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)4300470000565 1。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Therm0 hypersil BDS C₁₈色譜柱（4.6mmx250mm，5μm）；流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸（41：59）；流速1.0 mL·min_-1；檢測(cè)波長346 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL。

2.2溶液的配制

西瑞香素對(duì)照溶液：精密稱定西瑞香素對(duì)照品2.5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為100 mg·L_-1的西瑞香素儲(chǔ)備液。精密量取上述西瑞香素儲(chǔ)備液適量，分別置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成西瑞香素質(zhì)量濃度分別為0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10，20 mg·L_-1的系列對(duì)照溶液。

補(bǔ)骨脂素內(nèi)標(biāo)溶液：取補(bǔ)骨脂素2.5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為100 mg·L_-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成4.0 mg·L_-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3樣品的制備

西瑞香素溶液（DAP）的配制：精密稱定西瑞香素8.0 mg，依次加入12μL DMSO，2 mL丙二醇，2mL生理鹽水，超聲溶解，即得2.0 g·L_-1的西瑞香素溶液。

西瑞香素普通脂質(zhì)體（DAP-LP）的制備：采用乙醇注入法，精密稱取磷脂、膽固醇、西瑞香素（10：2.5：1），溶于無水乙醇中（水浴加熱），所得的類脂溶液用細(xì)孔徑注射器緩慢勻速地注入到恒溫55℃，pH 7.4的10 mL磷酸鹽緩沖液中，注入過程中用磁力攪拌器攪拌，先通氮?dú)獬ヒ掖迹倮^續(xù)攪拌30min，45℃孵育20min，冰浴超聲4min（工作30 s，間隔30 s），過0.45，0.22μm微孔濾膜，即得。

西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體（Gal-DAP-LP）的制備：除在無水乙醇中加入10%的半乳糖配體外，其他步驟同上。

2.4組織生物樣品的處理

取大鼠各組織臟器，除小腸和胃剪開去除內(nèi)容物后用生理鹽水清洗外，其余器官用生理鹽水洗凈表面浮血，濾紙吸干，置一20℃冷凍保存。測(cè)定前取出組織樣本，解凍后稱質(zhì)量，剪碎，置于玻璃勻漿器中，加2倍量生理鹽水在冰浴中研成勻漿，制成組織勻漿液。分別取各組織勻漿500μL，置于10 mL離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素溶液（4.0 mg·L_-1）50μL，渦旋30秒，加入乙腈1mL，渦旋5min，再加入醋酸乙酯5 mL，渦旋混合5 min，以12000r·min_-1。離心5min，取上清液，N，吹干（40℃水?。?，殘?jiān)由V甲醇100μL，渦旋5 min，以12 000r·min_-1離心5min，吸取上清液置內(nèi)襯管中，即得。

2.5方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1專屬性考察取大鼠各空白組織勻漿，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按2.4項(xiàng)下方法處理，獲得空白組織色譜圖；將一定濃度的西瑞香素對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入大鼠空白組織勻漿中，同法操作，獲得空白組織加西瑞香素與內(nèi)標(biāo)色譜圖；取大鼠給藥后的各組織勻漿，同法操作，獲得給藥后大鼠各組織色譜圖，各組織臟腑中色譜圖見圖1。從色譜圖可以看出，西瑞香素與內(nèi)標(biāo)物（補(bǔ)骨脂素）的色譜峰與相鄰色譜峰分離良好，西瑞香素和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別約為22.1，14.8 min。組織中內(nèi)源性物質(zhì)及代謝物對(duì)測(cè)定不產(chǎn)生干擾。

2.5.2線性關(guān)系的考察取大鼠空白組織勻漿各500加入西瑞香素系列對(duì)照溶液50，配制成相當(dāng)于西瑞香素組織質(zhì)量濃度為0.020，0.050，0.10，0.20，0.50，1.0，2.0 mg·L_-1的樣品溶液，精密加入內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素溶液（4.0 mg·L_-1）50，按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖和峰面積，以西瑞香素在樣品中的質(zhì)量濃度C（mg·L_-1）為橫坐標(biāo)，西瑞香素與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值K為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程見表1。結(jié)果表明，西瑞香素在0.020～2.0mg·L_-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3精密度和提取回收率試驗(yàn)用空白組織配制含西瑞香素低、中、高（0.05，0.5，2.0 mg·L_-1）3

由表2，圖3，4可見，西瑞香素溶液組在不同時(shí)刻單位質(zhì)量肺中西瑞香素的含量明顯高于其他臟器（P<0.01）；而3組制劑在不同時(shí)刻單位質(zhì)量肝臟中西瑞香素的含量均以西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體組為高；且西瑞香素普通脂質(zhì)體組、西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體組單位質(zhì)量肝臟中西瑞香素的含量明顯高于其他臟器，與其他組織比較差異有顯著性（P<0.01）。西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體尾靜脈注射5min后，藥物在肝臟中的含量最大，隨著時(shí)間延長，個(gè)濃度的組織樣品，按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，考察低、中、高濃度的日內(nèi)、日間精密度和提取回收率。結(jié)果顯示，高、中、低3種濃度不同組織勻漿樣品的日內(nèi)RSD≤3.8%，日間RSD≤4.3%（n=5），提取回收率均在85.0%～100%，RSD≤5.7%（n=5），均符合生物樣品測(cè)定要求。

2.6大鼠體內(nèi)的組織分布考察

2.6.1大鼠尾靜脈注射3種制劑的體內(nèi)分布試驗(yàn)及結(jié)果取120只SD雄性大鼠，體重（300±20）g，隨機(jī)分成24組，每組5只，給藥前禁食12 h，自由飲水。分別按劑量10 mg·kg_-1尾靜脈注射DAP，DAP-LP，Gal-DAP-LP。分別于給藥后5，15，30，45，60，120，240，360 min時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，立即解剖采集心、肝、脾、肺、腎等組織。按2.4項(xiàng)下方法處理，制備組織勻漿。按2.1項(xiàng)下測(cè)定分析，計(jì)算每克組織中的藥物量（由于大鼠各組織的質(zhì)量不均等，比較藥物在大鼠體內(nèi)組織分布時(shí)需分析各臟器每克組織的藥物含量）。3種制劑大鼠肝臟的藥物含量經(jīng)時(shí)分布圖見圖2，大鼠靜脈注射西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂質(zhì)體、西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體在不同臟器中的經(jīng)時(shí)分布情況分別見表2，圖3，4。肝臟中的量逐步降低，6 h后西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體組肝臟中藥物量為0.51μg·g_-1，而西瑞香素普通脂質(zhì)體組、西瑞香素溶液組分別為0.45，0.18μg·g_-1。以上結(jié)果表明將藥物制成脂質(zhì)體后改變了藥物在體內(nèi)的組織分布，增加了藥物在肝臟的含量，且經(jīng)半乳糖配體修飾的脂質(zhì)體其肝靶向效果更強(qiáng)。

2.6.2肝靶向性初步評(píng)價(jià)分別采用靶向指數(shù)DTI，相對(duì)攝取率和峰濃度比，將靶向制劑

靶向指數(shù)表示給予靶向制劑后時(shí)刻組織或器官的藥物量表示給予非靶向制劑后時(shí)刻組織或器官的藥物量），靶向指數(shù)DTI可用于比較不同制劑對(duì)某器官趨向性的差異。

相對(duì)攝取率表示給予靶向制劑后求得的I組織或器官藥時(shí)曲線下面積；AUC表示給予非靶向制劑后求得的I組織或器官藥時(shí)曲線下面積），AUC根據(jù)梯形法計(jì)算。

峰濃度比表示給予靶向制劑后I組織或器官的峰濃度C2表示給予非靶向制劑后I組織或器官的峰濃度）。

以上結(jié)果表明，相比于西瑞香素溶液，西瑞香素普通脂質(zhì)體（除60min時(shí)間點(diǎn)）、西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體的肝DTI值均大于1，表明脂質(zhì)體比藥物溶液易于濃集于靶器官——肝臟。所有時(shí)間點(diǎn)西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體對(duì)肝臟的DTI值均大于西瑞香素普通脂質(zhì)體，如5min時(shí)西瑞香素普通脂質(zhì)體、西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體的肝DTI值分別為3.3，5.2，表明西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體對(duì)肝的靶向性更強(qiáng)。

西瑞香素普通脂質(zhì)體在肝組織的AUC和C分別為西瑞香素溶液的1.49，3.34倍，而半乳糖化脂質(zhì)體在肝組織的AUC和C分別為西瑞香素溶液的2.23，5.22倍，說明其對(duì)肝的選擇性更強(qiáng)，表明西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體比西瑞香素普通脂質(zhì)體具有更好的肝靶向性。

3討論

本試驗(yàn)建立了大鼠組織中西瑞香素藥物濃度測(cè)定的HPLC方法，考察了西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂質(zhì)體、西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的組織分布及對(duì)肝臟的靶向性。建立的HPLC可靠、穩(wěn)定，各臟器回收率均在85.0%～100%，符合生物樣品測(cè)定要求。

西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂質(zhì)體、西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體3種制劑經(jīng)大鼠尾靜脈注射后，測(cè)定藥物在大鼠體內(nèi)的組織分布。結(jié)果顯示3組制劑在不同時(shí)刻單位質(zhì)量肝臟中西瑞香素的含量均以西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體組為高；且西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體組單位質(zhì)量肝臟中西瑞香素的含量明顯高于其他臟器，與其他組織比較差異有顯著性（P<0.01）。采用靶向指數(shù)DTI，相對(duì)攝取率峰濃度比為評(píng)價(jià)參數(shù)，相比于西瑞香素溶液，西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體對(duì)肝的DTI值均大于1，西瑞香素普通脂質(zhì)體除60 min時(shí)間點(diǎn)外，其他均大于1，且所有時(shí)間點(diǎn)西瑞香素半乳糖化脂質(zhì)體對(duì)肝臟的DTI值均大于西瑞香素普通脂質(zhì)體。西瑞香素普通脂質(zhì)體在肝組織的AUC和分別為西瑞香素溶液的1.49，3.34倍，而半乳糖化脂質(zhì)體在肝組織的AUC和C分別為西瑞香素溶液的2.23，5.22倍，表明藥物經(jīng)脂質(zhì)包封后對(duì)肝臟具有一定的靶向效應(yīng)，而半乳糖配體的引入可進(jìn)一步提高脂質(zhì)體對(duì)肝臟的靶向性。