姜黃素對菊花DNA甲基化及其生長發(fā)育的影響

劉艷華，李忠愛，李 杰，劉 曉，王子成*

(1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 開封 475004； 2.河南省鄧州市劉集鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,河南 鄧州 474150)

姜黃素對菊花DNA甲基化及其生長發(fā)育的影響

劉艷華1，李忠愛1，李 杰1，劉 曉2，王子成1*

(1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 開封 475004； 2.河南省鄧州市劉集鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,河南 鄧州 474150)

采用0、100、200、400 μmol/L不同濃度的姜黃素對菊花神馬組培苗進行處理,利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)分析DNA甲基化水平，并觀察植株生長狀況。結(jié)果表明：姜黃素處理對菊花花期的影響達到了顯著水平，以200 μmol/L姜黃素處理的菊花最早開花，花期可提前5～8 d。MSAP分析結(jié)果表明，經(jīng)姜黃素處理的菊花組培苗的DNA甲基化比率隨姜黃素濃度的升高而降低，在0、100、200、400 μmol/L姜黃素處理下，甲基化比率分別為58.40%、50.44%、48.24%和46.00%。經(jīng)姜黃素處理的菊花組培苗矮化萎蔫，葉片數(shù)減少，分芽能力減弱。移植至室外后，植株矮化等表型抑制作用穩(wěn)定遺傳。表明姜黃素處理菊花可使其基因組甲基化水平降低，產(chǎn)生表觀遺傳變異，導(dǎo)致提前開花。

菊花; 姜黃素; DNA甲基化; 變異

表觀遺傳學(xué)范疇內(nèi)的可遺傳變異不同于基因表達改變的遺傳變異[1]。表觀遺傳學(xué)是指DNA序列之外的改變而導(dǎo)致的可遺傳變異，并可以在發(fā)育和細胞增殖過程中穩(wěn)定傳遞的遺傳學(xué)分支學(xué)科，主要包括DNA甲基化、組蛋白共價修飾、染色質(zhì)重塑等調(diào)控機制[2-3]。DNA甲基化(DNA methylation)是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在CpG和CpXpG受體位點添加甲基形成5-甲基胞嘧啶(5-Mc)[4]以及少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)[5]。DNA甲基化水平降低或不足會導(dǎo)致植株矮小、葉片大小和形狀異常、繁殖能力下降、開花時間改變等[6-7]。

DNA甲基化水平可以通過調(diào)控甲基化酶表達[8]、組蛋白甲基化[9]及構(gòu)建RNA干擾載體[10]等基因工程手段進行調(diào)控，從而改變植物表觀性狀，但是這需要較大的工作量及時間投入，而且引起的性狀具有隨機性且致死率較大。而利用DNA甲基化抑制劑處理的植株具有相對穩(wěn)定的遺傳特性，在操作過程中不需要專業(yè)人才過多的精力投入，一定程度上節(jié)省了人力和財力，因此，可為植物性狀調(diào)控提供一種基于表觀遺傳學(xué)手段的途徑與方法。

DNA甲基化抑制劑是指一類能使基因組甲基化水平降低的堿基類似物，包括核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-氮雜胞嘧啶核苷和5-氮脫氧胞嘧啶)和非核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[11-12]。它使甲基基團不能轉(zhuǎn)移到腺嘌呤或胞嘧啶，導(dǎo)致 DNA 甲基化反應(yīng)受阻，從而使基因組甲基化水平降低[13]。近年來 DNA 甲基化抑制劑已應(yīng)用于植物組織發(fā)育的研究中，目前，最普遍使用的甲基化抑制劑是5-氮雜胞苷和地西他濱，但其價格昂貴，毒性比較大[14]，在推廣使用上受到了限制。尋找更穩(wěn)定、毒性小、價格低廉的甲基化抑制劑是必要的。姜黃素(curcumin,CUR)是一種重要的中草藥提取成分[15]，與胞嘧啶以及5-氮雜胞苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，因此，人們推測姜黃素可能是一種甲基化抑制劑[16]。姜黃素來源廣泛，可從多種姜科植物中提煉加工，價格低廉，毒副作用小[17]。姜黃素在醫(yī)學(xué)方面運用較多，臨床上具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑制血小板聚集和降血脂等作用[18-19]。姜黃素在抑制癌變過程中發(fā)揮重要作用，它可以抑制宮頸癌、直腸癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌等多個靶點腫瘤細胞的生長[20-23]。有研究發(fā)現(xiàn)，用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷處理菊花可使其花期提前[24]，但姜黃素對菊花是否有同樣的效應(yīng)，尚未見相關(guān)報道。鑒于此，采用姜黃素對菊花材料進行處理，對處理后材料的花期、株高和抗病蟲害能力等主要表型性狀及DNA甲基化與基因表達變化情況進行分析，為姜黃素作為一種潛在的DNA甲基化抑制劑應(yīng)用于植物的花期調(diào)控等生長發(fā)育控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

菊花神馬采自開封市園林菊花研究所。神馬對培養(yǎng)基、溫度、濕度以及大田的生長環(huán)境都有良好的適應(yīng)性。

1.2 試驗方法

1.2.1 姜黃素對菊花形態(tài)及其DNA甲基化的影響試驗 用田間生長健壯的神馬菊花苗的幼嫩莖段作為外植體，2.5～3.0 cm長的莖段經(jīng)70%乙醇和0.1%升汞消毒處理后，轉(zhuǎn)接到MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3代后進行姜黃素處理，即在添加有0、100、200、400 μmol/L姜黃素的增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每種濃度分別處理10個菊花不定芽。培養(yǎng)30 d后分別統(tǒng)計每個不定芽的平均株高、叢生芽數(shù)及葉片數(shù)。

采用甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)對姜黃素處理30 d后的菊花總DNA甲基化多態(tài)性進行檢測分析。采用CTAB法提取并純化DNA[25]，然后使用DNA甲基化敏感型不同的2種酶分別與EcoRⅠ組合對DNA完全雙酶切，連接接頭后，進行預(yù)擴增反應(yīng)[24]和選擇性擴增反應(yīng)[26-28]，最后在全自動生物大分子分析儀上檢測結(jié)果。MSAP分析引物序列見表1。

1.2.2 姜黃素處理下菊花的室外表現(xiàn)觀察 經(jīng)姜黃素處理的菊花不定芽分別進行增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)(MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉)30 d后，將生根狀況良好的植株轉(zhuǎn)接至穴盤(基質(zhì)配方為V珍珠巖∶V草炭=2∶1)培養(yǎng)，觀察其生長狀況。其中所有植株均在相同環(huán)境下生長。

在穴盤上培養(yǎng)20 d 后，將菊花植株移栽到田間生長，栽培基質(zhì)配方為V垃圾土∶V珍珠巖∶V雞糞=3∶2∶1。當(dāng)其由營養(yǎng)生長進入到生殖生長時，測量株高。在移栽至大田后，及時摘除側(cè)枝、腳芽、贅芽，及時抹蕾，保證1株菊花只開1朵花，便于對開花時間的統(tǒng)計。從上盆至第1個花瓣展開時間定為開花時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素對菊花形態(tài)及其DNA甲基化的影響

2.1.1 姜黃素處理對菊花形態(tài)的影響 經(jīng)姜黃素處理的菊花生長30 d后，能明顯觀察到其形態(tài)表型的變化(圖1)。100、200、400 μmol/L姜黃素處理的葉片變黃變小(圖1b、c、d)，數(shù)量明顯少于對照(圖1a)，且植株矮化，叢生芽數(shù)量減少。高濃度處理(400 μmol/L)的植株不能正常生長，轉(zhuǎn)接到?jīng)]有添加姜黃素的增殖培養(yǎng)基上30 d后，100 μmol/L和200 μmol/L處理芽體均能恢復(fù)正常生長，但400 μmol/L處理芽體恢復(fù)效果不佳。可見，姜黃素對于菊花的正常生長有一定的影響，低濃度的姜黃素處理對菊花組培苗沒有造成致命性傷害，但是高濃度(400 μmol/L)可能已經(jīng)超出了菊花芽體正常生長所能承受姜黃素濃度的臨界點。

由圖2可知，不同濃度姜黃素處理的株高都有所下降，100、200、400 μmol/L處理的株高分別比對照降低21.58%、28.42%、35.53%。其中，100 μmol/L和200 μmol/L處理與對照差異顯著(P<0.05)，400 μmol/L處理與對照相比差異極顯著(P<0.01)。叢生芽數(shù)也隨姜黃素濃度升高而減少，100、200、400 μmol/L處理的叢生芽數(shù)分別比對照降低1.14%、2.14%、4.23%，只有400 μmol/L處理與對照差異極顯著(P<0.01)。葉片數(shù)同樣隨姜黃素濃度的變化而改變，其中，200 μmol/L處理與對照差異顯著(P<0.05)，400 μmol/L處理與對照相比差異極顯著(P<0.01)，這2種處理的葉片數(shù)分別比對照減少25.71%和37.12%。

a、b、c、d分別為0、100、200、400 μmol/L姜黃素處理的菊花不定芽

*、**分別表示與對照差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)

2.1.2 姜黃素處理下菊花的MSAP分析結(jié)果 用4種不同濃度的姜黃素分別處理菊花，30 d后分別提取DNA，再用已經(jīng)篩選出的6對MSAP引物進行擴增，并統(tǒng)計分析條帶(圖3)。100、200、400 μmol/L姜黃素處理甲基化比率分別比對照(58.40%)極顯著降低7.96、10.16、12.00個百分點。各姜黃素處理之間差異不顯著(圖4)。以上結(jié)果說明，菊花基因組DNA甲基化比率隨姜黃素濃度的升高而呈下降趨勢，但趨勢不明顯。

H和M分別代表HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切后擴增產(chǎn)生的條帶。A、B、C、D分別代表0、100、200、

圖4 不同濃度姜黃素處理下菊花的甲基化比率

2.2 姜黃素處理下菊花的室外表現(xiàn)

從圖5a可以看出，對照組培苗的根系粗壯發(fā)達，側(cè)根多，而經(jīng)姜黃素處理后的菊花組培苗的根變細變長，側(cè)根數(shù)量減少，其中，400 μmol/L處理的菊花組培苗不能正常生根，故該濃度處理沒有移植室外的材料。煉苗過程中，各處理的抗性差異明顯，對照菊花在煉苗過程中無任何染菌，100 μmol/L處理染菌率為40.00%，200 μmol/L處理染菌率較高，達56.25%。移栽至穴盤生長20 d后，對照和100、200 μmol/L處理的植株均長勢良好(圖5b)。

a從左到右依次為0、100、200、400 μmol/L姜黃素處理后的生根材料；b為生根材料移栽穴盤內(nèi)表型，上部2排為對照材料，中部、下部分別為100、200 μmol/L姜黃素處理材料

將菊花植株移栽到田間生長，進入9月份后其由營養(yǎng)生長進入到生殖生長，對其株高進行測量(圖6)。結(jié)果表明，株高隨姜黃素處理濃度的升高而下降，200 μmol/L處理株高比對照極顯著降低(P<0.01)，100 μmol/L處理株高比對照低，但差異不顯著(P>0.05)。

圖6 經(jīng)姜黃素處理后移植室外的菊花株高

從圖7可以看出，當(dāng)200 μmol/L處理的菊花進入盛花期時，對照菊花為現(xiàn)蕾期，100 μmol/L處理的菊花為初花期。200 μmol/L處理的開花時間早于100 μmol/L處理，100 μmol/L處理早于對照，200 μmol/L處理開花時間最早，較對照提前5～8 d。值得注意的是，在100 μmol/L處理中出現(xiàn)一單株菊花，其營養(yǎng)生長異常緩慢，且在其他菊花都進入成熟期后仍處在幼苗期，至單株死亡時都未現(xiàn)蕾開花。

從左到右依次為0、100、200 μmol/L姜黃素處理的神馬菊花單株

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，姜黃素處理菊花可使其DNA甲基化整體水平降低，結(jié)合在擬南芥[29]上的研究結(jié)果說明，姜黃素可以作為DNA甲基化抑制劑用于植物材料的處理，此外，姜黃素可以用于誘導(dǎo)菊花提前開花。但姜黃素在其他植物上是否有同樣的效果，還需大量的試驗來驗證。本研究是在菊花組培苗階段進行姜黃素處理，而花期改變在生長發(fā)育后期，因此，這種改變可能是由于表觀遺傳改變所引起的。最近的研究結(jié)果[30]表明，用短日照誘導(dǎo)菊花開花的過程中，菊花基因組DNA甲基化水平呈下降的趨勢，這與本研究采用DNA甲基化抑制劑促進菊花提前開花的結(jié)論是相一致的。至于DNA甲基化水平降低引起菊花提前開花的內(nèi)在機制，還需要進行更深入的探索。

菊花DNA甲基化降低程度隨姜黃素處理濃度的升高而增大。用400 μmol/L姜黃素處理菊花組培苗，其DNA甲基化降低程度最高，以致植物不能正常生長。而200 μmol/L處理菊花組培苗的DNA甲基化降低程度次之，植物能夠正常生長，且開花時間較對照提前了5～8 d?？梢?，DNA甲基化引起的表觀遺傳變異雖然與遺傳變異相互影響，但應(yīng)具有獨立完整的維持和調(diào)控機制[31]。目前，表觀遺傳學(xué)研究中一個重要的問題是，表型的變異是DNA序列變化導(dǎo)致的結(jié)果，還是獨立于任何基因序列突變的表觀遺傳變異，兩者之間很難區(qū)別劃分[32]。

本研究中的菊花材料經(jīng)DNA甲基化抑制劑姜黃素處理后，利用全自動大分子分析儀分析其基因組DNA甲基化水平的變化，并結(jié)合材料的表型變化，探討它們之間是否存在一定聯(lián)系，但限于研究手段，還不能確定表型及花期的改變是某種變異的定向結(jié)果還是2種變異的互作。其具體的調(diào)控途徑需要進一步研究。

綜上，姜黃素可以使菊花基因組DNA甲基化水平降低，促使菊花花期提前，產(chǎn)生表觀遺傳變異。由此確定了姜黃素可以作為一種DNA甲基化抑制劑應(yīng)用于植物的花期調(diào)控。這為植物性狀調(diào)控提供了一種基于表觀遺傳學(xué)手段的新途徑與方法。

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Effects of Curcumin on DNA Methylation and Development of Chrysanthemum

LIU Yanhua1,LI Zhongai1,LI Jie1,LIU Xiao2,WANG Zicheng1*

(1.School of Life Science,Henan University,Kaifeng 475004,China； 2.Agricultural Service Center of Liuji Town,Dengzhou 474150,China)

In this study,the chrysanthemum plantlets were treated with 0,100,200,400 μmol/L of curcumin,methylation sensitive amplified polymorphism(MSAP) technology was used to analyse the DNA methylation level,and the plant growth status was observed.The results showed that the effect of curcumin on the flowering time of chrysanthemum reached a significant level,the earliest flowering time with 200 μmol/L was 5—8 days earlier than the control.MSAP results showed that the DNA methylation rate of treated tissue culture seedlings decreased with the increase of curcumin concentration,and the methylation rates were 58.40%,50.44%,48.24% and 46.00% under the curcumin concentration of 0,100,200,400 μmol/L,respectively.Seedlings plants showed dwarf,easily wilt,with less leaves and more weak buds.After transplantation to the outside,dwarfing phenotype was inherited stably.In conclusion,curcumin treatment can reduce genomic methylation level and produce epigenetic variation,leading to early flowering of chrysanthemum.

chrysanthemum; curcumin; DNA methylation; variation

2017-02-16

國家自然科學(xué)基金項目(31171982，31372090)

劉艷華(1990-)，女，河南商丘人，在讀碩士研究生，研究方向：菊花表觀遺傳。 E-mail:1376490880@qq.com

*通訊作者：王子成(1974-)，男，河南開封人，教授，主要從事菊花表觀遺傳研究。E-mail:wzc@henu.edu.cn

S682.1+1

A

1004-3268(2017)05-0100-06