提取動物組織DNA的方法比較

摘 要：傳統(tǒng)方式提取DNA大多運(yùn)用氯仿、苯酚以及異丙醇等其它相關(guān)的試劑，此提取DNA的方式純度相對而言比較低，實(shí)驗(yàn)過程非常的復(fù)雜、耗時(shí)之多，并且還有可能產(chǎn)生毒性的物質(zhì)。所以，運(yùn)用商品化的試劑盒針對DNA進(jìn)行提取，顯得更加的簡潔、便利，其成本開支相對介紹。本文首先介紹了試劑盒提取DNA方法的相關(guān)內(nèi)容，并以兩種動物組織DNA提取方法的比較為具體的案例進(jìn)行分析。

關(guān)鍵詞：DNA提取試劑盒；DNA；改進(jìn)

1 動物基因組DNA提取的方法

1.1 損傷性取樣材料DNA的提取

1.1.1 乙醇保存的動物標(biāo)本基因組DNA提取方式

用乙醇保存動物標(biāo)本是最為常見、效果最好的方式。因?yàn)榇蟛糠值腄NA酶必須具備某個(gè)二價(jià)陽離子當(dāng)作輔助的因子（例如：Ca2+、Mg2+等），在70%的乙醇里面倒入合適數(shù)量的EDTA， EDTA能夠在較短的時(shí)間內(nèi)調(diào)控住DNA酶的活性，從而避免DNA所發(fā)生的的降解。莫邦輝等人在酒精標(biāo)本DNA模板迅速提取里面并未運(yùn)用蛋白酶K，單單是在緩沖液（0.5% SDS， 10mmol/L Tris-HCl，100mmol/LEDTA， pH 8.0）， 37℃溫浴1h之后消化相關(guān)的材料，同樣得到了比較好的擴(kuò)增效果，然而這樣的方式只能夠運(yùn)用片段比較短的PCR擴(kuò)增中去。通常而言，使用酒精標(biāo)本提取DNA的方式均會加入一定量的蛋白酶K，同時(shí)56℃的溫度之下消化8～ 14h，以使得組織里面所含有的蛋白質(zhì)全部消化。

1.1.2 甲醛溶液保存的動物基因組DNA提取方式

在之前所進(jìn)行的探索里面針對福爾馬林標(biāo)本的DNA提取方式做出了非常大的改善，在標(biāo)本的預(yù)先處理過程中，主要有臨界點(diǎn)干燥與梯度酒精浸泡這兩種不同的形式。然而梯度酒精浸泡的方式造成乙醇和標(biāo)本里面的甲醛發(fā)成反應(yīng)形成縮醛與半縮醛等，接著經(jīng)過酒精變換被過濾出去。徐來祥等人為了避免標(biāo)本吸入較多的水分而導(dǎo)致細(xì)胞被損害，運(yùn)用PBS溶液融合乙醇溶液對樣品進(jìn)行浸泡、洗脫，同樣獲得了比較好的成果。在針對DNA進(jìn)行提取的環(huán)節(jié)里面，周美玉與杜世章等人均均采取了抗氧化劑二硫蘇糖醇（DTT），DTT可以非常好的避免甲醛氧化成甲酸，然而甲酸同樣會導(dǎo)致DNA出現(xiàn)降解，所以抗氧化劑的通入對于DNA的提取有著非常重要的意義。

1.2 非損傷性取樣材料DNA的提取

1.2.1 從毛發(fā)里面提取DNA的方式

從毛發(fā)里面獲得DNA，與其有關(guān)的報(bào)道非常之多。余艦等人在蛋白酶K的作用之下，運(yùn)用酚-氯仿反復(fù)抽提的形式便已由毛發(fā)里面獲得極少數(shù)的DNA。徐艷春與伍新堯等人采取Chelex-100處理毛發(fā)提取DNA，然而運(yùn)用這樣的方式對于毛囊細(xì)胞的裂解并不充分，所遺留的消化液對于之后所進(jìn)行的PCR實(shí)驗(yàn)有非常的負(fù)面影響。之后，李軍林等人以普通的酚-氯仿提取方式為基礎(chǔ)進(jìn)行改善，以pH 8.8Tris-HCl、MgCl2溶液與蛋白酶K作為裂解液進(jìn)行消化，得到了品質(zhì)比較高的DNA。

1.2.2 從血液樣本里面提取DNA的方式

從血液里面取得DNA最為重要的便是清除掉里面所含有的蛋白質(zhì)與紅細(xì)胞等其它物質(zhì)。通常所采取的方式為：首先獲得淋巴細(xì)胞，接著運(yùn)用蛋白酶K、SDS進(jìn)行消化，接著采取酚氯仿抽提進(jìn)行提取、使用乙醇進(jìn)行沉淀。然而這樣的方式比較繁瑣，同時(shí)所使用的試劑對于人們的健康有著較大的影響，因此有大量的專業(yè)人士對其作出了改善。趙權(quán)等人運(yùn)用TritonX-100來對白細(xì)胞與紅細(xì)胞進(jìn)行破碎，直接獲得白細(xì)胞核，接著運(yùn)用NaClO4， SDS分解聚核蛋白，然而并未運(yùn)用蛋白酶K，最終運(yùn)用PCl（酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1）進(jìn)行抽提，使用乙醇進(jìn)行最后的沉淀。這樣的方式能夠更加好的去除紅細(xì)胞。

2 試劑盒提取DNA的步驟

開展試驗(yàn)之前所需要注意的幾點(diǎn)內(nèi)容：

1、首次運(yùn)用之前需要根據(jù)試劑瓶外所貼的標(biāo)簽指示首先在漂洗液PW與緩沖液GD里面倒入適量的無水乙醇。

2、所選取的樣品需要防止重復(fù)此能夠的冷凍與溶化，不然會造成所提取出的DNA片段相對較小，提取的數(shù)量減低。

3、如果緩沖液GB或者GA里面有沉淀物，能夠?qū)⑵渲萌?6℃的水浴里面再次溶解，搖勻之后繼續(xù)運(yùn)用。

4、全部的離心過程都需要運(yùn)用臺式的離心機(jī)，在室溫背景下進(jìn)行離心。

具體的操作步驟：

1.處理相關(guān)的材料：

a、如果所提取的材料是血液，能夠直接運(yùn)用200μl冷凍、新鮮或者是融入各式各樣抗凝劑的血液，如果沒有200μl能夠加入適量的緩沖液GA進(jìn)行補(bǔ)充；

b、若所需處理的血樣是鳥類、禽類以及兩棲類等其它更加低級生物的抗凝血液，它們的紅細(xì)胞是有核細(xì)胞，所以處理量在5-20μl的范疇以內(nèi)，能夠加入緩沖液GA達(dá)到200μl之后實(shí)施以下的裂解過程。

c、由貼壁培養(yǎng)所獲得細(xì)胞首先需要處理成細(xì)胞懸液，10，000rpm（-11，200×g）離心1min，去處上清，倒入200μl緩沖液GA，不停的振蕩直到完全的懸浮。

d、動物組織（脾組織的用量需要低于10mg）首先需要打碎成細(xì)胞懸液，接著放入10，000rpm（-11，200×g）離心1min，去處上清，倒入200μl緩沖液GA，不停的振蕩直到完全的懸浮。

2. 倒入20μl的蛋白酶K溶液，搖晃均勻。

a、在提取血液基因組的時(shí)候，僅僅需要加入蛋白酶k搖晃均勻，便能夠進(jìn)入一下道程序。

b、在提取細(xì)胞基因組的時(shí)候，僅僅需要加入蛋白酶k搖晃均勻，便能夠進(jìn)入一下道程序。

c、在提取組織基因組的時(shí)候，加入蛋白酶k搖晃均勻之后，進(jìn)行56℃水浴，直到所有的組織全部溶解，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠，再進(jìn)入下一道程序。

3. 倒入200μl的緩沖液GB，全面顛倒使其均勻，在70℃中擱置10min，溶液變得非常的清亮，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠。

4. 倒入200μl的無水乙醇，全面振蕩混勻15s，這個(gè)時(shí)候或許會形成絮狀的沉淀物，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠。

5. 將以上所獲得的溶液與絮狀的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面，接著再將吸附柱置入收集管里面，12，000rpm（～13，400×g）離心30s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

6. 往吸附柱CB3里面倒入500μl的緩沖液GD （在運(yùn)用之前首先需要檢驗(yàn)是不是已經(jīng)倒入了無水乙醇），12，000rpm（～13，400×g）離心30s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

7. 往吸附柱CB3里面倒入600μl的漂洗液PW （在運(yùn)用之前首先需要檢驗(yàn)是不是已經(jīng)倒入了無水乙醇），12，000rpm（～13，400×g）離心30s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

8.重復(fù)執(zhí)行步驟7。

9. 把吸附柱CB3置入收集管里面，12，000rpm（～13，400×g）離心2min，過濾廢液。把吸附柱CB3放入室溫里面幾分鐘的時(shí)間，以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液。

10. 把吸附柱CB3轉(zhuǎn)移到其它未使用過的離心管里面，接著往吸附膜的中間區(qū)域懸空滴入50-200μl的洗脫緩沖液TE，室溫?cái)[放2-5min，12，000rpm（～13，400×g）離心2min，將所有的溶液采集到離心管里面。

3 案例分析——兩種動物組織DNA提取方法的比較

3.1 材料與方法

3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）試驗(yàn)樣本

此次試驗(yàn)所運(yùn)用的豬肉組織都源自于在售的新鮮動物，在完成樣品收集之后儲藏在-80℃的冰箱里面。

（2）試驗(yàn)試劑以及相關(guān)的設(shè)備

a.血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；

b.漩渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

c.微型離心機(jī)，杭州米歐儀器有限公司；

e.FA2004N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

f.SP-1900UV型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）酚-氯仿抽提

①取50 mg豬肉組織剪碎之后置入1.5 ml的離心管里面，倒入400μl的裂解液、200μ的lSDS以及20μl的蛋白酶K，經(jīng)過56℃的水浴消化之后過夜處理；②往里面加入相同體積的飽和酚，充分搖晃5～6 min，靜靜的擱置5 min，12 000 r/min離心10 min；③細(xì)致的提取上清部門轉(zhuǎn)移到全新的1.5 ml的離心管里面，融入相同體積的體積比是25飽和酚：24氯仿：1異戊醇，充分搖晃至均勻，靜靜的擱置4～5 min，12 000r/min離心10 min；④細(xì)致的提取上清部門轉(zhuǎn)移到全新的1.5 ml的離心管里面，融入相同體積的體積比是24氯仿：1異戊醇，充分搖晃至均勻，靜靜的擱置4～5 min，12 000 r/min離心10 min；⑤細(xì)致的提取上清部門轉(zhuǎn)移到全新的1.5 ml的離心管里面，倒入2倍的無水乙醇，（無水乙醇需要提前擺放于-20℃的環(huán)境中冷凍5～10 min），12 000 r/min離心10 min；⑥排除無水乙醇，倒入1 ml的75%乙醇，反復(fù)吹打，12 000 r/min離心10 min，此步驟需要重復(fù)1次；⑦通風(fēng)、干燥5～10 min，倒入50μl的純水。

（2）試劑盒提取

①取50 mg豬肉組織剪碎之后置入1.5 ml的離心管里面，融入200μl的緩沖液GA，倒入20μl蛋白酶k搖晃均勻之后，進(jìn)行56℃水浴，直到所有的組織全部溶解；②倒入200μl的緩沖液GB，全面顛倒使其均勻，在70℃中擱置10min，溶液變得非常的清亮，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠；③倒入200μl的無水乙醇，全面振蕩混勻15s，這個(gè)時(shí)候或許會形成絮狀的沉淀物，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內(nèi)部的水珠；④將以上所獲得的溶液與絮狀的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面，接著再將吸附柱置入收集管里面，12，000rpm（～13，400×g）離心30s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面；⑤往吸附柱CB3里面倒入500μl的緩沖液GD （在運(yùn)用之前首先需要檢驗(yàn)是不是已經(jīng)倒入了無水乙醇），12，000rpm（～13，400×g）離心30s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面；⑥往吸附柱CB3里面倒入600μl的漂洗液PW （在運(yùn)用之前首先需要檢驗(yàn)是不是已經(jīng)倒入了無水乙醇），12，000rpm（～13，400×g）離心30s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面，重復(fù)再做一次；⑦把吸附柱CB3置入收集管里面，12，000rpm（～13，400×g）離心2min，過濾廢液。把吸附柱CB3放入室溫里面幾分鐘的時(shí)間，以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液；⑧把吸附柱CB3轉(zhuǎn)移到其它未使用過的離心管里面，接著往吸附膜的中間區(qū)域懸空滴入150μl的洗脫緩沖液TE，室溫?cái)[放2-5min，12，000rpm（～13，400×g）離心2min，將所有的溶液采集到離心管里面。能夠直接開展PCR反應(yīng)。

3.1.3 DNA濃度與純度的檢測

運(yùn)用核酸蛋白定量儀檢測DNA樣品的OD260、OD280吸光度具體數(shù)值同時(shí)測定DNA的濃度與純度

3.1.4 PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)

豬cytb基因引物所設(shè)計(jì)的序列為：上游5′CACGACCAATGACATGAAAAATC3′，下游5′GCTGCGAGGGCGGTAAT3′。PCR的反應(yīng)過程如下：PCR反應(yīng)總體系是50μl，PCR反應(yīng)組成成分主要有以下幾種：其間10×Buffer 5μl，10mmol/LdNTP 4μl，12.5μmol/L上下游的引物均為1.5μl，Ex Tag DNA聚合酶2U，倒入超純水直到50μl。PCR所必備的反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1min，一共有35個(gè)重復(fù)過程，最終72℃延伸10 min，溫度降調(diào)4℃儲藏。御用酚-氯仿抽提的方式所獲得的DNA置入4℃的溫度中儲藏3～5 d之后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采取試劑盒所獲得的DNA能夠直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3.2 結(jié)果

3.2.1 DNA純度、濃度的測定結(jié)果

從以上兩種方式所測得的DNA純度層面來看，酚-氯仿抽提是1.58±0.18，試劑盒提取法是1.74±0.15，兩者之間的差距非常明顯（P<0.05），試劑盒所提取出的DNA純度更加接近于1.8。從DNA的濃度層面來看：酚-氯仿抽提法時(shí)120±25μg/ml，試劑盒提取法是112±11μg/ml，兩者之間沒有太大的差距。

3.2.2 DNA瓊脂糖電泳結(jié)果

瓊脂電泳檢測DNA帶型相對比較聚集、整齊（如圖1所示），此便表明以上兩種方式所提取獲得的基因組DNA都是非常全面的、無降解的。

3.2.3 PCR擴(kuò)增后結(jié)果

圖2所代表的是cytb基因經(jīng)過PCR擴(kuò)增之后的效果，此兩種不同的方式所提取得到的基因組DNA均能夠當(dāng)作PCR擴(kuò)增所需的模板，同時(shí)均有著非常好的擴(kuò)增成效。

4 結(jié)論

（1）使用試劑盒進(jìn)行提取非常的迅速、便利，相同樣品的操作與比酚-氯仿抽提相比少用了非常少的時(shí)間。（2）使用試劑盒進(jìn)行提取防止運(yùn)用含有毒性的氯仿與苯酚等其它相關(guān)的試劑，避免了具體操作環(huán)節(jié)里面對于工作人員自身的健康造成傷害。（3）使用試劑盒所提出的DNA產(chǎn)量相對較高，純度較好，能夠直接運(yùn)用于PCR與其它的酶切試驗(yàn)中去。（4）因?yàn)樵噭┖刑崛〉姆绞竭\(yùn)用了離心柱，防止了多次重復(fù)性的換管，節(jié)約了大量的資源，離心的時(shí)間較少，離心只需要在室溫下就能夠完成，避免對離心機(jī)造成損害，同時(shí)采取試劑盒進(jìn)行提取是綠色無污染的。（5）試劑盒提取具備較強(qiáng)的重復(fù)性、平穩(wěn)的結(jié)果以及較高的成功率等優(yōu)點(diǎn)，減少了提取所需要的費(fèi)用，比較適合用于大量DNA的提取。

參考文獻(xiàn)

[1]周麗，李飛，魏剛.動物DNA提取方法概述[J].畜牧與獸醫(yī)，2008（03）

[2]邵碧英，楊婕，張?bào)w銀.動物產(chǎn)品的DNA提取方法[J].畜牧與獸醫(yī)，2005（09）.

作者簡介：

郭瀟，男，侗族，籍貫：湖北恩施，學(xué)歷學(xué)位：本科，職稱，學(xué)生，單位：武漢輕工大學(xué)