缺血性腦血管病細(xì)胞自噬相關(guān)因子與斑塊炎性反應(yīng)的相關(guān)性

朱應(yīng)斌，項(xiàng)廷杰，林 杰

(文成縣人民醫(yī)院 內(nèi)二科，浙江 文成 325300)

健康科學(xué)臨床研究

缺血性腦血管病細(xì)胞自噬相關(guān)因子與斑塊炎性反應(yīng)的相關(guān)性

朱應(yīng)斌，項(xiàng)廷杰，林 杰

(文成縣人民醫(yī)院 內(nèi)二科，浙江 文成 325300)

目的 探討缺血性腦血管患者細(xì)胞自噬相關(guān)因子與炎性因子的相關(guān)性，為完善其病理機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。方法 選取缺血性腦血管病患者85例，按照頸動(dòng)脈斑塊分級(jí)分為三組：Ⅰ級(jí)21例、Ⅱ級(jí)35例、Ⅲ級(jí)29例，并以33例健康志愿者為對(duì)照組。抽取空腹肘靜脈血，采用WB法測定自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ與Beclin-1的蛋白表達(dá)量，采用ELISA法測定炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。結(jié)果 對(duì)照組、Ⅰ級(jí)斑塊、Ⅱ級(jí)斑塊、Ⅲ級(jí)斑塊的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表達(dá)和血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平依次升高(P<0.05)；經(jīng)Pearson分析，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)與IL-1β、IL-6和TNF-α水平之間，Beclin1表達(dá)與IL-1β、IL-6和TNF-α水平之間均呈線性正相關(guān)(P<0.05)；經(jīng)秩相關(guān)分析，頸動(dòng)脈斑塊分級(jí)與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、IL-1β、IL-6、TNF-α之間均呈正相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 缺血性腦血管病患者細(xì)胞自噬能夠通過與炎性反應(yīng)的相互作用影響斑塊穩(wěn)定性，可能為其病理機(jī)制的重要組成部分。

缺血性腦血管；細(xì)胞自噬；斑塊；炎性因子

缺血性腦血管病指腦部血液循環(huán)障礙所致腦組織缺血、缺氧性損傷，嚴(yán)重者可致神經(jīng)功能缺損或腦梗死。解剖學(xué)研究表明[1]，大腦中動(dòng)脈是頸內(nèi)動(dòng)脈的延續(xù)，腦組織的血供主要來自于頸內(nèi)動(dòng)脈，正因如此，頸動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性腦血管的重要病理學(xué)基礎(chǔ)之一，約有20%～30%的缺血性腦血管病直接與頸動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。其中頸動(dòng)脈斑塊破裂脫落的栓子是造成該病急性發(fā)作的重要原因，現(xiàn)有研究已證實(shí)[2]，斑塊穩(wěn)定性與炎性反應(yīng)有關(guān)，IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平與斑塊危險(xiǎn)程度分級(jí)具有正相關(guān)性。細(xì)胞自噬在血管病中發(fā)揮的作用近幾年才受到重視，并被證實(shí)與炎性損傷有關(guān)[3]。本研究分析缺血性腦血管病患者細(xì)胞自噬與斑塊炎性反應(yīng)之間的關(guān)系，以期進(jìn)一步完善缺血性腦血管病的病理機(jī)制，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取本院 2014年9月-2016 年9月收治的缺血性腦血管病患者85例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的腦梗死或短暫性腦缺血診斷標(biāo)準(zhǔn)、同時(shí)符合動(dòng)脈粥樣硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≤80歲；③簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①顱內(nèi)出血或感染；②腦外傷；③認(rèn)知功能或意識(shí)障礙；④腫瘤或癌癥；⑤風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病等其他能引發(fā)全身炎性癥狀的疾?。虎藿?個(gè)月免疫類、激素類藥物使用史；⑦近1個(gè)月抗凝治療史。本組男44例、女41例，年齡44～79歲，平均63.5±10.9歲；體質(zhì)量指數(shù)19.4～32.7kg/m2，平均23.1±9.8kg/m2。另以同期入院體檢的33例健康人群為對(duì)照，其中男19例、女14例，年齡44～79歲，體質(zhì)量指數(shù)21.7～30.6kg/m2，平均22.6±8.3kg/m2。兩組患者年齡、性別和體質(zhì)量指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.2 頸動(dòng)脈斑塊分級(jí)方法 取頸總動(dòng)脈分叉處近端后壁1.5 cm處，采用SSI-3000彩色多普勒超聲儀測定頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(intima-media thickness，IMT)，測定位置，以雙側(cè)均值為患者IMT。參照華盛頓大學(xué)頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的超聲分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]，1.3mm<雙側(cè)斑塊<2 mm為Ⅰ級(jí)，1.3mm<單側(cè)斑塊<2 mm為Ⅱ級(jí)，雙側(cè)斑塊≥2 mm為Ⅲ級(jí)。

1.3 細(xì)胞自噬相關(guān)因子測定方法 所有研究對(duì)象，均于治療前取清晨空腹肘靜脈血，進(jìn)行免疫蛋白印跡(western blotting，WB)實(shí)驗(yàn)。主要步驟：(1)蛋白提取和溶液配置：采用全血蛋白質(zhì)抽提試劑盒(HR0089，北京百奧萊博科技有限公司)提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，并配置成10μg/μL的Buffer溶液。(2)電泳與轉(zhuǎn)?。阂?μL/通道的上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel，SDS-PAGE)電泳，40V預(yù)電泳30min后調(diào)至90V電泳90min。經(jīng)電泳，分子量不一致的蛋白分離成單條帶，麗春紅染液漂洗觀察條帶分離狀態(tài)，分離清晰者轉(zhuǎn)印至硝化纖維素(nitrocellulose，NC)膜。(3)抗體孵育：將所得NC膜封至一抗溶液孵育，4 ℃過夜?？贵w均購自Abcam，微管關(guān)聯(lián)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體(ab51520)，可同時(shí)顯示LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ兩條條帶，使用濃度為1∶2000～1∶1500；Beclin1一抗(ab62557)，使用濃度1∶2500～1∶1500；β-Actin一抗(ab8227)使用濃度1∶3000。孵育完畢后PBS清洗，二抗孵育，37 ℃ 90min，所有指標(biāo)共用一個(gè)二抗(ab190466)，使用濃度1∶2000。(4)顯影與測量，暗室操作，獲得的X線膠片入圖像分析軟件掃描，分析灰度值，以所觀察指標(biāo)的灰度值與β-Actin的灰度值之比作為該指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 炎性因子水平測定所有研究對(duì)象，均于治療前取清晨空腹肘靜脈血，常溫靜置40～60min，離心取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀和ELISA試劑盒檢測血清炎性因子白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)的血清水平。ELISA試劑盒均購自上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，檢測原理均為雙抗夾心法。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞自噬相關(guān)因子水平 各組患者的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，對(duì)照組、Ⅰ級(jí)斑塊、Ⅱ級(jí)斑塊、Ⅲ級(jí)斑塊的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)量依次升高，且組與組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表1、圖1。

表1 各組患者外周血細(xì)胞自噬相關(guān)因子 水平比較

注：與上一組比較，*P<0.05；下同。

1：對(duì)照組；2：Ⅰ級(jí)級(jí)斑塊；3：Ⅱ級(jí)級(jí)斑塊；4：Ⅲ級(jí)斑塊 圖1 各組患者WB實(shí)驗(yàn)圖片

2.2 炎性因子水平 各組患者的血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，對(duì)照組、Ⅰ級(jí)斑塊、Ⅱ級(jí)斑塊、Ⅲ級(jí)斑塊的IL-1β、IL-6和TNF-α水平依次升高，且組與組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表2。

表2 各組患者外周血清炎性因子水平比較±s)

2.3 相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson分析，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ與IL-1β、IL-6和TNF-α之間，Beclin1與IL-1β、IL-6和TNF-α之間均呈線性正相關(guān)(P<0.05，表3)；經(jīng)秩相關(guān)分析，頸動(dòng)脈斑塊分級(jí)與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(Rs=0.722)、IL-1β(Rs=0.685)、IL-6(Rs=0.574)、TNF-α(Rs=0.774)之間均呈正相關(guān)性(均P<0.05)。

表3 缺血性腦血管病患者自噬相關(guān)因子與 炎性因子的相關(guān)系數(shù)

3 討 論

炎癥是引起內(nèi)皮功能異常的常見機(jī)制，在缺血性腦血管病中，炎癥與斑塊的形成與發(fā)展密切相關(guān)。炎癥因子是由各種免疫細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等部分非免疫細(xì)胞合成、分泌的一類小分子蛋白，生物學(xué)活性廣泛，不僅僅涉及到免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)，還參與造血功能和組織修復(fù)[5]。生理?xiàng)l件下，內(nèi)皮細(xì)胞分泌適量的炎性因子可抵抗病原體入侵和促進(jìn)組織修復(fù)，在動(dòng)脈粥樣硬化中，往往存在過度炎性反應(yīng)，炎性因子大量分泌，引發(fā)瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，沉積于血管內(nèi)壁，促進(jìn)斑塊的形成與發(fā)展。

細(xì)胞自噬屬于Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，其生理功能在于降解和消化受損細(xì)胞器、多余蛋白質(zhì)或入侵病原體，從而獲得氨基酸、核酸、ATP等營養(yǎng)和能量，以供機(jī)體在嚴(yán)峻的生存條件下得以生存。因此，正常生理情況下，細(xì)胞自噬是一種自我保護(hù)機(jī)制，在動(dòng)脈粥樣硬化也是如此，細(xì)胞自噬通過抵御脂質(zhì)過氧化應(yīng)激和炎性應(yīng)激等不利條件，及時(shí)清除異物，以防斑塊破裂和脫落，有學(xué)者指出[6]，在進(jìn)行性損害的纖維帽中，平滑肌細(xì)胞自噬可能是動(dòng)脈粥樣硬化患者維持斑塊穩(wěn)定性的最重要機(jī)制。然而，隨著病情進(jìn)展，細(xì)胞自噬脫離基礎(chǔ)水平，轉(zhuǎn)化為過度激活，則可能導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的程序性死亡。研究表明[7-8]，細(xì)胞自噬引起的細(xì)胞死亡還能導(dǎo)致諸多促炎因子釋放，促進(jìn)炎性反應(yīng)。當(dāng)前研究已證實(shí)[9]，IL-1β、IL-6、TNT-α不僅是與細(xì)胞自噬密切相關(guān)的炎性因子，還是動(dòng)脈粥樣硬化中衡量斑塊穩(wěn)定性的重要標(biāo)志物。

目前，國內(nèi)對(duì)缺血性血管病細(xì)胞自噬和炎性因子的相關(guān)性研究較少，本研究對(duì)兩者相關(guān)性的考察結(jié)果顯示，對(duì)照組、Ⅰ級(jí)斑塊、Ⅱ級(jí)斑塊、Ⅲ級(jí)斑塊的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表達(dá)依次升高，且組與組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的組間變化趨勢與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表達(dá)一致。進(jìn)一步的Pearson分析發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)與IL-1β、IL-6和TNF-α水平之間，Beclin1表達(dá)與IL-1β、IL-6和TNF-α水平之間均呈線性正相關(guān)。在細(xì)胞自噬方面，本研究選取了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ與Beclin1這兩個(gè)指標(biāo)，其中LC3 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的自噬體標(biāo)記蛋白，存在Ⅰ和Ⅱ兩種可以相互轉(zhuǎn)化的形式，LC3-Ⅰ為可溶性，存在于胞漿，不發(fā)揮自噬活性；當(dāng)自噬被激活后，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化加工修飾轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，結(jié)合于胞內(nèi)自噬體膜，發(fā)揮自噬活性，因此LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均能夠衡量LC3的活性狀態(tài)[10]。WB實(shí)驗(yàn)所取抗體能同時(shí)顯示Ⅰ和Ⅱ兩條條帶，故本研究直接以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ衡量LC3的活躍程度。Beclin1是自噬體形成過程中的必需物質(zhì)，具有高度特異性，其水平升高能夠反應(yīng)自噬體形成數(shù)量的增加[11]。因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1的組間差異說明隨著缺血性腦血管病斑塊的產(chǎn)生和發(fā)展，細(xì)胞自噬活性也依次升高，這與國內(nèi)學(xué)者任博等研究結(jié)果基本一致[12]。在炎性因子方面，本研究選取了IL-1β、IL-6、TNT-α三個(gè)指標(biāo)，三者均為多功能促炎因子，其中IL-1β同時(shí)具有促炎和促凝作用，在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷時(shí)，其過量升高不僅能促進(jìn)炎性損傷，還能夠?qū)е卵ㄐ纬伞L-6和TNF-α對(duì)神經(jīng)組織和造血系統(tǒng)具有廣泛效應(yīng)，除了免疫細(xì)胞以外，室管膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元等均能合成、分泌IL-6和TNF-α，因此兩者在腦血管病種的研究較多?，F(xiàn)有研究也已證實(shí)[13]，兩者與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性具有確切的相關(guān)性，本研究結(jié)果得出了相仿的結(jié)果。除此之外，本研究還證實(shí)，患者細(xì)胞自噬與炎性反應(yīng)之間存在相互作用，可能為其病理機(jī)制的重要組成部分，其具體的作用關(guān)系還有待進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

綜上所述，缺血性腦血管病患者斑塊穩(wěn)定性同時(shí)受到細(xì)胞自噬和炎性反應(yīng)的影響，且細(xì)胞自噬與炎性反應(yīng)之間存在相互作用，可能為其病理機(jī)制的重要組成部分。

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Correlation of autophagy related factors to plaque inflammatory reaction in patients with ischemic cerebrovascular diseases

ZHU Ying-bin，XIANG Ting-jie，LIN Jie

(TheSecondDepartmentofMedicine,thePeople’sHospitalofWenchengCounty,Wencheng325300，China)

Objective To understand the correlation of autophagy related factors and plaque inflammatory reaction in patients with ischemic cerebrovascular diseases so as to obtain scientific knowledge for the development of a more effective method for treating the diseases. Method 85 patients with ischemic cerebrovascular disease were firstly chosen as the subjects of study and divided into 3 groups according to carotid plague degree: Degree 1 (n=21), Degree 2 (n=35), Degree 3 (n=29), and then 33 healthy volunteers were chosen as the control group. The fasting venous blood was extracted to detect LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Beclin 1 expression by WB assay, and to detect serum levels of IL-1β、IL-6 and TNF-α by ELISA assay. Findings There was significant difference in LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand Beclin 1 expression, and serum IL-1β, IL-6, TNF-α levels (P<0.05). The LSD-t test results showed that all the indexes increased in the control group and the experimental groups, namely, Degree 1, Degree 2, and Degree 3. There was significant difference between the groups (P<0.05). The Pearson analysis results showed that both LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ expression and Beclin1 expression had linear positive correlation with serum IL-1β, IL-6, TNF-α levels (P<0.05). Conclusion In ischemic cerebrovascular diseases, autophagy related factors influence plaque stability by interacting with inflammatory reaction factors, which may be an important component of the pathomechanism.

ischemic cerebrovascular disease; autophagy; plaque; inflammatory factor

2016-10-20

文成縣科技局項(xiàng)目(2016041)

朱應(yīng)斌(1959-)，男，浙江文成人，大專，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.02.010

R540.4

A

1674-6449(2017)02-0150-04