兩種處理方法對(duì)脂溶性樣品中正二氫愈瘡酸的研究

張郴+賓婕

摘 要：目的：比較兩種處理方法對(duì)脂溶性樣品中正二氫愈瘡酸的萃取和純化效果的影響。方法：選擇了三種脂溶性樣品采用加標(biāo)回收試驗(yàn)的方式，比較了甲醇和水混合萃取溶劑，甲醇：水=8：2（體積比）方法與正己烷一乙腈分配方法對(duì)正二氫愈瘡酸（NGDA）純化效果的影響，用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析。結(jié)果：用甲醇和水混合萃取法對(duì)正二氫愈瘡酸的萃取效率高，純化效果好。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、快速，適合于正二氫愈瘡酸（NGDA）抗氧化劑的提取，從而能夠快速、準(zhǔn)確地獲得樣品信息。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；脂溶性樣品；抗氧化劑正二氫愈瘡酸；純化效果

中圖分類號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）04-0193-03

1 正二氫愈瘡酸簡(jiǎn)介

正二氫愈瘡酸是一種主要的木脂素，在美國(guó)西南和墨西哥生長(zhǎng)的一種Larrea tridentate Coville灌木中被發(fā)現(xiàn)。然而，在飲用了含有正二氫愈瘡酸的茶葉或是食用了含有5～10%干重的正二氫愈瘡酸膠囊后[1]，出現(xiàn)了非感染性肝炎的病例[2]，同時(shí)研究報(bào)告結(jié)論表明過(guò)量攝入正二氫愈瘡酸會(huì)導(dǎo)致腎損傷。然而，其他一些報(bào)告顯示了一些抗氧化劑潛在的毒性、致癌性和致突變性[3]。

對(duì)于油脂類樣品的溶劑提取方法，李秀勇等[4]往油脂樣品中加入飽和NaCl溶液，用正己烷飽和乙腈提取，萃取后再用氮?dú)獯蹈啥ㄈ?。鄭毅等[5]用正已烷飽和的乙腈直接提取。Mitsuo OISHI等[6]用乙酸乙酯，并且配合減壓濃縮手段來(lái)進(jìn)行樣品前處理。但大多數(shù)報(bào)道的前處理方法比較復(fù)雜。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于正二氫愈瘡酸的檢測(cè)報(bào)道較少，方法主要有HPLC—DAD[7-8]、HPLC-FLD[9]、Lc-Ms[10]和毛細(xì)管電泳法[11]，但大多數(shù)操作繁瑣。

本文考查兩種不同處理方法對(duì)脂溶性樣品中的正二氫愈瘡酸的分離、純化效果，用高效液相色譜法快速測(cè)定，該方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，以為正二氫愈瘡酸的檢測(cè)提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫1200，配置柱溫箱、梯度洗脫功能和熒光檢測(cè)器），色譜柱CAPCELL PAK CR（3.5um，250×4.6 mm），分析天平（德國(guó)賽多利斯）（精確至0.1mg），超聲發(fā)生器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司，KQ-50DA），離心機(jī)（天津市離心儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器（江蘇常州市澳華達(dá)儀器廠）。

2.1.2 試藥

正二氫愈瘡酸（純度大于97%；Newjersey，USA；A0196169），表香、秘魯、吐嚕樣品購(gòu)于市場(chǎng)，乙腈（色譜純， 美國(guó)TEDIA天地試劑公司，1008916），甲醇（色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司，1007901），抗壞血酸（天津市化學(xué)試劑三廠），水（自制超純水），正己烷（分析純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心，20050708）。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取約5mg（精確至0.1mg）正二氫愈瘡酸標(biāo)品，置于100mL容量瓶中用0.1%AsA甲醇定容至刻度，搖勻。（2）樣品的配制。①甲醇和水混合萃取法。分別準(zhǔn)確稱取約2.5g表香、秘魯、吐嚕樣品于100mL具磨口玻璃塞的錐形瓶中，準(zhǔn)確加入30mL甲醇-水組成的混合萃取溶劑，超聲萃取10min；將超聲萃取液移入50mL具塞容量瓶中，分別用5mL上述混合萃取溶劑三次清洗錐形瓶，將清洗溶液注入至容量瓶中，并用混合萃取溶劑定容至刻度后，充分搖勻定容后的萃取溶液；將3mL定容后的萃取液置于10mL帶塞的離心試管中，在5000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心分離10min；取1mL上清液過(guò)0.45μm濾膜后，進(jìn)行液相色譜分析，外標(biāo)法定量。②正己烷一乙腈分配法。稱取約1.2g表香、秘魯、吐嚕樣品于離心管中，加人5mL乙睛飽和的正己烷，在液體混勻器上快速混勻以充分溶解樣，加人10mL正己烷飽和的乙睛，于液體混勻器上快速混勻1min，靜置分層，用膠頭吸管將乙睛層轉(zhuǎn)人濃縮瓶?jī)?nèi)。如上操作再用乙睛提取兩次，合并乙睛于濃縮瓶?jī)?nèi)。乙腈提取液在40℃下，用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器濃縮至約1mL，將濃縮液轉(zhuǎn)至5mL刻度管中，用異丙醇定容至2mL，經(jīng)0.45um濾膜過(guò)濾，供分析。

2.2.2 結(jié)果

（1）HPLC色譜條件。高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫1200，色譜柱：CAPCELL PAK CR（3.5um，250×4.6mm），流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：水；0～5minA相30%，5～20min，A相30～35%。柱溫：40℃；流速：1mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)，λex/λem=280/306nm；對(duì)照品及樣品的色譜圖如圖1所示。

（2）線性關(guān)系考察。分別準(zhǔn)確移取0.1、0.3、0.5、1.0、2.0mL正二氫愈瘡酸對(duì)照品溶液2.2.1（1）至50mL容量瓶中，采用含0.1%AsA的甲醇溶液定容至刻度。高效液相色譜儀分析，測(cè)定其峰面積，以濃度X（ug/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Y=12.86 X+0.0151，r=1

結(jié)果表明正二氫愈瘡酸標(biāo)品濃度在0.1008～2.016 ug/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（3）精密度試驗(yàn)。分別精密吸取2.2.1（1）項(xiàng)下的正二氫愈瘡酸對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，計(jì)算正二氫愈瘡酸的峰面積和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果RSD為0.30%。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取甲醇和水混合萃取法制備的同一表香加標(biāo)樣品溶液10μL，分別于0，2，4，8，12h進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算正二氫愈瘡酸的峰面積和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果RSD為1.06%。

（5）重復(fù)性試驗(yàn)。取同一表香樣品5份，精密稱定，按2.2.1（2）①項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算正二氫愈瘡酸的峰面積和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果RSD為0.32%。

（6）加標(biāo)回收率試驗(yàn)。對(duì)表香樣品進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)后，按照2.2.1（2）①項(xiàng)下方法制備，計(jì)算其加標(biāo)回收率，結(jié)果正二氫愈瘡酸的平均加樣回收率為99.30%（RSD= 1.51%）。

（7）樣品含量測(cè)定。取表香樣品，分別按2.2.1（2）項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣6μL，記錄正二氫愈瘡酸的峰面積，由線性方程計(jì)算各自含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1所示。

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甲醇和水混合萃取法操作簡(jiǎn)便、快速、萃取效率高，純化結(jié)果好，適合于藥用正二氫愈瘡酸（NGDA）抗氧化劑的提取，從而能夠快速、準(zhǔn)確地獲得樣品信息。相對(duì)而言，正己烷一乙腈分配法操作復(fù)雜、繁瑣、萃取效率低，并且峰型不易分開(kāi)，純化效果差。由此得出：用甲醇和水混合萃取法可以得到更好的萃取效果。

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