唐家瀧，賀明，何夢(mèng)如，劉浩，李金琦，曾天信，朱勇飛，柳 強(qiáng)

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，長(zhǎng)沙410013）

氟他胺致小鼠陰莖組織中sHsps表達(dá)改變的研究

唐家瀧，賀明，何夢(mèng)如，劉浩，李金琦，曾天信，朱勇飛，柳 強(qiáng)

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，長(zhǎng)沙410013）

目的：研究氟他胺致小分子熱休克蛋白基因（sHsps）在小鼠陰莖組織中的表達(dá)改變。方法：ICR小鼠受孕后，將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)、對(duì)照兩組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各16只，于孕12d（GD12）-GD19，每天經(jīng)口給予實(shí)驗(yàn)組孕鼠混懸于玉米油中的氟他胺80 mg/kg/day，對(duì)照組孕鼠給予等體積的玉米油。分別于出生后第7、21天（PND7、PND21）在對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取8窩子鼠，并在對(duì)照組隨機(jī)選取雄性小鼠1只，實(shí)驗(yàn)組選取肛門(mén)與生殖器之間的距離（AGD）正常和異常雄性小鼠各1只。取上述雄性子鼠的陰莖，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量檢測(cè)陰莖組織中sHsps的表達(dá)豐度。結(jié)果：無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，sHsps在PND7、PND21的小鼠陰莖組織中都有表達(dá)。除Hspb9在PND7實(shí)驗(yàn)組AGD“正?！毙坌宰邮箨幥o中的表達(dá)和對(duì)照組無(wú)差異外，Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9在實(shí)驗(yàn)組PND7、PND21中的表達(dá)均高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1在PND7、PND21的表達(dá)均低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組Hsp22在PND7的表達(dá)和對(duì)照組無(wú)差異，但在PND21的表達(dá)則高于對(duì)照組。Hspb7在PND7實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)高于對(duì)照組，而在PND21實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)則低于對(duì)照組。結(jié)論：Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1可能和小鼠陰莖異常發(fā)生有關(guān)，Hspb7可能是小鼠陰莖發(fā)育中起重要作用的基因，而Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9和Hsp22在小鼠陰莖發(fā)育時(shí)可能起應(yīng)激保護(hù)作用。

小分子熱休克蛋白；氟他胺；陰莖

雄性后代在子宮內(nèi)暴露于抗雄激素往往導(dǎo)致雄激素依賴性發(fā)育標(biāo)記物（例如肛門(mén)與生殖器之間的距離（anogenitaldistance，AGD）等的改變，并連同明確的器官異常發(fā)生（如生殖器官畸形和生殖道病變）［1］。熱休克蛋白（heat shockprotein，Hsps）被認(rèn)為是細(xì)胞與生物體形態(tài)發(fā)育的伴侶，且與胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育和畸形的發(fā)生都有密切的關(guān)系［2］。小分子Hsps（small heat shock proteins，sHsps）是Hsps中的一個(gè)家族，我們以前的研究發(fā)現(xiàn)其和腭裂、短肢畸形發(fā)生有關(guān)［3，4］。本研究擬檢測(cè)非甾體類(lèi)抗雄激素藥物氟他胺致小鼠陰莖組織中sHsps家族的表達(dá)，以期發(fā)現(xiàn)其在小鼠陰莖發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 高速冷凍離心機(jī)（HERMLE ZK400，德國(guó)EPENDORF公司），BioSpecmini型核酸/蛋白分析儀（日本島津公司），7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)Life Technology公司），萊卡倒置顯微鏡（DMI3000B，德國(guó)萊卡公司）。

氟他胺（美國(guó)Sigma公司），Trizol總RNA提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），SYBR kit（美國(guó)Life Technology公司），sHsps和內(nèi)參照β-actin的熒光定量PCR引物均由賽默飛世爾科技中國(guó)（上海）合成（引物序列見(jiàn)表1），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 sHsps及β-actin的QRT-PCR引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品收集 ICR小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004），8～10周齡，雌鼠體重25～30 g，雄鼠體重30～35 g。飼養(yǎng)間室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，循環(huán)光照為12/12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，雌、雄按2∶1的比例合籠交配，查到陰栓之日為孕期（gestational day，GD）第0 d（GD0），并將孕鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)、對(duì)照兩組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各16只。在GD12-GD19，實(shí)驗(yàn)組孕鼠給予混懸于玉米油中的氟他胺80 mg/kg/day，對(duì)照組孕鼠給予等體積的玉米油。分別于子鼠出生后第7和21 d（postnatal day7、21，PND7、PND21）（出生當(dāng)天記為第0 d，即PND0）在兩組均隨機(jī)取8窩，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組均每窩隨機(jī)取1 只雄性子鼠，將其頸椎脫臼處死、并取其陰莖置于液氮中保存；而實(shí)驗(yàn)組每窩則隨機(jī)選取1只肛門(mén)到生殖結(jié)節(jié)之間的距離（anogenital distance，AGD）明顯比對(duì)照組短［1］（用游標(biāo)卡尺測(cè)量AGD，數(shù)據(jù)見(jiàn)結(jié)果2.1）的雄性子鼠和1 只“正常”的雄性小鼠，將其頸椎脫臼處死、并取其陰莖置于液氮中。

1.3 總RNA提取、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及其數(shù)據(jù)處理

將收集的樣品用Trizol裂解，按試劑盒的說(shuō)明提取總RNA，RNA溶于無(wú)核酸酶水中。取約1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均參照試劑盒的說(shuō)明。

將所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：SYBR buffer 6.5μl，cDNA 1.0μL，上下游引物各0.75μL，Mili Q水16.0μL。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min（40個(gè)循環(huán)）。

通過(guò)各目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增曲線Ct值與所設(shè)內(nèi)參照基因（β-actin）的Ct值相比較（即ΔCt值）來(lái)對(duì)各基因的原始拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量分析：ΔCt=目標(biāo)基因Ct－內(nèi)參照基因Ct，通過(guò)內(nèi)均一化處理之后，目標(biāo)基因相對(duì)于內(nèi)參照基因的量為Y= 2-ΔCt［5］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS17.0，采用χ2檢驗(yàn)、方差分析法統(tǒng)計(jì)分析所有結(jié)果，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組雄性子鼠AGD 用藥期間母鼠無(wú)死亡，母鼠體重?zé)o減輕。PND7對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組雄性仔鼠分別為38只和43只（均為8窩），本研究以AGD的長(zhǎng)度來(lái)判定雄性子鼠的正常和異常情況［1］，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組AGD異常雄性子鼠為24只（55.8%），AGD為4.06±0.09 mm，明顯短于對(duì)照組正常雄性子鼠。PND21對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組雄性子鼠均為41只，實(shí)驗(yàn)組AGD異常雄性子鼠為22只（53.7），AGD為11.83±0.31 mm，明顯短于對(duì)照組正常雄性子鼠。

表2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組AGD正常及異常雄性子鼠數(shù)（只）

2.2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組sHsps表達(dá)豐度的比較

表3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組雄性子鼠陰莖中sHsps表達(dá)豐度（n=8）

由表3可見(jiàn)，無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，sHsps在PND7、PND21的小鼠陰莖組織中都有表達(dá)；PND7的Hspb4在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均為低表達(dá)。除Hspb9在PND7實(shí)驗(yàn)組AGD“正常”雄性子鼠陰莖中的表達(dá)和對(duì)照組無(wú)差異外，Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9在PND7、PND21實(shí)驗(yàn)組所有雄性子鼠陰莖中的表達(dá)均高于對(duì)照組。而Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1在PND7、PND21實(shí)驗(yàn)組所有雄性子鼠陰莖中的表達(dá)均低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組雄性子鼠陰莖中Hsp22在PND7的表達(dá)和對(duì)照組無(wú)差異，但在PND21的表達(dá)則高于對(duì)照組。Hspb7在PND7實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)高于對(duì)照組，而在PND21實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)則低于對(duì)照組。

3 討論

sHsps是Hsps中最大的家族之一，目前已知小鼠的sHsps成員有：Hsp25、Hsp27/p27/HspB1、HspB2/ MKBP（myotonic dystrophy kinase-bind-protein）、HspB3、α，A- crystallin /HspB4、α，B-crystallin /HspB5、Hsp20/ HspB6、cvHsp/HspB7、Hsp22/H11/HspB8、HspB9、HspB10（the sperm outer dense fiber 1 protein，ODFP）和HO-1［3］。研究證明sHsps和胚胎發(fā)育有關(guān)系［6］，我們?cè)谘芯咳词揭朁S酸致小鼠胚胎短肢模型時(shí)發(fā)現(xiàn)sHsps中的Hsp25、HspB2、HspB3、HspB7、Hsp20、HspB9、HspB10可能和小鼠肢發(fā)育有關(guān)［3］，它們的表達(dá)降低可能導(dǎo)致肢的畸形；而Hsp32、Hspb4、Hspb10在腭裂發(fā)生中可能主要起應(yīng)激保護(hù)反應(yīng)，Hspb5、Hspb9可能與腭裂的發(fā)生有關(guān)［4］。

氟他胺在臨床上是一種抗腫瘤藥，常用于治療前列腺癌或良性前列腺肥大；它無(wú)任何激素樣作用，但有較強(qiáng)的抗雄激素作用。研究發(fā)現(xiàn)該藥可以導(dǎo)致鼠類(lèi)隱睪、尿道下裂等雄性生殖系統(tǒng)異常發(fā)生，因此常用于雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)異常的造模［7，8］。本研究發(fā)現(xiàn)，于孕期給予母鼠足夠劑量的氟他胺可致部分雄性小鼠在哺乳期（出生后到PND21）AGD異常，和其他研究者的發(fā)現(xiàn)一致。

我們發(fā)現(xiàn)，所有的sHsps在兩個(gè)時(shí)點(diǎn)的陰莖組織中均有表達(dá)，說(shuō)明sHsps在胚胎發(fā)育中的保守性。實(shí)驗(yàn)組Hsp27、Hspb3、Hspb5、Hsp20、Hspb9在哺乳期小鼠陰莖組織中較對(duì)照組高，提示這些基因在小鼠陰莖發(fā)育中可能起應(yīng)激保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)組Hsp22僅在PND21高于對(duì)照組，而PND7則無(wú)差異，提示其在斷乳前后可能在陰莖發(fā)育中起應(yīng)激保護(hù)作用。在PND7、PND21實(shí)驗(yàn)組Hsp25、Hspb2、Hspb4、Hspb10、HO-1的表達(dá)均低于對(duì)照組，提示這些基因可能和哺乳期小鼠陰莖發(fā)育有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組中的Hspb7在PND7表達(dá)高于對(duì)照組，而在PND21則低于對(duì)照組，提示該基因可能是小鼠陰莖發(fā)育中的重要基因。由于哺乳期子鼠主要吃母乳，極少進(jìn)食外界實(shí)物，因此我們認(rèn)為sHsps的這些變化主要是子鼠在宮內(nèi)接觸到的、和/或母乳中殘留的氟他胺導(dǎo)致的。

上述結(jié)果提示某些sHsps表達(dá)的異常改變與雄性小鼠生殖器異常發(fā)生有關(guān)，為進(jìn)一步研究sHsps在陰莖發(fā)育過(guò)程中的功能提供了一些研究基礎(chǔ)，也進(jìn)一步說(shuō)明sHsps和發(fā)育有關(guān)。

［1］ McIntyre BS, Barlow NJ, Foster PM. Androgen-mediated development in male rat offspring exposed to flutamide in utero: permanence and correlation of early postnatal changes in anogenital distance and nipple retention with malformations in androgen-dependent tissues. Toxicol Sci.2001; 62(2): 236-249.

［2］ Shi W, Xu G, Wang C, Sperber SM, Chen Y, Zhou Q, Deng Y, Zhao H. Heat shock 70-kDa protein 5(Hspa5) is essential for pronephros formation by mediating retinoic acid signaling. J Biol Chem.2015; 290(1): 577-589.

［3］ Yan Z, Wei H, Ren C, Yuan S, Fu H, Lv Y, Zhu Y, Zhang T. Gene expression of Hsps in normal and abnormal embryonic development of mouse hindlimbs. Hum ExpToxicol.2015; 34(6): 563-574

［4］ 朱勇飛, 朱江波, 周宏元, 張?zhí)鞂? sHsps在小鼠正常腭發(fā)育和腭裂發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)［J］. 衛(wèi)生研究, 2005, 34(3): 293-297.

［5］ Stams WA, den Boer ML, Beverloo HB, Meijerink JP, Stigter RL, van Wering ER, Janka-Schaub GE, Slater R, Pieters R. Sensitivity to L-asparaginase is not associated with expression levels of asparagine synthetase in t (12; 21) + pediatric ALL［J］. Blood, 2003, 101(7): 2743-2747.

［6］ Zou P, Wu SY, Koteiche HA, Mishra S, Levic DS, Knapik E, Chen W, Mchaourab HS. A conserved role of αA-crystallin in the development of the zebrafish embryonic lens［J］. Exp Eye Res, 2015, 138: 104-113.

［7］ Foster PM, Harris MW. Changes in androgen-mediated reproductive development in male rat offspring following exposure to a single oral dose of flutamide at different gestational ages［J］. ToxicolSci, 2005, 85(2): 1024-1032.

［8］ 趙丹, 何大維, 張永波, 等. 胚胎期氟他胺暴露對(duì)SD大鼠支持細(xì)胞增殖和成熟的影響［J］.2012, 32(8): 505-508.

Change of expressionof sHspsin mouse penis induced by flutamide

Tang Jia-long, He Ming, He Meng-ru, Liu Hao, Li Jin-qi, ZengTian-xin, Zhu Yong-fei，Liu Qiang
(Department of preventive medicine, School of medicine, Hunan normal university, Changsha 410013, China)

Objective To study the expression of sHsps in mouse penis with hypospadias induced by flutamide. Methods ICR pregnant mice were divided randomly into the treatment and the control groups, which were 16 for each. Flutamide suspension in maize oil was administered per os to the treatment group on 12d (gestational day 12, GD12) -GD19 at a daily dose of 80mg/kg/day, whereas the same dose of maize oil was fed to the control group. The male offspring of 8 dams were selected on postnatal 7 and 21 days (PND7, PND21) in both groups respectively. And one of them of the different mothers in the control group was picked out randomly, while twowere selected from the treatment group randomly, for one wasnormal anogenital distance (AGD) and another abnormal AGD. And furthermore, the relative expression abundance of the sHsps of all the samples was measured by real-time quantity reverse transcript polymerase chain reaction (qPCR). Results In both groups, sHsps were found expressed in the mice penises on PND7 and PND21. Except there was no difference of the expression of Hspb9 between the AGD “normal” male offspring in the treatment group and that of the control group on PND7, expression of Hsp27, Hspb3, Hspb5, Hsp20andHspb9 in the treatment group on PND7 and PND21 was higher than that of the control group. The expression of Hsp25, Hspb2, Hspb4, Hspb10 and HO-1 on PND7 and PND21 in the treatment group was lower than that in the control group. The expression of Hsp22 in both groupshad no difference on PND7, but it was higher in the treatment group than the control group on PND21. The expression of Hspb7 in the treatment group on PND7 was higher than that in the control group, while lower on PND21. Conclusion During mouse penisdeveloping, Hsp25, Hspb2, Hspb4, Hspb10 and HO-1 may be related to the abnormal development, and Hspb7was possibly a gene with important role, whileHsp27, Hspb3, Hspb5, Hsp20, Hspb9 and Hsp22 maybe played a protective effect.

small heat shock proteins (sHsps); flutamide; penis

R114

A

1673-016X（2017）02-0026-04

2016-12-30

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目課題（2015SK2036）；湖南師范大學(xué)本科生創(chuàng)新項(xiàng)目（2016123）

柳強(qiáng)，E-mail:653488726@qq.com