反向高效液相色譜法分離檢測乳粉中的酪蛋白

劉夢云，申雨珂，靳羽曉，袁海娜，2，鮑文娜，2，尤玉如，劉士旺

（1.浙江科技學(xué)院生化學(xué)院/輕工學(xué)院，杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州310023）

反向高效液相色譜法分離檢測乳粉中的酪蛋白

劉夢云1，2，3，申雨珂1，靳羽曉1，袁海娜1，2，鮑文娜1，2，尤玉如1，劉士旺1，2，3

（1.浙江科技學(xué)院生化學(xué)院/輕工學(xué)院，杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州310023）

以C8色譜柱為分離柱，利用反相高效液相色譜法，在流速1.0 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫25℃，0.1%TFA水溶液為A流動相；100%乙腈溶液為B流動相的梯度洗脫條件下對乳粉中酪蛋白的4種組分（αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白）分離檢測。結(jié)果表明，該法具有良好的線性關(guān)系，重復(fù)性好，加標回收率高，對全脂牛乳粉、羊乳粉等乳粉中酪蛋白組分的分離測定有很好的效果。

反相高效液相色譜；酪蛋白；牛乳粉；羊乳粉

0 引言

酪蛋白（Casein，CN）是乳品中重要的蛋白組分，主要包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白[1,2,3]，具有促進磷、鈣等離子的吸收[4]和調(diào)節(jié)人體免疫等功能[5]。酪蛋白分子鏈中包含許多生物活性序列[6]且功能不同[7]，如α-CN是乳源生物活性肽的重要來源，但它會使酪蛋白膠束顆粒增大，易在嬰兒胃中結(jié)塊，不易消化[8]；β-CN適于配制嬰兒配方奶粉，提高配方乳粉的消化性[9]；κ-CN可刺激新生兒胃腸內(nèi)有益菌落的生長。檢測技術(shù)的發(fā)展，使得乳蛋白的檢測變得快速、準確[10-11]，由于液相色譜法具有較好的重現(xiàn)性，因此應(yīng)用較廣[12]。本研究通過改進實驗條件對全脂牛奶粉和羊奶粉中的酪蛋白進行了分析和檢測，并對酪蛋白含量進行了測定與比較，以期為乳制品的安全檢測提供參考。

1 實驗

1.1 材料與試劑

市售全脂牛乳粉，羊乳粉。

α-酪蛋白（α-CN），β-酪蛋白（β-CN），κ-酪蛋白（κ-CN）標準品，三氟乙酸（TFA）和甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

樣品緩沖液：含有濃度為8 mol/L尿素，濃度為165 mmol/L的Tris堿，濃度為44 mmol/L檸檬酸鈉和質(zhì)量分數(shù)0.5%的DTT（pH=8.0）。

1.2 儀器設(shè)備與工作條件

1.2.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（Waters e2695，2489紫外可見光檢測器，Empower色譜工作站）；Sepax Bio-C8（4.6 nm×250 nm，300?，5 μm i.d.）；Satorius普及型PB－10 pH計；電子天平SCA－210。

1.2.2 工作條件

參考Ivan Bonizzi[13]的方法并稍作改動，以C8色譜柱作為分離柱，并將柱子的再平衡時間延長至15 min，流速由0.8 mL/min提高到1 mL/min，而流動相B則由質(zhì)量分數(shù)為100%甲醇溶液替代原方法中的含有0.1%的乙腈溶液。

流動相A：質(zhì)量分數(shù)0.1%的TFA水溶液；流動相B：質(zhì)量分數(shù)100%甲醇溶液；梯度條件：0～40 min流動相B從30%線性漸變到50%，40～42 min流動相B從50%上升到100%，42～43 min流動相B維持100%，43～46 min流動相B則線性下降至30%，46～61 min為柱子的再平衡時間此時流動相B為30%。

流速1 mL/min；檢測波長220 nm；柱溫25℃；進樣體積10 μL。

2 方法

2.1 酪蛋白的提取

取20 g奶粉，用40℃去離子水攪拌均勻，使奶粉充分溶解。轉(zhuǎn)速為8 000 r/min（4℃）離心10 min，棄去上層脂肪，保留上清液。上清液用濃度為1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至4.6，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min（4℃）離心10 min，棄上層液。沉淀分別用去離子水、體積分數(shù)為95%酒精、乙醇－乙醚（體積比1∶1）、乙醚各洗滌兩遍，真空抽濾，于55℃干燥箱烘干至恒重，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標準溶液的配制

分別稱取5 mgα-CN，β-CN，κ-CN蛋白標準品于同一離心管中，加入5 mL樣品緩沖液，振蕩混勻后，即得標準儲備液，放入4℃冰箱備用。上機前用0.45 μm濾膜過濾后直接進樣。

2.3 酪蛋白樣品的制備

準確稱量1.0 mg樣品于1.5 mL離心管中，加入1 mL樣品緩沖液，混勻后室溫下靜置1 h，使樣品充分溶解。0.45 μm濾膜過濾后直接進樣分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測波長的選擇

含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的蛋白質(zhì)在280 nm處有較強的紫外吸收，而肽鍵在200～220 nm處的紫外吸收則強于其280 nm處的吸收[14]。214 nm和220 nm被廣泛應(yīng)用于蛋白的檢測中，但因220 nm多用于液相中乳蛋白的檢測，因此本研究選擇220 nm作為檢測波長。

3.2 流速的選擇

流速的大小影響著蛋白質(zhì)的出峰時間以及分離效果，若流速較大會使色譜柱的負荷過大，造成柱子的損傷；若流速過小可能會在流動過程中不能提供足夠的動力，不利于蛋白質(zhì)的分離檢測，因此選擇1.0 mL/min作為實驗流速。

3.3 純品酪蛋白組分的分離

含有α-CN，β-CN，κ-CN的混合標準溶液在色譜柱梯度洗脫程序中運行61 min，4種酪蛋白組分在25 min內(nèi)即可實現(xiàn)有效分離，且各組分酪蛋白的保留時間相比于Bonizzi等人[13]檢測方法（運行時間51 min）顯著減少。圖1為混合標準液的色譜圖，由于κ-CN的遺傳變異體A和B型中糖基化的不同程度，使κ-CN在色譜圖上的峰有3個[15]，并且因其分子量最小而率先被洗脫。αs1-CN和αs2-CN構(gòu)成了α-CN，因此在色譜圖上能明顯的看到αs1-CN和αs2-CN的兩個洗脫峰，這說明α-CN實現(xiàn)了較好的分離[16]。為了能夠?qū)崿F(xiàn)酪蛋白組分的較好的分離，本實驗將標準溶液放入4℃冰箱保存，這在一定程度上可以減少或避免蛋白質(zhì)的降解，減少實驗誤差[13]。

圖1 混合標準溶液的色譜

3.4 標準曲線的建立

本研究采用外標法，準確移取0.4，0.6，0.8，1.0 mL質(zhì)量濃度為5.0 g/L的標準混合溶液于1.5 mL離心管中，再分別加入0.6，0.4，0.2，0 mL樣品緩沖液，震蕩搖勻后即可得到質(zhì)量濃度分別為0.4，0.6，0.8，1.0 g/L的標準混合溶液。根據(jù)蛋白濃度和相應(yīng)峰面積得到αs1-CN，αs2-CN，β-CN，κ-CN的標準曲線（表1）。結(jié)果表明，酪蛋白的質(zhì)量濃度和對應(yīng)的峰面積之間的線性相關(guān)系數(shù)R2有著遠高于0.99的精度，可以滿足檢測要求。

表1 4種標準蛋白的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

3.5 方法的重復(fù)性實驗

取適量的自提酪蛋白，按照2.3的方法處理樣品。重復(fù)進樣6次，計算各蛋白組分的保留時間和峰面積，并以此為基礎(chǔ)計算出相應(yīng)的相對標準偏差（RSD），結(jié)果顯示（表2），峰面積的RSD在1.06%～4.60%范圍內(nèi)，保留時間的RSD在0.57%～1.93%范圍內(nèi)，該方法具有很好的重復(fù)性。

表2 分析方法的重復(fù)性

3.6 加標回收率分析

準確稱取一定質(zhì)量的自提酪蛋白樣品，分別加入一定質(zhì)量濃度的α-CN，β-CN，κ-CN標準酪蛋白，按2.3方法處理后進行檢測分析，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，4種酪蛋白的加標回收率在95.2%～100.6%范圍之內(nèi)，RSD在0.58%～1.8%范圍之內(nèi)，說明該方法有較高的回收率，并且在實驗條件下的穩(wěn)定性良好。

表3 4種主要酪蛋白的回收率

3.7 樣品的差異性分析

在上述實驗條件下，對自提的不同的酪蛋白組分進行分離檢測，實驗結(jié)果如圖2所示。兩種乳粉中的酪蛋白組分的色譜圖與酪蛋白標準混合液的色譜圖相比，分離行為以及出峰順序較為一致[13]，即都含有4種主要的單體成分。羊乳酪蛋白與牛乳酪蛋白色譜結(jié)果相比，兩種奶中的K-CN的質(zhì)量濃度都比較低，但牛乳酪蛋白中αs1-CN和αs2-CN質(zhì)量濃度比較高，羊乳酪蛋白中β-CN質(zhì)量濃度則明顯的高于牛乳酪蛋白，并且兩種酪蛋白的組分質(zhì)量濃度也不相同[17]。由此可見，αs1-CN和αs2-CN，β-CN，κ-CN是構(gòu)成酪蛋白的主要成分[18]，并且不同的乳源中所含酪蛋白的質(zhì)量和比例也是不相同的，這種不相同在色譜圖上可以清晰地得到，差異性可能是因為物種基因的不同造成的，并且乳蛋白的各種成分含量受季節(jié)、溫度、奶源的種類和健康狀況、擠乳時間及次數(shù)等諸多條件影響，會在一定范圍內(nèi)波動，從而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成的不同。兩種奶粉中酪蛋白的質(zhì)量如表4所示。

圖2 牛乳酪蛋白和羊乳酪蛋白的色譜

4 結(jié)論

反相高效液相色譜法是分離蛋白質(zhì)的有效且快速的方法，其高效穩(wěn)定的分離能力可很好的用于蛋白質(zhì)的定量檢測。本研究以C8為分離柱，流速1.0 mL/min，檢測波長220 nm，質(zhì)量分數(shù)為0.1%TFA水溶液為A流動相、100%乙腈溶液為B流動相的梯度洗脫條件下，對經(jīng)過樣品緩沖液處理的乳粉中酪蛋白的組分進行分析和檢測，獲得了很好的分離效果和定量結(jié)果。結(jié)果表明，該法具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.99），重復(fù)性好（RSD＜1.93%）加標回收率高（95.2%～100.6%），對全脂牛乳粉、羊乳粉等乳粉中酪蛋白組分的分離測定有很好的效果。兩種乳粉中具有相同的酪蛋白成分，但是各種成分在含量上具有一定的差異。隨著對液相色譜方法研究的不斷深入、前處理方法以及分離體系的不斷完善和其他聯(lián)用檢測手段的快速發(fā)展，液相色譜方法必將能夠發(fā)揮其優(yōu)勢，在食品、蛋白質(zhì)分析檢測領(lǐng)域得到更加廣泛和實際的應(yīng)用。

表4 牛乳和羊乳粉中酪蛋白的含量測定

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Separation and quantification of casein in the milk powder by reversed-phase High Performance Liquid Chromatography

LIU Mengyun1，2，3，SHEN Yuke1，JIN Yuxiao1，YUAN Haina1，2，BAO Wenna1，2，YOU Yuru1，LIU Shiwang1，2，3
（1.School of Biological and Chemical Engineering/School of Light Industry，Zhejiang University of Science and Tech?nology，Hangzhou 310023，China；2.Zhejiang Provincial key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Prod?uct，Hangzhou 310023，China；3.Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Re?sources Biochemical Manufacturing，Hangzhou 310023，China）

The testing condition is the flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength of 220 nm，column temperature 25℃，0.1%TFA aqueous solution as A mobile phase，100%acetonitrile solution as mobile phase B.In this study，four components of casein(αS1-casein，αS2-casein，β-casein，andκ-casein)in milk powder were determined by reversed-phase high performance liquid chromatography with C8 column(4.6 nm×250 nm，300?，5μm i.d.).The results showed that the method had a good linearity，good reproducibility and high re?covery.For whole milk powder and goat milk powder，Separation and determination of casein components have a good effect.

Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography；casein；milk powder；sheep milk powder

TS252.7

：A

：1001-2230（2017）03-0052-03

2016-09-17

浙江省自然科學(xué)基金資助（Y14C200036）。

劉夢云（1990-），女，碩士研究生，研究方向為生物化工。

劉士旺