四川麩醋醋醅中產酸細菌的分離及產酸特性研究

于華，黃丹*，歐俊模，陳卓，唐姣

(1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.瀘州護國陳醋股份有限公司，四川 瀘州 646318)

四川麩醋醋醅中產酸細菌的分離及產酸特性研究

于華1，黃丹1*，歐俊模2，陳卓1，唐姣1

(1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.瀘州護國陳醋股份有限公司，四川 瀘州 646318)

以四川麩醋為研究對象，從醋醅中篩選出一株產酸能力強的優(yōu)勢菌株，并對其產酸特性進行探索。采用平板涂布劃線和平皿生化反應等傳統(tǒng)分離方法對四川麩醋醋醅中的產酸細菌進行分離，通過測定產酸能力進行復篩，運用形態(tài)學特征和遺傳學特征對分離菌株進行鑒定，并通過單因素試驗和正交試驗研究分離菌株最適產酸條件，采用高效液相色譜技術對分離菌株發(fā)酵液中的有機酸成分進行分析。結果表明：篩選出的產酸能力較強的菌株為產酸芽孢桿菌(Bacillusacidiproducens)，其最適產酸條件是在培養(yǎng)時間為24 h，培養(yǎng)溫度為45 ℃，培養(yǎng)基初始pH為4.5時，產酸能力達到0.6105 g/dL。在發(fā)酵液中檢測出3種有機酸成分，分別為酒石酸、甲酸和檸檬酸，其含量分別為0.270，1.658，2.284 mg/mL。

麩醋；產酸細菌；分子生物學鑒定；產酸特性

食醋是我國飲食生活中必不可少的一種酸性調味品，在我國有著非常悠久的歷史，其釀造工藝是我國古代勞動人民智慧的結晶，它的發(fā)明、發(fā)展和傳播是對人類飲食文化的一大貢獻。傳統(tǒng)釀造食醋的味感主要由有機酸、糖分及氨基酸等組分所決定。而其中有機酸是主要的風味物質，其形成主要有兩種途徑：一是在酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵過程中由多種微生物的代謝而產生，并中發(fā)酵過程中相互轉化；二是在食醋煎煮及陳放過程的化學反應而產生。另外還有一些是由其原料帶入，并在發(fā)酵過程中慢慢消耗，或成為其他代謝物合成的前體物質。隨著食醋發(fā)酵的進行，最后形成了食醋典型的酸味[1]。食醋中的有機酸可分為揮發(fā)性酸和不揮發(fā)性酸，揮發(fā)性酸以乙酸為主，不揮發(fā)性酸以乳酸為主。乙酸有延緩衰老、消除疲勞和降低血壓等功能。乳酸是一種化學抑制物質，能夠抑制致病菌的生長，增強人體抵抗力[2]。還含有許多其他的有機酸組分，包括琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、富馬酸等，其種類和含量與食醋的酸味質量及產品特色密切相關[3]。

食醋中的有機酸主要是由發(fā)酵過程中存在的酵母菌、醋酸菌、芽孢桿菌、乳酸菌等多種微生物通過三羧酸或丙酮酸循環(huán)代謝而形成。乳酸等有機酸的存在能夠緩解發(fā)酵食醋中乙酸帶來的強烈刺激性，從而賦予食醋酸味柔和、回味綿長的口感特點。目前，對食醋中微生物的研究有了一定的進展，2013年，韓志雙等[4]在傳統(tǒng)麩醋醋醅中分離了一株產香酵母并對其生長特性進行了研究，結果表明在適宜條件下，其產酒精能力達到0.8825 mL/dL，產酯量達到3.66 g/L。2014年，郇阿梅等[5]對一株分離至傳統(tǒng)麩醋醋醅的芽孢桿菌以總黃酮和總酚為指標進行了發(fā)酵特性研究，結果表明在最適發(fā)酵條件下總酚含量可達229.8 μg/mL，總黃酮含量可達241.9 μg/mL。但是對四川麩醋中產酸細菌的研究報道還較少。研究醋醅中產酸細菌的生長與發(fā)酵特性不僅可以為大規(guī)模工業(yè)化生產提高食醋的出醋率提供理論數(shù)據(jù)支撐，還有利于分析食醋風味形成的機理。

本研究采用稀釋平板法從四川麩醋醋醅中篩選出產酸能力強的優(yōu)勢產酸菌，并進行分子生物學鑒定，研究分離菌株在不同溫度、發(fā)酵初始pH值、培養(yǎng)時間等條件下對菌體增殖及產酸能力的影響，分析其有機酸組成，以期為后續(xù)探討四川麩醋有機酸的形成機制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

原材料：四川某醋廠醋醅。

試劑：氫氧化鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二銨、磷酸、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、檸檬酸、酒石酸、乳酸等，以上藥品均為分析純；草酸、甲酸、乙酸，以上藥品均為色譜純。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 富集培養(yǎng)基

可溶性淀粉3 g，蛋白胨10 g，酵母膏3 g，磷酸二氫鉀1.5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.1 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2 分離培養(yǎng)基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，碳酸鈣20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS)

蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設備

LRH-250恒溫培養(yǎng)箱、潔凈工作臺、立式自動壓力蒸汽滅菌鍋、BH200生物顯微鏡、CP214電子天平、0.45 μm水系微孔濾膜、數(shù)控超聲波清洗器、電熱恒溫鼓風干燥箱，紫外分光光度計、pH計、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀、高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 產酸細菌的分離純化

取5 g四川麩醋醋醅于100 mL無菌蒸餾水中，充分震蕩5～10 min，取上清液2 mL接種于100 mL富集培養(yǎng)基中，在轉速120 r/min，37 ℃下震蕩培養(yǎng)48 h。取1 mL增殖培養(yǎng)液，以10倍濃度梯度稀釋后，取適當濃度的菌懸液于分離培養(yǎng)基上進行平板涂布，37 ℃培養(yǎng)48 h，然后觀察并記錄各平板中菌落形態(tài)以及培養(yǎng)基上透明圈的大小等形態(tài)，從不同平板上挑取長勢良好、透明圈較大的典型單菌落進行進一步的純化。

1.2.2 分離菌株復篩

將所分離純化的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，以總酸為指標，測定各菌株的產酸能力，并最終篩選出產酸能力較強的菌株。

1.2.3 菌株分子學鑒定[6]

分離菌株DNA提取采用凍融法，PCR擴增后，將產物送往上海杰李生物技術有限公司進行測序。

1.2.4 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將菌株序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對分析，運用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)菌株間的親緣關系確定所選菌株的種屬。

1.3 分離菌株發(fā)酵特性研究

1.3.1 分離菌株生長曲線測定

將分離菌株活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃下進行培養(yǎng)，以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基做空白對照，每隔2 h采用紫外分光光度計在波長600 nm處測定其菌體濃度即OD值。

1.3.2 產酸曲線的測定

接種2 mL種子液于100 mL無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃下進行培養(yǎng)，每隔4 h取出一瓶發(fā)酵液，采用酸堿中和滴定法測定其總酸含量[7]，繪制產酸速率曲線，以確定后續(xù)試驗測定總酸的培養(yǎng)時間。

1.3.3 溫度對分離菌株生長及產酸能力的影響

接種2 mL種子液于100 mL無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，于20，25，30，35，40，45，50 ℃下培養(yǎng)20 h，以未接種的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，測定其生長量和產酸能力，并繪制相應曲線。

1.3.4 培養(yǎng)基初始pH對分離菌株生長及產酸能力的影響

接種2 mL種子液于初始pH值分別為3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5的100 mL無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h，以未接種的相應pH值無菌發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，測定其生長量和產酸能力，并繪制相應曲線。

1.3.5 分離菌株發(fā)酵產酸正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，為了獲得該菌株最適生長條件和最適產酸條件，選取影響細菌生長以及產酸能力的各因素中有意義的水平做正交試驗，對結果進行分析，以確定最佳條件。采用L9(34)正交表，分別以培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度作為3個參考因素，選取3個水平進行試驗。按表1的正交因素水平設計L9(34)正交試驗。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表

1.4 分離菌株發(fā)酵液中有機酸的測定

1.4.1 樣品預處理

取5 mL發(fā)酵液于100 mL容量瓶中，加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液(10.6%)和2 mL硫酸鋅溶液(30%)，搖勻后，用超純水定容，靜置30 min后，先用雙層濾紙過濾，再用0.45 μL微孔濾膜過濾，所得濾液用于高效液相色譜分析[8,9]。

1.4.2 標準曲線制作

配制一系列的有機酸標準溶液，將各種有機酸標準溶液在相同的液相色譜條件下分別進樣。再將所有有機酸的混和標準溶液稀釋不同倍數(shù)，將不同稀釋倍數(shù)的有機酸混合標準溶液在相同的液相色譜條件下分別進樣。對照單一有機酸標準溶液的液相色譜分析結果和不同稀釋倍數(shù)的混合有機酸標準溶液的液相色譜分析結果，以保留時間和樣品加標的有機酸定性，以峰面積外標法定量，繪制各有機酸濃度半峰面積的標準曲線。

1.4.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18(2，5 μm，4.6 mm×200 mm)；柱溫：30 ℃；流動相：0.01 mol/L NaH2PO4，用磷酸調節(jié)pH至2.7，使用前經0.45 μm微孔濾膜過濾；進樣體積：10 μL；流速：0.5 mL/min；檢測器波長：210 nm。

2 結果與分析

2.1 分離菌株鑒定

2.1.1 分離菌株形態(tài)學鑒定

在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中加入2%的碳酸鈣做產酸指示，通過澆注平板法培養(yǎng)，挑取透明圈較大的細菌進行劃線純化，最終得到5株產酸細菌，其菌落形態(tài)為：凸起，乳白色，濕潤，邊緣不整齊。革蘭氏染色為紫色，其細胞形態(tài)為桿狀。

2.1.2 分離菌株復篩

將各分離菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液測定其總酸，產酸量見圖1。

圖1 5株菌的產酸結果

由圖1可知，產酸量較大的依次序分別是命名為S5，S4，S1的菌株。故選定S5菌株，并做后續(xù)試驗。

2.1.3 分離菌株分子生物學鑒定

望亭水利樞紐是望虞河上的一項關鍵性工程，同時又是環(huán)太湖大堤重要口門控制工程，對太湖流域防洪、排澇、引水和航運發(fā)揮著重要作用。工程為2級建筑物，于1993年12月基本建成。2006年太湖局直管工程遠程監(jiān)控系統(tǒng)建成并運行，2011年對該監(jiān)控系統(tǒng)進行了更新改造，實現(xiàn)對閘門的自動化控制、工程運行管理的視頻監(jiān)視以及異地視頻會商等功能。

菌株DNA及PCR擴增電泳圖見圖2和圖3。

圖2 DNA電泳圖

圖3 PCR擴增產物電泳圖

注：A為陽性對照，B為陰性對照，C為菌株S5的DNA擴增產物。

2.1.4 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹構建

將測出的序列在NCBI上進行BLAST比對，下載與此序列同源性高的序列，經MEGA 6.0軟件采用Neighbor-Joining(NJ)法將測定的序列與在NCBI網(wǎng)站上的GenBank中下載的序列進行分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得目的菌的分類地位和它的系統(tǒng)發(fā)育地位，見圖4。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖4可知，分離菌株S5被鑒定為產酸芽孢桿菌(Bacillusacidiproducens)。

2.2 分離菌株發(fā)酵特性研究

2.2.1 分離菌株生長曲線測定

以吸光度為縱坐標，時間為橫坐標，繪制該菌株的生長曲線，見圖5。

圖5 菌株生長曲線

2.2.2 分離菌株產酸速率曲線測定

以總酸含量為縱坐標，時間為橫坐標，繪制該菌株的產酸曲線，見圖6。

圖6 菌株的產酸速率曲線

由圖6可知，該菌株在培養(yǎng)的24 h中，總酸量一直在上升，但在20 h后上升緩慢，趨于穩(wěn)定。因此，在后續(xù)實驗中都選擇250 mL三角瓶，100 mL培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)20 h后測定總酸以及生長情況。

2.2.3 溫度對分離菌株生長及產酸能力的影響

環(huán)境溫度可影響微生物的生長及生化代謝過程，同時影響基質的利用和代謝產物的釋放。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種2 mL種子液，不同溫度下，培養(yǎng)20 h，以未接種的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，測定其生長量和產酸能力，見圖7。

圖7 不同溫度對菌株生長及產酸的影響

該菌株在溫度為45 ℃時生長情況最好，同時，在溫度為45 ℃時產酸量也達到最大值。

2.2.4 培養(yǎng)基初始pH對分離菌株生長及產酸能力的影響

pH可影響微生物的生長和代謝產物的釋放。在不同初始pH的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種2 mL種子液，37 ℃培養(yǎng)20 h，測定其生長量和產酸能力，見圖8。該菌株在pH為6.5時生長情況最佳，而在pH為5.5時產酸量最大。

圖8 不同初始pH對菌株生長及產酸的影響

2.2.5 分離菌株產酸正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果，選取影響細菌生長以及產酸能力的各因素中有意義的水平做正交試驗，對結果進行分析，以確定最佳條件。設計L9(34)正交試驗，結果見表2。

表2 S5菌株L9(34)正交試驗設計及結果

由表2數(shù)據(jù)先算出總變異的自由度和平方以及分解為各變異原因的自由度和平方和；列出方差分析表，計算各項均方及有關均比方，做出F檢驗，以明了各變異因素的重要程度，見表3。

表3 方差分析表

由表3可知，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)時間3個因素對分離菌株產酸能力的影響中培養(yǎng)溫度的影響較大，培養(yǎng)基初始pH的影響最小，但是這3個因素對分離菌株產酸能力的影響都不顯著。究其原因可能是誤差自由度小(僅為2)，使檢驗的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。由于各因素對產酸能力的影響都不顯著，不必再進行各因素水平間的多重比較。此時，可從表2中選擇平均數(shù)大的水平A3，B2，C1組合成最優(yōu)水平組合A3B2C1，即細菌培養(yǎng)時間為24 h，細菌培養(yǎng)溫度為45 ℃，培養(yǎng)基初始pH為4.5，在此發(fā)酵條件下S5菌株的產酸量可達到610.5 mg/dL。

2.3 分離菌株發(fā)酵液中風味物質的測定

2.3.1 有機酸標準曲線

以保留時間和樣品加標的有機酸定性，以峰面積外標法定量，繪制各有機酸濃度-峰面積標準曲線，見表4。

表4 有機酸標準曲線

2.3.2 分離菌株發(fā)酵液中有機酸分析結果

表5 分離菌株發(fā)酵液中有機酸測定結果

注：“-”表示未檢出。

由表5可知，該菌株的發(fā)酵液中檢測出3種有機酸，分別是酒石酸、甲酸和檸檬酸，其含量分別為0.270 mg/mL發(fā)酵液、1.658 mg/mL發(fā)酵液、2.284 mg/mL發(fā)酵液。由于試驗原因，配制的有機酸標品溶液的種類可能較少，只檢測出3種有機酸，而液相分析結果中其他對應的峰不能確定為何種物質，因此發(fā)酵液中可能還存在其他有機酸成分。同時，檢測出的這3種有機酸也是四川麩醋中主體香味物質，能與食醋中醋酸相互作用，降低食醋的刺激性，對食醋的口感起到重要作用。

3 結論

本研究對四川麩醋醋醅中產酸細菌進行了分離鑒定，并對其發(fā)酵特性進行了研究。采用澆注平板法和平板劃線法對四川麩醋醋醅中的產酸細菌進行分離純化，以總酸為指標，篩選出一株產酸能力較強的菌株，并通過16S rDNA 同源序列分析對該菌株進行遺傳學鑒定，確定該株菌為產酸芽孢桿菌(Bacillusacidiproducens)。以不同的發(fā)酵溫度、初始pH值做單因素試驗研究其生長情況和產酸能力。并在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗法，分別以培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度作為3個參考因素，選取3個水平進行試驗。獲得該株菌最優(yōu)產酸條件分別為培養(yǎng)時間24 h，培養(yǎng)溫度45 ℃，培養(yǎng)基初始pH 5.5。同時研究了該株菌發(fā)酵液中有機酸成分，其成分為酒石酸、甲酸和檸檬酸，含量分別為0.270，1.658，2.284 mg/mL。

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[2]鄧朝霞.永春老醋發(fā)酵過程中有機酸和生物胺變化分析及其細菌菌群結構分析[D].福州:福建師范大學,2014.

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Research on the Characteristics of Acid Production and Separation of Acid-producing Bacteria from Sichuan Bran Vinegar

YU Hua1, HUANG Dan1*, OU Jun-mo2, CHEN Zhuo1, TANG Jiao1

(1.College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000,China;2.Luzhou Huguo Mature Vinegar Co., Ltd., Luzhou 646318, China)

A dominant strain is screened with strong acid-producing ability by using Sichuan bran vinegar as research object, and the characteristics of acid production are explored. The acid-producing bacteria are isolated from Sichuan bran vinegar by using the traditional separation method including plate coating line and plate biochemical reaction,and then through determination of acid production ability for secondary screening, the strains are identified by using the morphological and genetic characteristics, and through the single factor experiments and orthogonal test, the optimum fermentation conditions are studied, the organic acids in the fermented broth of strains are analyzed by using high performance liquid phase chromatography. The results show that the strain which has stronger acid-producing ability isBacillusacidiproducens, the optimum fermentation conditions are the incubation time of 24 h, culture temperature of 45 ℃, initial medium pH of 4.5,the acid-producing ability could reach 0.6105 g/dL. Three kinds of organic acids are detected in the fermented broth, including tartaric acid, formic acid and citric acid, the content is 0.270,1.658,2.284 mg/mL respectively.

bran vinegar; acid-producing bacteria; molecular biological identification; acid-producing characteristics

2016-11-05 *通訊作者

固態(tài)釀造關鍵技術研究四川省院士(專家)工作站資助項目(GY2015-02)；四川省經信委企業(yè)技術創(chuàng)新專項(2015XM080)；四川理工學院研究生創(chuàng)新基金(y2015013)

于華(1991-)，男，四川綿陽人，碩士，主要從事固態(tài)釀造功能微生物方面的研究； 黃丹(1968-)，女，四川自貢人，教授，主要從事微生物及應用方面的研究。

TS264.22

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.008

1000-9973(2017)05-0036-06