脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中核受體協(xié)同抑制因子啟動(dòng)子甲基化對(duì)炎癥因子的調(diào)控作用

郭小莉 劉霞 雷傳江 王關(guān)嵩 王建春

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脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中核受體協(xié)同抑制因子啟動(dòng)子甲基化對(duì)炎癥因子的調(diào)控作用

郭小莉 劉霞 雷傳江 王關(guān)嵩 王建春

目的探討核受體協(xié)同抑制因子(NCOR)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及其調(diào)控機(jī)制。方法1 μg/ml的LPS分別處理小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 24 h和48 h，應(yīng)用Western blot和Real time-PCR檢測(cè)NCOR的表達(dá)水平以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6) mRNA水平，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)核因子-κB (NF-κB)的啟動(dòng)子活性。LPS處理細(xì)胞48 h后，應(yīng)用MSP檢測(cè)NCOR啟動(dòng)子是否發(fā)生甲基化以及Western blot檢測(cè)DNMT3b的表達(dá)變化。Real time-PCR檢測(cè)5′-aza和LPS聯(lián)合處理細(xì)胞后NCOR mRNA的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染DNMT3b siRNA后，分別應(yīng)用Western blot和Real time-PCR檢測(cè)DNMT3b的表達(dá)水平，以及DNMT3b siRNA和LPS聯(lián)合作用下NCOR、TNF-α、IL-6的表達(dá)水平和NF-κB的啟動(dòng)子活性。結(jié)果LPS干預(yù)細(xì)胞24、48 h后，NCOR蛋白和mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，而TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平、DNMT3b 蛋白的表達(dá)水平以及NF-κB的啟動(dòng)子活性顯著上升(P<0.05)。MSP檢測(cè)說(shuō)明LPS可介導(dǎo)NCOR的啟動(dòng)子甲基化。用5′-aza和LPS聯(lián)合處理細(xì)胞后NCOR mRNA水平較LPS組有顯著上升(P<0.05)。采用DNMT3b siRNA可顯著下調(diào)DNMT3b 蛋白和mRNA水平，并可部分逆轉(zhuǎn)LPS介導(dǎo)的抑制NCOR表達(dá)的效應(yīng)，抑制TNF-α、IL-6的表達(dá)水平和NF-κB的啟動(dòng)子活性(P<0.05)。結(jié)論NCOR啟動(dòng)子的甲基化是LPS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵步驟，其可作為治療ALI/ARDS的潛在靶點(diǎn)。

核受體協(xié)同抑制因子； DNA 甲基化； 核轉(zhuǎn)錄因子κB； 炎癥因子

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)嚴(yán)重威脅著人民的生命安全[1-3]。盡管新型藥物及機(jī)械通氣等措施得到廣泛的應(yīng)用，但是ALI/ARDS的病死率仍居高不下[4]。嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)如膿毒血癥是引起ALI/ARDS主要原因之一[5]。而在這個(gè)過(guò)程中，受到內(nèi)毒素刺激的肺泡巨噬細(xì)胞通過(guò)大量釋放炎癥介質(zhì)，在肺組織損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[5-6]。因此，深入探究肺巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的分子機(jī)制，可為ALI/ARDS的防治提供新的防治策略和靶點(diǎn)。

核受體協(xié)同抑制因子(nuclear receptor corepressor, NCOR)是一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子，其通過(guò)調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。Hong等[7]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)NCOR表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。其他研究也表明NCOR在調(diào)控腫瘤的相關(guān)生物學(xué)特性方面發(fā)揮著重要的作用[8-9]。而在炎癥反應(yīng)中，通過(guò)抑制NCOR的表達(dá)，可促進(jìn)炎癥因子釋放的作用，但是否存在其他機(jī)制尚不清楚[10]。

DNA甲基化是一種常見(jiàn)的基因修飾途徑之一。其主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的催化下，完成對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，控制基因表達(dá)，進(jìn)而引起疾病的發(fā)生、發(fā)展[11-14]。既往研究表明在ALI大鼠模型中上調(diào)DNMT3b、DNMT1等，可引起PPAR γ等基因的啟動(dòng)子甲基化，進(jìn)而在ALI的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[15-16]。本研究旨在探討LPS是否可誘導(dǎo)NCOR的甲基化，及其在NCOR甲基化中的機(jī)制，及在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(無(wú)內(nèi)毒素)購(gòu)自GIBCO公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和5-氮胞苷2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5′-aza)和TRIzol reagent購(gòu)自sigma公司；兔源NCOR單克隆抗體、兔源DNMT3b單克隆抗體、兔源GAPDH多克隆抗體以及山羊抗兔HRP-Ig(H+L)二抗購(gòu)自江蘇睿瀛生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo fisher公司；定量PCR mix購(gòu)自羅氏公司；DNA提取試劑盒、DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒和甲基化特異性PCR試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司。pNF-κB-luc報(bào)告基因質(zhì)粒、G418和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。DNMT3b siRNA和陰性對(duì)照(negative control, NC)由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)和合成；轉(zhuǎn)染試劑lipofiter購(gòu)自漢恒(上海)生物科技有限公司。

二、研究方法

1. 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng)：小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7由第三軍醫(yī)大學(xué)生物測(cè)試中心提供。RAW264.7用DMEM+10%FBS的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下來(lái)，離心后重新進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳代后到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2. LPS處理RAW264.7細(xì)胞：使用1 μg/ml的LPS分別處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞0 h、24 h和48 h，然后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[16]。

3. 5′-aza處理RAW264.7細(xì)胞：使用1 μM的5′-aza分別處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞48 h，然后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

4. pNF-κB-luc報(bào)告基因質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：將消化下來(lái)的RAW264.7細(xì)胞傳代到10 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞融合度達(dá)到80%。棄去培養(yǎng)基加入10 ml的DMEM。將24 μg pNF-κB-luc質(zhì)粒加入1 ml DMEM中，充分混勻。再取一個(gè)EP管，加入1 ml的DMEM后，再加入72 μl lipofiter，充分混勻。將上述兩管靜置5 min后，混合在一起，充分混勻后再靜置15 min。將上述混合液均勻滴入細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h后換成還有DMEM+10%FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。之后要用1 mg/ml的G418持續(xù)篩選1個(gè)月，獲得穩(wěn)定表達(dá)NF-κB-luc-RAW264.7細(xì)胞。

5. 甲基化特異性PCR(methylating-specific PCR, MSP)：將處理后的RAW264.7細(xì)胞用PBS洗滌1次后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，離心。用DNA提取試劑盒提取細(xì)胞的DNA，使用DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒將DNA樣品中未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。非甲基化引物(unmethylation primer)：上游:5′-TTGTTTGTGTTATTTATGTTTATGA -3′,下游: 5′-CAATACTTACTACTACCCACATCAAT-3′。甲基化引物(methylation primer): 上游:5′-TTGTTTGTGTTATTTGTGTTTACGA-3′,下游: 5′-ATACTTACTACTACCCGCGTCGAT-3′，見(jiàn)表1。將上述樣本就行MSP，擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再以72 ℃ 5 min進(jìn)行延伸。將上述產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。

6. DNMT3b siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞：將3條DNMT3b siRNA和對(duì)照組 (NC)用RNase-free H2O 配制成20 nM的儲(chǔ)存液后，分裝、凍存?zhèn)溆?。使用終濃度為50 pM DNMT3b siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的簡(jiǎn)要操作如下：①將5×104/孔 RAW264.7接種到24孔板中，培養(yǎng)12 h；②2.5 μl 濃度為20 nM的DNMT3b siRNA加入到50 μl DMEM中，輕輕混勻；③2.4 μl的lipofiter 加入到50 μl DMEM中，輕輕混勻；④上述兩組混懸液靜置5 min后，再將它們混合在一起，充分混勻，靜置15 min；⑤將100 μL混合試劑加入含有細(xì)胞的孔板中，輕輕混勻，DNMT3b siRNA的轉(zhuǎn)染終濃度為50 pM；⑥將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行PCR和Western blot等檢測(cè)。NC的轉(zhuǎn)染同前。

7. 熒光素酶活性的檢測(cè)：將作為內(nèi)參pRL-TK質(zhì)粒和DNMT3b siRNA/NC 共同轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)NF-κB-luc的RAW264.7細(xì)胞24 h后，再用1 μg/ml LPS干預(yù)24 h。將細(xì)胞用PBS洗滌1～2次，然后加入200 μl報(bào)告基因細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞后，按照說(shuō)明書(shū)加入溶解熒光素酶檢測(cè)試劑，孵育后并進(jìn)行檢測(cè)。

8. Real time-PCR檢測(cè)NCOR、DNMT3b、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)：收集細(xì)胞后，用TRIzol提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA. cDNA采用BIO-RAD CFX96系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NCOR、DNMT3b、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。每個(gè)待測(cè)基因設(shè)4個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)通過(guò)BIO-RAD CFX96系統(tǒng)進(jìn)行處理，按照公式RQ=2-ΔΔCT計(jì)算各組間的倍數(shù)關(guān)系。

9. Western blot檢測(cè)NCOR、DNMT3b、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)：收集細(xì)胞，加入300 μl蛋白裂解液，在冰上充分裂解，然后4 ℃、以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心20 min。取上清液，測(cè)定蛋白濃度，并將所有樣本調(diào)整到相同濃度后，加入5×loading buffer，沸水中煮10 min使其變性。制備分離膠為8%的SDS-PAGE凝膠，每孔加樣40 μg進(jìn)行電泳。300 mA濕轉(zhuǎn)150 min后，將PVDF膜室溫封閉1 h，應(yīng)用NCOR(1︰2 000)、DNMT3b(1︰2 000)及GAPDH抗體(1︰10 000)的抗體4 ℃孵育過(guò)夜；再孵育放入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔的二抗(1︰50 000)，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)NOCR和DNMT3b的表達(dá)水平。所得蛋白條帶圖片，使用Quality one軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，以GAPDH的光密度值作為內(nèi)參來(lái)校正各自目的蛋白的光密度值。

表1 基因引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，使用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組之間進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、 LPS處理RAW264.7細(xì)胞后NCOR、IL-6和TNF-α表達(dá)以及NF-κB活性的變化

應(yīng)用1 μg/ml LPS分別干預(yù)RAW264.7細(xì)胞0 h、24 h和48 h后，Western blot和real time-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)如圖1A和1B所示，LPS干預(yù)24 h和48 h后，RAW264.7細(xì)胞中NCOR蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著低于0 h組(P<0.05)，但24 h和48 h組NCOR蛋白和mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示如圖1C所示，LPS干預(yù)RAW264.7細(xì)胞后24 h、48 h，NF-κB 的活性較0 h組顯著升高(P<0.05)，并且48 h組NF-κB 的活性顯著高于24 h(P<0.05)。此外，炎癥因子TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)水平隨著LPS作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高(圖1D)，呈時(shí)間依賴(P<0.05)。

圖1 LPS處理RAW264.7細(xì)胞后NCOR、IL-6和TNF-α表達(dá)以及NF-κB活性的變化，1 μg/ml LPS分別處理RAW264.7細(xì)胞0 h、24 h、48 h；注： A. Western blot檢測(cè)NCOR蛋白的表達(dá)水平；B： Real time-PCR檢測(cè)NCOR mRNA的表達(dá)水平；*與0 h比較，P<0.05；C：熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)NF-κB啟動(dòng)子活性；*與0 h比較，P<0.05，^與24 h比較，P<0.05；D： Real time-PCR檢測(cè)IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)水平；*與0 h比較，P<0.05，^與24 h比較，P<0.05

二、LPS處理RAW264.7細(xì)胞后對(duì)NCOR基因啟動(dòng)子甲基化的作用

應(yīng)用MSP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，見(jiàn)圖2A： 1 μg/ml LPS干預(yù)RAW264.7細(xì)胞48 h后NCOR基因出現(xiàn)甲基化，提示LPS處理可誘導(dǎo)NCOR的啟動(dòng)子甲基化。同時(shí)，利用Real time-PCR檢測(cè)NCOR mRNA的表達(dá)，見(jiàn)圖2B：發(fā)現(xiàn)LPS處理48 h后，NCOR mRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。但在使用DNA甲基化清除劑5′-aza和LPS同時(shí)處理后，NCOR mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，但較LPS組的表達(dá)水平有顯著的提升(P<0.05)。此外，還檢測(cè)了DNMT3b的蛋白水平(圖2C)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平在LPS處理后較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。

三、下調(diào)DNMT3b對(duì)NCOR表達(dá)的影響

RAW264.7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染了3條siRNA和NC 48 h后，用Real time-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3條DNMT3b siRNA均可以下調(diào)DNMT3b mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)，其中DNMT3b siRNA-2的下調(diào)作用最為顯著(圖3A和3B)。因此，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)均使用該條siRNA。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染DNMT3b和NC，NCOR mRNA 和蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著的差異(P>0.05)(圖3C和3D)。但RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNMT3b siRNA 24 h后，再用LPS處理24 h后，NCOR的表達(dá)水平較NC+LPS組顯著降低，但仍然較單獨(dú)siRNA組顯著降低(P<0.05)。

圖2 LPS處理RAW264.7細(xì)胞對(duì)NCOR 啟動(dòng)子甲基化的影響；注：A：MSP檢測(cè)1 μg/ml LPS處理細(xì)胞48 h后，NCOR 啟動(dòng)子甲基化情況。U代表非甲基化NCOR DNA片段；M代表甲基化NCOR DNA片段；B：Real time-PCR檢測(cè)NCOR mRNA的表達(dá)水平。*與control組比較，P<0.05；^與LPS組比較，P<0.05；C： Western blot檢測(cè)1 μg/ml LPS處理細(xì)胞48 h后 DNMT3b蛋白的表達(dá)水平

四、下調(diào)DNMT3b對(duì)NF-κB活性及對(duì)IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)NF-κB啟動(dòng)子活性， Real time-PCR檢測(cè)IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)DNMT3b siRNA組、NC+LPS組和DNMT3b siRNA +LPS組的NF-κB啟動(dòng)子活性及IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)水平均顯著高于單獨(dú)NC組(P<0.05)。DNMT3b siRNA+LPS組的NF-κB啟動(dòng)子活性及IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)水平較NC+LPS組明顯降低(P<0.05)，但仍高于單獨(dú)DNMT3b siRNA組(P<0.05) (圖4A、B)。

圖3 下調(diào)DNMT3b對(duì)NCOR表達(dá)的影響；注：A和B： Real time-PCR和 western blot檢測(cè)DNMT3b siRNA及NC轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后，NCOR mRNA和蛋白的表達(dá)水平，*與NC組比較，P<0.05；C和D： DNMT3b siRNA轉(zhuǎn)染24 h后再用1 μg/ml LPS處理24 h，Real time-PCR和 western blot檢測(cè)NCOR mRNA和蛋白的表達(dá)水平，*與NC組比較，P<0.05；^DNMT3b siRNA組比較，P<0.05；#NC+LPS組比較，P<0.05

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7中NCOR的啟動(dòng)子甲基化，進(jìn)而下調(diào)NCOR的表達(dá)，提升NF-κB的活性，導(dǎo)致炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究表明DNMT3b參與了NCOR的啟動(dòng)子甲基化。下調(diào)DNMT3b可部分逆轉(zhuǎn)LPS介導(dǎo)的NCOR甲基化，并抑制NF-κB的活性和炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)的水平。上述研究說(shuō)明，LPS介導(dǎo)NCOR的DNA 甲基化是促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和釋放炎癥介質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

失控性炎癥反應(yīng)是ALI/ARDS發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，而巨噬細(xì)胞在其中發(fā)揮著重要的作用[17]。當(dāng)內(nèi)毒素刺激肺泡巨噬細(xì)胞時(shí)，LPS將激活細(xì)胞膜表面的Toll樣受體及下游信號(hào)通路NF-κB，產(chǎn)生大量的炎癥因子如TNF-α、IL-6和IL-1β以及ROS，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷。本研究也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象：在LPS刺激下，RAW264.7細(xì)胞的NF-κB的啟動(dòng)子活性顯著增加以及炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)上調(diào)。上述結(jié)果說(shuō)明本研究LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的模型是成功的，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖4 下調(diào)DNMT3b對(duì)NF-κB活性及IL-6和TNF-α表達(dá)的影響；注：A： 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)NF-κB啟動(dòng)子活性；B： Real time-PCR檢測(cè)IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)水平，*與NC組比較，P<0.05；^DNMT3b siRNA組比較，P<0.05；#NC+LPS組比較，P<0.05

NCOR作為核轉(zhuǎn)錄抑制因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在正常狀態(tài)下，NCOR與一些炎癥通路的基因相結(jié)合，使它們處于抑制狀態(tài)[18]。當(dāng)炎癥通路被激活后，NCoR被降解或從炎癥基因的啟動(dòng)子上游離出來(lái)，消除對(duì)NF-κB、AP1等的轉(zhuǎn)錄抑制作用，進(jìn)而釋放大量炎癥因子，加劇炎癥反應(yīng)[17，19]。本研究中，LPS處理后，NCoR的表達(dá)顯著下降，而NF-κB的活性以及炎癥因子的表達(dá)水平顯著升高。而當(dāng)NCOR的表達(dá)水平在DNMT3b siRNA處理下有所上調(diào)時(shí)，NF-κB的活性以及炎癥因子的表達(dá)水平同樣受到了部分抑制，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。上述研究說(shuō)明LPS可調(diào)控NCOR的表達(dá)和定位，其可能的機(jī)制是通過(guò)激活泛素化途徑發(fā)揮作用[20-21]。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)在LPS處理的巨噬細(xì)胞中NCOR發(fā)生了啟動(dòng)子甲基化。當(dāng)使用DNA甲基化清除劑5′-aza和LPS共同處理巨噬細(xì)胞時(shí)，NCOR的表達(dá)水平較之前的LPS單獨(dú)處理時(shí)有明顯的升高，再次說(shuō)明LPS可誘導(dǎo)NCOR的啟動(dòng)子甲基化，進(jìn)而抑制其表達(dá)。

DNMTs是介導(dǎo)DNA甲基化的關(guān)鍵酶，其主要包括DNMT1、DNMT2和DNMT3三類。這三類酶由于mRNA剪切片段的不同又分為幾個(gè)亞型(如DNMT3a、3b)[22]，不同的亞型發(fā)揮著不同的作用[23]。前期研究和其他研究說(shuō)明在急性肺損傷模型中，DNMT3b在介導(dǎo)PPARγ等基因的啟動(dòng)子甲基化中發(fā)揮著重要作用[15-16]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)DNMT3b的表達(dá)。而通過(guò)siRNA下調(diào)DNMT3b后，可部分顯著恢復(fù)下調(diào)的NCOR表達(dá)水平，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)了炎癥通路的激活和炎癥因子的上調(diào)。上述結(jié)果說(shuō)明DNMT3b參與了LPS介導(dǎo)的NCOR 基因啟動(dòng)子甲基化。

綜上所述，本研究進(jìn)一步明確了NCOR在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制，并首次發(fā)現(xiàn)了LPS介導(dǎo)NCOR基因的啟動(dòng)子甲基化。研究結(jié)果為炎癥反應(yīng)的發(fā)生、進(jìn)展提供了新的理論基礎(chǔ)，為ALI/ARDS的防治提供了新的靶點(diǎn)和策略。

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(本文編輯：黃紅稷)

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Lipopolysaccharide modulation the promoter methylation of nuclear receptor corepressor regulated inflammation mediators in macrophages

GuoXiaoli,LiuXia,LeiChuanjiang,WangGuansong,WangJianchun.

DepartmentofRespiratoryDisease,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

WangJianchun,Email:wjc5577@126.com

Objective To investigate the role and potential mechanism of nuclear receptor corepressor (NOCR) at lipopolysaccharide(LPS) mediation inflammation response in macrophages. Methods Western blot, realtime-PCR and luciferase assays was used to detect the expression of NCOR, interleukin-6(IL-6) and tumour necrosisfactor(TNF-α) and promoter activity of nuclear factor-κB (NF-κB) when RAW264.7 cells were treated with 1 μg/ml LPS. The promoter methylation of NCOR was analyzed by methylating-specific PCR(MSP) analysis, and the protein of DNMT3b was evaluated by western blot after cells stimulation with 1 μg/ml LPS for 48 h. Real time-PCR was also used to evaluate the expression of NCOR mRNA when RAW264.7 was treated with 1 μg/ml LPS combine with 1μM 5′-aza. After DNMT3b siRNA was transfected into RAW264.7 for 48 h, the mRNA and protein of DNMT3b was detected by western blot and real time-PCR. Additional, the expression of NCOR, TNF-α and IL-6 and NF-κB activity was analyzed after RAW264.7 was treated with 1 μg/ml LPS combine with DNMT3b siRNA. Results The expression of NCOR mRNA and protein was significantly decreased (P<0.05) and the expression of TNF-α and IL-6 mRNA, DNMT3b protein and activity of NF-κB was elevated (P<0.05) after cells was treated with 1 μg/ml LPS for 24 and 48 h, respectively. MSP assay showed LPS could modulate the NCOR promoter methylation. The expression of DNMT3b mRNA and protein was decreased after cells were transfected by DNMT3b siRNA. Additionally, down-regulation of DNMT3b was partly reversed LPS modulation the inhibition of NCOR, and decreased the expression of TNF-α and IL-6 mRNA, and activity of NF-κB (P<0.05). Conclusion NCOR promoter methylation is key step of occurrence and development of LPS mediation inflammation response. It might be a potential target for acute lung injury / acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS) treatment.

Nuclear receptor corepressor; DNA methylation; Nuclear factor-k-gene binding protein; Inflammatory factor

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.009

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170066)

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸內(nèi)科

王建春，Email: wjc5577@126.com

R563

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2017-02-07)