LC-MS/MS 法同時檢測生物檢材中鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己

姬圣潔，劉偉

（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063）

·論著·

LC-MS/MS 法同時檢測生物檢材中鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己

姬圣潔1，2，劉偉2

（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063）

目的建立準(zhǔn)確、靈敏的生物檢材中鉤吻素子、鉤吻素甲及鉤吻素己的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）檢測方法，并進行方法學(xué)驗證。方法以士的寧為內(nèi)標(biāo)，血液、尿液及肝組織樣品經(jīng)1%氫氧化鈉溶液堿化后用乙酸乙酯提取，采用ZORBAX SB-C18柱（150mm×2.1mm，5μm）分離，以甲醇-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）為流動相進行梯度洗脫。定性定量分析采用電噴霧正離子化（ESI+）、多反應(yīng)監(jiān)測模式。結(jié)果血液、尿液及肝組織中鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.9950，檢出限分別為0.1 ng/mL（或0.1 ng/g）、0.1ng/mL（或0.1 ng/g）及0.01ng/mL（或0.01ng/g），各生物堿提取回收率為61.9%～114.6%，準(zhǔn)確度為92.4%～114.3%，日內(nèi)、日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過11.0%。結(jié)論本方法選擇性好、靈敏度高，適用于同時檢測生物體液和組織中的鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己，可為鉤吻中毒的臨床診治和法醫(yī)學(xué)鑒定提供有效的技術(shù)支撐。

法醫(yī)毒理學(xué)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；鉤吻素子；鉤吻素甲；鉤吻素己；生物檢材

鉤吻（Gelsemium elegans Benth.）為馬錢科胡蔓藤屬植物胡蔓藤的全株，又名胡蔓藤、斷腸草、大茶藥、野葛、毒根等，主要分布在東南亞和我國的云南、貴州、福建、廣東、廣西、浙江、湖南等地。胡蔓藤屬植物共有三種，除了鉤吻外還有分布在北美地區(qū)的常綠鉤吻（Gelsemium sempervirens Alt.）和沼澤茉莉（Gelsemium rankinii Small.）。在民間，鉤吻多以外用為主，具有祛風(fēng)、殺蟲止癢、消腫拔毒的療效，此外還有抗腫瘤、抗焦慮、消炎止痛、免疫調(diào)節(jié)、散瞳等功效[1-3]。鉤吻為劇毒植物，臨床上對人的消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)和呼吸系統(tǒng)都有不同程度的損害，嚴(yán)重者可因呼吸麻痹而死亡[4]。吲哚類生物堿為胡蔓藤屬植物的主要化學(xué)成分，也是其發(fā)揮藥理作用和產(chǎn)生毒性的主要來源，目前在其中共發(fā)現(xiàn)121種吲哚類生物堿[5]。分布在亞洲地區(qū)的鉤吻以鉤吻素子（koumine）含量最高[6]，鉤吻素甲（gelsemine）次之，有研究[7，8]表明鉤吻素己（gelsenicine）毒性更大（三者的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1），分布在不同地區(qū)的鉤吻化學(xué)成分會有些許差異。由于鉤吻治療量和中毒量非常接近，因使用不當(dāng)、自殺、惡意投毒或治療過程中發(fā)生中毒甚至死亡的案件時有發(fā)生[9]，因此，有必要建立靈敏、可靠的分析方法檢測生物檢材中的鉤吻生物堿。

圖1 鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己的化學(xué)結(jié)構(gòu)

目前，生物檢材中鉤吻生物堿的分析方法主要有液相色譜（LC）法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法[11，12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[14-17]。與前幾種方法相比，LC-MS/MS法將液相色譜的分離能力和質(zhì)譜提供化合物結(jié)構(gòu)信息的功能結(jié)合在一起，具有選擇性強、靈敏度高的優(yōu)勢。現(xiàn)有文獻中所報道的分析方法一般只檢測鉤吻素甲或（和）鉤吻素子，適用的檢材單一，難以滿足鉤吻中毒鑒定的需求。因此本研究擬建立同時檢測多種生物檢材（血液、尿液、肝組織）中鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己的LC-MS/MS法，旨在為鉤吻中毒的臨床診治和法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

AcquityTM超高效液相色譜儀（美國Waters公司），4000 Q TRAP四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司），MD200-2氮氣吹掃儀（杭州奧盛儀器有限公司），HR2860 Cucina攪拌機（荷蘭皇家飛利浦電子公司），TDZ4-WS離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），Centrifuge 5810R冷凍離心機（德國Eppendorf公司），BSA124S電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］，XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)大儀器有限公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.1.2 試劑

對照品鉤吻素子（純度99.56%）、鉤吻素甲（純度98.36%）及鉤吻素己（純度99.53%）均購自成都曼思特生物科技有限公司，內(nèi)標(biāo)士的寧對照品（以97%計）購自中國藥品生物制品檢定所。

甲醇、乙腈、乙酸銨（純度≥99.0%）、50%甲酸溶液，均為HPLC級，購自美國Fluka公司；氫氧化鈉、乙酸乙酯、乙醚、氯仿，均為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；硼砂購自優(yōu)耐德引發(fā)劑（上海）有限公司；實驗用水為超純水，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

空白血液（經(jīng)肝素抗凝）、空白尿液均來源于健康志愿者（均已知情同意），空白肝為市售的新鮮豬肝。

1.1.3 溶液配制

對照品溶液：分別精密稱取鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己對照品5mg，置于5mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度均為1mg/mL的鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己甲醇儲備液，密封后置于-20℃冰箱中冷凍保存，備用。實驗中所需要的不同濃度的對照品溶液均從上述儲備液中用甲醇稀釋獲得。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取士的寧對照品10mg置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定量至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的士的寧甲醇儲備液。取適量士的寧儲備液，用甲醇稀釋得2μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。士的寧儲備液和工作液密封后在4℃冰箱中保存，待用。

20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）：稱取乙酸銨0.77 g置于500mL容量瓶中，加入適量超純水溶解，再加入50%甲酸溶液0.92g和乙腈25mL，以超純水定容至刻度，充分混勻即可。

復(fù)溶溶液：V（甲醇）∶V［20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）］=70∶30。

1.2 實驗方法

本實驗對色譜柱、流動相、質(zhì)譜母離子和子離子、內(nèi)標(biāo)以及樣品前處理中的萃取溶劑、堿化試劑、復(fù)溶溶液進行了優(yōu)化，以下是優(yōu)化后的實驗條件。

1.2.1 樣品前處理

取血液或尿液樣品0.5mL，加入2μg/mL士的寧工作液10μL、1%氫氧化鈉溶液50μL，渦旋混合1min（混合物pH值約為8.2），再加入乙酸乙酯3mL萃取，渦旋2min后，以離心半徑12 cm，3 000 r/min，離心3min。取上清液于50℃下在氮氣吹掃儀上吹干，加入復(fù)溶溶液100μL，混勻后供LC-MS/MS分析。

將生物組織剪碎并研磨成勻漿，稱取組織勻漿0.5 g，加入2μg/mL士的寧工作液10μL、1%氫氧化鈉溶液800μL，渦旋混合1min（混合物pH值約為9.0），再加入乙酸乙酯3mL萃取，渦旋3min后，以離心半徑12 cm，3 000 r/min，離心3min。取上清液于50℃下在氮氣吹掃儀上吹干，加入復(fù)溶溶液200μL，渦旋均勻后轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，于-20℃冰箱中放置30min，4℃下以離心半徑9.5 cm，13 000 r/min，離心2min，取上清液供LC-MS/MS分析。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18柱（150mm×2.1mm，5μm），購自美國Agilent公司，柱溫為室溫，前接ZORBAX-Extend-C18保護柱（美國Agilent公司）；流動相A為20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈），B為甲醇；流速為0.2mL/min；梯度洗脫程序為0～0.5min 10%B，0.5～0.6min 10%～40%B，0.6～1.5min 40%B，1.5～1.6min 40%～70%B，1.6～5.5min 70%B，5.5～5.6min 70%～10%B，5.6～8.0min 10%B；進樣量為5μL。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源采用正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitor，MRM），離子源電壓5 500 V，離子源溫度500℃，氣簾氣30 psi，霧化氣40psi，輔助氣50 psi。

在上述質(zhì)譜條件下，用針泵分別將單獨含有10 ng/mL鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己和士的寧的甲醇溶液，以10μL/min的流速注入質(zhì)譜，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。其中化合物的兩對母離子-子離子對用于定性分析，第一對離子對用于定量分析，LC-MS/MS參數(shù)見表1。

表1 鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己和內(nèi)標(biāo)士的寧的LC-MS/MS參數(shù)

1.3 方法學(xué)驗證

對所建方法的選擇性、線性、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性方面進行驗證。

選擇性：取10份來源于不同個體的空白血液、尿液和肝組織，按照“1.2.1樣品前處理”方法操作，在“1.2.2儀器條件”下進樣分析；另取相同空白基質(zhì)添加鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己和士的寧對照品，同法處理后供LC-MS/MS分析。要求空白基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)對待測物及內(nèi)標(biāo)沒有干擾。

線性和靈敏度：分別取空白血液、尿液和肝組織0.5mL（g）若干份，添加不同濃度的鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以及內(nèi)標(biāo)對照品溶液配制成系列樣品，每個濃度平行2份。樣品按照“1.2.1樣品前處理”方法操作，在“1.2.2儀器條件”下進樣分析。以3種待測物含量（ng/mL或ng/g）為橫坐標(biāo)，待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)作線性回歸（權(quán)重系數(shù)1/x），得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并將信噪比S/N≥3和S/N≥10的濃度分別作為檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。

準(zhǔn)確度和精密度：分別取空白血液、尿液和肝組織0.5mL（g）若干份，添加不同濃度的鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以及內(nèi)標(biāo)對照品溶液，配制成低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行6份。樣品按照“1.2.1樣品前處理”方法操作，在“1.2.2儀器條件”下進樣分析。根據(jù)當(dāng)日工作曲線計算待測物濃度，考察方法的準(zhǔn)確度和日內(nèi)精密度，同法測定4d，計算日間精密度。

提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)：制備低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行6份，根據(jù)“1.2.1樣品前處理”方法操作，在“1.2.2儀器條件”下進樣分析，測得各待測物峰面積為A1；相同空白基質(zhì)前處理后再添加待測物，所得峰面積為A2；用復(fù)溶溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液至相同進樣濃度測得峰面積為A3；提取回收率（%）= A1/A2×100%，基質(zhì)效應(yīng)（%）=A2/A3×100%。

穩(wěn)定性：制備低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行6份，分別考察室溫條件下放置24h、樣品處理后于進樣盤中放置24h、3次凍融循環(huán)（-20℃冰箱中放置21 h，轉(zhuǎn)移到室溫下放置3 h，反復(fù)3次）、于-20℃冰箱中冷凍保存1個月這4種條件下待測物的穩(wěn)定性。測定濃度均值與理論濃度的相對偏差絕對值不超過20%，說明待測物的穩(wěn)定性良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的優(yōu)化

2.1.1 儀器條件的選擇

2.1.1.1 色譜柱的選擇

本實驗考察了4種色譜柱對鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己和內(nèi)標(biāo)的分離效果，發(fā)現(xiàn)使用Allure PFP Propyl柱（100mm×2.1mm，5μm）分離時，各待測物峰形過寬且出峰時間較晚；用Capcell Pak C18柱（250mm× 2.0mm，MGⅡ5μm）分離時，待測物的峰形出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾；經(jīng)Phenomenex Luna C18（2）柱（150mm×2mm，3μm）分離時，待測物峰形較寬、不對稱；而最終選用的ZORBAX SB-C18柱（150mm×2.1mm，5μm）可使各待測物分離，峰形較好且靈敏度較高。

2.1.1.2 流動相的選擇

流動相的組成直接影響分離效果、離子化效率和靈敏度。本研究考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液、乙腈-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液、甲醇-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）共6種流動相體系，發(fā)現(xiàn)將乙腈作為有機相時待測物峰形很差，而甲醇-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）梯度洗脫效果較佳，各待測物峰形較窄且出峰時間合適。

2.1.1.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取適量鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己以及內(nèi)標(biāo)士的寧儲備液，用甲醇稀釋成10ng/mL的對照品溶液，在ESI+模式下，經(jīng)針泵以10μL/min的流速注入質(zhì)譜。通過全掃描方式可得到鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己和士的寧的準(zhǔn)分子離子峰作為其母離子，質(zhì)荷比（m/z）分別為307.3、323.4、327.3、335.0。在母離子掃描的基礎(chǔ)上進行子離子全掃描，選擇至少兩個豐度較高的子離子與其母離子組成母離子-子離子對，再優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量。最終選擇兩對母離子-子離子對作為定性離子對，其中豐度較高的一對作為定量離子對。

2.1.1.4 內(nèi)標(biāo)的選擇

內(nèi)標(biāo)法定量是通過測量待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值進行計算的，在一定程度上消除了儀器不穩(wěn)定、進樣量不完全相同等原因引起的誤差。本研究考察了吳茱萸堿、士的寧及麥角新堿3種化合物作內(nèi)標(biāo)時的出峰情況，結(jié)果表明，在本研究的LC-MS/MS條件下吳茱萸堿在8min內(nèi)不出峰，麥角新堿峰形較差且容易殘留在液相系統(tǒng)里，而士的寧與被分析物極性相似、不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，峰形良好，與待測物能夠很好地分離且保留時間與各待測物接近，能夠很好地起到校正的作用。

2.1.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.2.1 萃取溶劑的選擇

在LC-MS/MS分析中，生物樣品前處理常用液液萃取法、蛋白沉淀法和固相萃取法，需要結(jié)合檢材的特點和待測物的理化性質(zhì)來選擇。鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己難溶于水，可溶于氯仿、乙酸乙酯等有機溶劑，選擇液液萃取法進行前處理。本實驗比較了乙醚、乙酸乙酯和氯仿3個溶劑的提取效率，血液樣品中氯仿＞乙酸乙酯＞乙醚，尿液樣品中乙酸乙酯＞氯仿＞乙醚，但氯仿毒性較大，綜合考慮選擇乙酸乙酯作為提取溶劑，經(jīng)方法驗證表明此前處理方法能得到滿意的靈敏度和提取回收率。

2.1.2.2 堿化試劑的選擇

鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己都屬于生物堿類，部分以生物堿鹽的形式存在。若要提取完全，通常需要加入堿化試劑使生物堿變成游離狀態(tài)。本實驗比較了硼砂和氫氧化鈉溶液的堿化效果，0.5mL血液或尿液樣品中加入pH=9.2的硼砂緩沖溶液1mL后用乙酸乙酯萃取，可獲得較為滿意的提取回收率，但采用此法處理0.5 g肝組織樣品時，提取回收率小于10%，堿化不完全導(dǎo)致提取效率太低。用1%氫氧化鈉溶液50μL替代pH=9.2的硼砂緩沖溶液1mL加入血液或尿液（混合物pH值約為8.2），提取回收率為67.6%～97.2%，二者的堿化效果相差不大。0.5 g肝組織加入1%氫氧化鈉溶液800μL（混合物pH值約為9.0），提取回收率可提高到61.9%～114.6%。選用的氫氧化鈉溶液濃度較低，在生物檢材中產(chǎn)生的固化作用不嚴(yán)重，對實驗結(jié)果沒有明顯的不良影響，因此經(jīng)過綜合比較，選擇1%氫氧化鈉溶液作為堿化試劑。

2.1.2.3 復(fù)溶溶液的選擇

樣品復(fù)溶溶液的組成會影響待測物的色譜行為及離子化效率。本實驗比較了4種不同比例的流動相溶液，即甲醇與20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）的體積比分別為100∶0、70∶30、40∶60、10∶90，作為復(fù)溶溶液時進樣分析的出峰情況。實驗結(jié)果表明，甲醇的比例越高，各組分的峰形更好、豐度更高。但肝組織中含有較多的脂溶性成分，甲醇相比第二種比例的流動相溶解了更多的脂溶性雜質(zhì)，因此最終選擇甲醇與20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈）的體積比為70∶30時的流動相作為復(fù)溶溶液。

處理血液和尿液樣品時復(fù)溶溶液體積為100μL，而處理肝組織樣品時改為200μL，因為肝組織中脂溶性雜質(zhì)較多，多次進樣后可能會影響色譜柱的柱效導(dǎo)致峰形變差、靈敏度下降，在保證靈敏度的前提下增大復(fù)溶溶液的體積可減輕雜質(zhì)的影響。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 選擇性

空白血液、尿液和肝組織的MRM色譜圖見圖2～4。以血液樣品為例，空白血液中加入各待測物后含鉤吻素子（10 ng/mL）、鉤吻素甲（10 ng/mL）、鉤吻素己（1 ng/mL）以及內(nèi)標(biāo)士的寧（40ng/mL），按照“1.2.1樣品前處理”方法操作，在“1.2.2儀器條件”下進樣分析，結(jié)果見圖5，鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己和士的寧的保留時間分別為3.76、3.58、3.89、3.70min。比較兩者的MRM色譜圖可知空白樣品在待測物及內(nèi)標(biāo)的出峰位置無響應(yīng)，說明空白基質(zhì)的內(nèi)源性物質(zhì)對分析物的測定沒有干擾。

圖2 空白血液的MRM色譜圖

圖3 空白尿液的MRM色譜圖

圖4 空白肝組織的MRM色譜圖

圖5 空白血液中添加待測物后的MRM色譜圖

2.2.2 線性范圍、LOD和LOQ

血液、尿液及肝組織中鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.9950，LOD分別為0.1ng/mL（或0.1ng/g）、0.1ng/mL（或0.1ng/g）及0.01ng/mL（或0.01ng/g），結(jié)果見表2，本方法的靈敏度和線性范圍能夠滿足臨床診治和法醫(yī)毒物分析的需要。

2.2.3 準(zhǔn)確度和精密度

對于生物樣品分析，要求方法的準(zhǔn)確度應(yīng)在85%～115%，在LOQ附近可放寬至80%～120%；方法精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）應(yīng)控制在15%，在LOQ附近RSD應(yīng)小于20%。本研究的結(jié)果見表3，各待測物的準(zhǔn)確度在92.4%～114.3%，日內(nèi)、日間精密度的RSD不超過11.0%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足要求。

2.2.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

本方法提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的實驗結(jié)果見表3，各待測物的提取回收率為61.9%～114.6%，表明乙酸乙酯液液萃取的前處理方法可達到較滿意的提取效率?；|(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為輕微抑制，可能與樣品基質(zhì)、流動相、樣品前處理過程、色譜分離效果和離子化等因素有關(guān)。

表2 生物檢材中鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）、LOD、LOQ

表3 各檢材中鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己的準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（%）

2.2.5 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性考察的結(jié)果顯示，血液、尿液及肝組織樣品在室溫條件下放置24h、樣品處理后于進樣盤中放置24h、3次凍融循環(huán)（-20℃冰箱中放置21 h，轉(zhuǎn)移到室溫下放置3h，反復(fù)3次）、于-20℃冰箱中冷凍保存1個月這4種保存條件下，鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己相對偏差的絕對值均不超過19.6%，表明各待測物的穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

本研究建立了一種同時檢測生物檢材（血液、尿液和肝組織）中鉤吻素子、鉤吻素甲和鉤吻素己的LCMS/MS法，該方法專屬性強、靈敏度高，能為鉤吻中毒的臨床診治和法醫(yī)毒物分析提供有效的技術(shù)支持。

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Simultaneous Quantitative Analysis of Koum ine,Gelsem ine and Gelsenicine in Biological Samp les by LC-MS/MS

JI Sheng-jie1,2,LIU Wei2
（1.Department of Forensic Medicine,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032, China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo establish a LC-MS/MS method which is accurate and sensitive for determ ination of koum ine,gelsemine,and gelsenicine in biological samples and to verify the method.MethodsStrychnine was used as internal standard.Analytes in blood,urine and liver w ith 1%sodium hydroxide solution were extracted by ethyl acetate.Chromatographic separation was achieved on a ZORBAX SBC18column（150mm×2.1mm,5μm）,and gradient elution was performed w ith the buffer solution of methanol-20mmol/L ammonium acetate（including 0.1%formic acid and 5%acetonitrile）as mobile phase. Qualitative and quantitative analysis was performed in the multiple reaction monitoring mode coupled w ith an electrospray ionization source under positive ion mode（ESI+）.ResultsThe linearity of koumine, gelsemine and gelsenicine in blood,urine and liverwas good w ithin corresponding linear limitation and the correlation coefficients（r）＞0.9950.The limits of detection were 0.1ng/m L（0.1ng/g）,0.1 ng/m L（0.1ng/g）and 0.01ng/m L（0.01ng/g）,respectively.The extraction recovery and accuracy of the alkaloids ranged from 61.9%to 114.6%and 92.4%to 114.3%,respectively.The relative standard deviations of the intra-day and inter-day precisions were not more than 11.0%.ConclusionThe method is selective,sensitive and suitable for simultaneous determination of koum ine,gelsemine and gelsenicine in body fluids and tissues, which offering technical support for clinical diagnosis and treatment and forensic toxicological analysis of Gelsemium elegans poisoning.

forensic toxicology;liquid chromatography-tandem mass spectrometry;koum ine;gelsem ine; gelsenicine;biological samples

DF795.1

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.007

1004-5619（2017）02-0141-07

2016-12-09）

（本文編輯：嚴(yán)慧）

十三五國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFC0800706）；上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室資助項目（17DZ2273200）；上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺資助項目（16DZ2290900）

姬圣潔（1991—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)毒物分析研究；E-mail：JSJ1990jsj@126.com

劉偉，女，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)毒物分析研究；E-mail：liuw@ssfjd.cn