超聲波輔助酶法提取胡桃楸種仁殼多糖的工藝優(yōu)化

王秋陽(yáng)+沙迪+徐紅艷

摘要：為確定胡桃楸（Juglans mandshurica）種仁殼多糖超聲波輔助酶法提取工藝條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取纖維素酶添加量、超聲時(shí)間、超聲功率為自變量，多糖得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程，并確定種仁殼多糖最佳工藝參數(shù)為纖維素酶添加量0.31%，超聲時(shí)間40 min，超聲功率400 W。其中超聲功率對(duì)胡桃楸種仁殼多糖得率影響最大，其次是纖維素酶添加量，影響最小的是超聲時(shí)間，回歸模型預(yù)測(cè)的多糖得率理論值為1.35%。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，RSD為0.97%，該回歸方程與實(shí)際情況擬合較好。

關(guān)鍵詞：胡桃楸（Juglans mandshurica）種仁殼；多糖；提取工藝；酶法；超聲波；響應(yīng)面

中圖分類號(hào)：S792.132；TS255.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）07-1315-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.030

Optimization of Ultrasonic-assisted Enzyme Extraction of Polysaccharide from Juglans mandshurica Seed Shell by Response Surface Methodology

WANG Qiu-yang，SHA Di，XU Hong-yan

（College of Agricultural，Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract：To optimize ultrasonic-assisted enzyme extraction of polysaccharide from seed shell of Juglans mandshurica，single factor test were carried out. Based on this，enzyme amount，ultrasonic time and ultrasonic power were selected as variables. And a mathematical model was obtained according to response surface methodology. Results showed that the following optimum parameters：enzyme amount 0.31%，ultrasonic time 40 min，ultrasonic power 400 W. The effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides was primary，effect of enzyme amount was secondary，and effect of ultrasonic time was last. The predicted value of extraction yield of polysaccharide was 1.35%. After confirmatory test，the relative standard deviation was 0.97%. The regression equation was fitting better with actual situation.

Key words：Juglans mandshurica seed shell；polysaccharide；extraction technology；enzyme；ultrasonic-assisted extraction；response surface methodology

胡桃楸（Juglans mandshurica）又名核桃楸、山核桃、楸樹(shù)，為胡桃科胡桃屬落葉喬木，在東北分布廣闊[1]，是珍貴的用材樹(shù)種，也是重要的藥源植物，其葉、樹(shù)皮、根及果實(shí)均可入藥[2]。胡桃楸與水曲柳、黃菠蘿并稱“東北三大硬闊”[3]，是國(guó)家級(jí)保護(hù)植物[4]。研究證實(shí)，胡桃楸具有抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎和殺菌等作用[5]。胡桃楸種子是林業(yè)副產(chǎn)品，其種仁（俗稱山核桃仁）營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，早已成為人們的食療佳品，成為研究和關(guān)注的熱點(diǎn)[6，7]。在種仁生產(chǎn)過(guò)程中，產(chǎn)生大量的種仁殼廢棄物，研究顯示，胡桃楸種仁殼中含有氨基酸、多糖、皂甙、黃酮、揮發(fā)油、強(qiáng)心甙、香豆素類等[8]多種化學(xué)成分。目前，對(duì)胡桃楸種子的研究主要集中在種仁的營(yíng)養(yǎng)成分和在食品加工中的應(yīng)用方面[9，10]，關(guān)于種仁殼的研究較少[11-14]，而有關(guān)種仁殼多糖的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

多糖（Polysaccharides，PS）又稱多聚糖，是由10個(gè)以上的單糖分子通過(guò)糖苷鍵聚合而成，是一類大分子化合物[15]。多糖廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜、高等植物和微生物細(xì)胞壁中，從量上講，是碳水化合物在自然界中存在的主要形式[16]。多糖是中草藥的主要活性成分之一，受到生物醫(yī)學(xué)和功能性食品領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[17]，研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗炎、抗病毒等生物功能[18]，具有高效、低毒的特點(diǎn)，并已得到廣泛應(yīng)用[19-21]。

本研究以加工胡桃楸種仁產(chǎn)生的廢棄物種仁殼為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助酶法提取種仁殼多糖的條件，旨在為種仁殼多糖的深入研究提供理論依據(jù)，可提高長(zhǎng)白山胡桃楸種子的附加值，促進(jìn)其綜合開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

胡桃楸種子：由吉林省和龍市林業(yè)局提供。

無(wú)水葡萄糖、5%苯酚溶液、濃硫酸，均為分析純。

UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BSA124S-CW型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝 胡桃楸種仁殼→粉碎→過(guò)60目篩→80%乙醇回流提取→抽濾→粉末晾干→加去離子水→酶解→超聲波提取→離心→收集上清液→濃縮→醇沉→離心→收集沉淀→丙酮、乙醚洗滌→去離子水定容→測(cè)多糖含量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按Xu等[22]采用苯酚-硫酸法，精確稱取105 ℃真空干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖24.0 mg，去離子水100 mL定容，得到濃度為0.24 mg/mL的多糖溶液。精確移取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL多糖溶液于比色管中，再分別加2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2 mL去離子水，然后依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸，混勻，40 ℃水浴15 min，然后冷水冷卻10 min，去離子水作空白，于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，以吸光度（y）對(duì)葡萄糖濃度（x）作回歸處理。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.009 7x+0.006 6，R2=0.994 7。

1.2.3 多糖含量的測(cè)定 按張帥等[23]方法計(jì)算多糖得率，按照以下公式：

多糖得率=C/1 000×n×V/m×100%

式中，C為按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的多糖質(zhì)量濃度（mg/mL），n為稀釋倍數(shù)，V為液體體積（mL），m為原料干質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 以多糖得率為指標(biāo)，以纖維素酶添加量、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率為因素，進(jìn)行胡桃楸種仁殼多糖提取的單因素試驗(yàn)。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平響應(yīng)面法，以纖維素酶添加量、超聲時(shí)間、超聲功率3個(gè)因素為自變量，以多糖得率為響應(yīng)值，采用最小二乘法擬合二次多項(xiàng)方程表達(dá)響應(yīng)值，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝條件，提取胡桃楸種仁殼多糖，進(jìn)行3次試驗(yàn)，考察響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件的可行性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Minitab15軟件進(jìn)行試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)胡桃楸種仁殼多糖得率的影響 取胡桃楸種仁殼粉5 g，按1∶20加入去離子水（g∶mL，下同），調(diào)pH為4.5，分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的纖維素酶酶解，40 ℃超聲提取30 min，超聲功率300 W，考察纖維素酶添加量對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著纖維素酶添加量的增多，多糖得率逐漸增加，當(dāng)添加量為0.3%時(shí)，多糖得率最大，之后開(kāi)始下降。這可能是纖維素酶添加量過(guò)大，底物完全反應(yīng)后，過(guò)量的纖維素酶進(jìn)一步分解糖苷鍵而導(dǎo)致得率下降，故選擇0.3%為纖維素酶最佳添加量。

2.1.2 料液比對(duì)胡桃楸種仁殼多糖得率的影響 取胡桃楸種仁殼粉5 g，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入去離子水，調(diào)pH為4.5，加0.3%的纖維素酶酶解，40 ℃超聲提取30 min，超聲功率300 W，考察不同料液比對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著料液比的增加，多糖得率逐漸增加，當(dāng)料液比小于1∶40時(shí)，增加幅度較大，之后呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)。故選擇1∶40為最佳提取料液比。

2.1.3 超聲溫度對(duì)胡桃楸種仁殼多糖得率的影響 取胡桃楸種仁殼粉5 g，按料液比1∶40，調(diào)pH為4.5，加0.3%的纖維素酶酶解，分別在40、50、60、70、80 ℃條件下，超聲功率300 W，超聲提取30 min，考察超聲溫度對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。如圖3所示，隨著超聲溫度的升高，多糖得率不斷增大，在50 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最大，之后又開(kāi)始下降，主要是由于纖維素酶要在適合的溫度下才能發(fā)揮酶解作用，溫度過(guò)高抑制了纖維素酶的活性，從而導(dǎo)致多糖得率的下降。因此，確定最佳超聲溫度為50 ℃。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)胡桃楸種仁殼多糖得率的影響 取胡桃楸種仁殼粉5 g，料液比1∶40，調(diào)pH為4.5，加0.3%的纖維素酶酶解，50 ℃條件下，超聲功率300 W，分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min，考察超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率逐漸增加，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，多糖得率最大，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，多糖得率呈下降趨勢(shì)，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間超聲作用使部分多糖被超聲波的剪切力降解以及非糖類雜質(zhì)溶出過(guò)多，影響多糖得率。因此，確定最佳超聲時(shí)間為40 min。

2.1.5 超聲功率對(duì)胡桃楸種仁殼多糖得率的影響 胡桃楸種仁殼粉5 g，料液比1∶40，調(diào)pH為4.5，加0.3%的纖維素酶酶解，50 ℃條件下，分別在250、300、350、400、450、500 W的超聲功率下，超聲提取40 min，考察超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著超聲功率的增大，多糖得率逐漸增加，當(dāng)超聲功率達(dá)到400 W時(shí)，多糖得率最大，再增大功率則多糖得率呈下降趨勢(shì)，可能是由于超聲波的機(jī)械作用過(guò)大，導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞而影響多糖得率。因此，確定最佳超聲功率為400 W。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化胡桃楸種仁殼多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗(yàn)原理，按表2進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到回歸模型Y=1.283 33+0.051 25X1-0.036 25X2+0.100 00X3-0.064 17X12-0.214 17X22-0.116 67X32+0.010 00X1X2+0.032 50X1X3+0.047 50X2X3。

2.2.2 模型的顯著性檢驗(yàn) 模型的可靠性可以從方差分析及相關(guān)系數(shù)來(lái)考察，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。由表3可知，一次項(xiàng)X3對(duì)多糖得率影響顯著（P<0.05）；二次項(xiàng)X22對(duì)多糖得率影響極顯著（P<0.01），X32對(duì)多糖得率影響顯著（P<0.05）；交互項(xiàng)對(duì)多糖得率影響不顯著（P>0.05）。

由表4可知，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.921 1，對(duì)種仁殼多糖提取所建立的二次多項(xiàng)模型回歸項(xiàng)P值為0.027，具有顯著性（P<0.05）；模型失擬項(xiàng)P值為0.465，不顯著（P>0.05）。因此，該模型擬合度較好，可以用此模型對(duì)胡桃楸種仁殼多糖提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

圖6～圖8分別為纖維素酶添加量、超聲時(shí)間、超聲功率3個(gè)因素影響胡桃楸種仁殼多糖得率的響應(yīng)面和等值線。

綜合分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，超聲功率對(duì)胡桃楸種仁殼多糖得率影響最大，其次是纖維素酶添加量，影響最小的是超聲時(shí)間。依據(jù)回歸方程，響應(yīng)面優(yōu)化種仁殼多糖的最佳提取工藝參數(shù)為纖維素酶添加量0.305%，超聲時(shí)間39.64 min，超聲功率405 W，回歸模型預(yù)測(cè)的多糖得率理論值為1.35%。結(jié)合實(shí)際操作，確定最佳提取工藝參數(shù)為纖維素酶添加量0.31%，超聲時(shí)間40 min，超聲功率400 W。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最終確定的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多糖得率分別為1.26%、1.33%和1.29%，平均得率為1.29%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.97%，可見(jiàn)該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)胡桃楸種仁殼多糖的提取效果。

3 小結(jié)

本研究以長(zhǎng)白山胡桃楸種仁殼為原料，采用響應(yīng)面法對(duì)胡桃楸種仁殼多糖的超聲輔助酶法提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為纖維素酶添加量0.31%，超聲時(shí)間40 min，超聲功率400 W，各因素對(duì)多糖得率影響的主次順序是超聲功率>纖維素酶添加量>超聲時(shí)間。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，種仁殼多糖得率為1.29%，與理論預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)偏差較小，表明經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的種仁殼多糖的提取條件是可行的。長(zhǎng)白山胡桃楸種仁殼可以作為植物多糖的可開(kāi)發(fā)利用資源，但關(guān)于種仁殼多糖的純化、單糖組成分析及活性作用還有待進(jìn)一步研究。

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