魚類標記技術研究進展及在人工增殖放流中的應用

周輝霞+甘維熊

摘要：標記-回捕放流魚苗是評估增殖放流效果的通用方法，成功標記放流的關鍵在于標記技術的選擇。小規(guī)模標記放流時，重點關注標記死亡率、標志保留時間等；而在大規(guī)模標記時，則在此基礎上需考慮標記的勞動強度、成本等因素。對掛牌、被動整合式雷達標、耳石標及分子標的研究概況及其各自優(yōu)缺點進行了綜述，并介紹了大規(guī)模標記技術在國內外人工增殖放流中的應用，為不同背景情況下的放流標記技術的選擇提供參考。

關鍵詞：增殖放流；魚類；標記技術；大規(guī)模標記

中圖分類號：S931.5；S932.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1206-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.002

Advances in Fish Labeling Technology and Its Application

in Artificial Proliferation and Release

ZHOU Hui-xia1，GAN Wei-xiong2

（1.Animal Husbandry Food Stuff Bureau of Shehong County， Sichuan Province， Shehong 629200， Sichuan，China；

2.Yalong River Hydropower Development Company， Ltd.， Chengdu 610051， China）

Abstract： Marking-replenishment floating fry is a common method for assessing the effect of proliferation and release. The key to successful marker release is the choice of marker technology. Small-scale markings are focused on marker mortality， marker retention times， and so on. In addition， in the large-scale marking need to consider the marked labor intensity， cost and other factors. This paper summarizes the research and their advantages and disadvantages of listed， passive integrated radar， otolith and molecular standard， and introduces the application of large-scale marking technology in artificial proliferation and release at home and abroad， Which can provide reference for the selection of discharge marking technology under different background conditions.

Key words： proliferation and release； fish； marking technology； mass-marking

魚類人工增殖放流是主動增殖水域魚類資源的活動，是國內外通用的養(yǎng)護水生生物資源，修護水域生態(tài)和促進漁業(yè)增效的有效手段[1]。近年來，中國各地政府在不同水域都組織開展了大規(guī)模的增殖放流活動，國內大中型水電站也將人工增殖放流作為保護工程河段魚類的一種重要措施。對放流魚類進行標記，可跟蹤其在野外環(huán)境的擴散和存活情況，以及與野外種群的遺傳關系和生態(tài)關系，可科學評估增殖放流效果，對漁業(yè)資源管理具有較強的指導性。本文介紹了當前幾種常用的魚類標記技術，比較各標記技術的優(yōu)缺點，并對適合人工增殖放流的大規(guī)模標記技術進行了綜述，旨在為不同背景下的放流標記技術的選擇提供參考。

1 常用魚類標記技術

1.1 掛牌標記

掛牌標志是將寫有標志魚信息的掛牌用專門材料（不銹鋼絲、聚酯纖維等）固定在魚體上，依據(jù)固著方式不同，可分為3類：穿體標、箭形標和內錨標，前2類標常常固著在魚體背部肌肉，后者則固著在魚體腹部[2]。掛牌標志操作方法較簡單，成本低，且肉眼可識別，因此被廣泛應用，但一般用于個體較大的魚，如體長在15 cm以上的[3]，因為小型魚類可能難以忍受固著時的操縱壓力，難以承受額外的代謝負擔[4]。但國內學者成功應用標志牌標記全長7 cm以上的牙鲆（Paralichthys olivaceus）[5]和褐牙鲆[6]，對全長10 cm以上的半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）也可用T型標志牌標記[7]。在利用標志牌對放流魚進行標記時，不可避免地在魚體標志部位形成傷口，若標記后不經(jīng)處理直接放入野外環(huán)境中，標志魚的標志部位容易惡化，形成壞死，直接導致實驗魚的死亡或生長抑制[8]。黃國光等[9]研究發(fā)現(xiàn)標志部位對黃鰭鯛（Acanthopagrus latus）幼魚的存活有顯著影響，以背鰭棘基部肌肉標志的存活率最高，而背鰭條基部肌肉標志的存活率最低。

1.2 被動整合式雷達標

被動整合式雷達標（Passive integrated transponder，PIT）在魚類上的應用始于20世紀80年代，該標志系統(tǒng)包括標、勵磁系統(tǒng)和信號接收與處理單元[10]。每個PIT標都對應一個惟一的由字母數(shù)字組成的編碼，通過專門注射器將其注入魚體肌肉或腹腔而實現(xiàn)標記，可直接用便攜式檢測器掃描確認，應用范疇極為廣泛[11]。探討PIT標記魚類的存活生長情況和標志保留率是評價該標記方法是否適用于被標記對象的重要指標。研究表明PIT標記死亡主要發(fā)生在標記后10 d內[12，13]，一般標記死亡的魚類都規(guī)格偏小的，如體重小于3 g的金頭鯛（Sparus aurata）[14]和尼羅羅非魚（Tilapia nilotica）[12]標記后都有極高的死亡率。標記后一段時間內的生長抑制現(xiàn)象在幾種鮭科魚類上明顯存在[15]，但隨后的補償生長能彌補前期不足[10]。PIT標志保持率與標記魚類大小密切相關，Acolas等[15]對叉長57～63 mm的褐鱒（Salmo trutta）PIT腹腔標記，脫標率超過20%，而Prentice等[10]和Matthew[13]發(fā)現(xiàn)叉長56～190 mm的大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）PIT標志保持率可達99%～100%。

1.3 耳石標記

1.3.1 耳石化學標記 耳石化學標記主要是使用與鈣具有親和性的熒光化合物作用于標記對象，使其沉積在耳石上以形成在熒光顯微鏡下可識別的熒光標志[16]。自Douglas等[17]發(fā)現(xiàn)鹽酸四環(huán)素（TC）可沉積在魚類骨骼和鱗片上，便開始了魚類耳石化學標記的系統(tǒng)研究，化學標記可在魚類任何生活史包括受精卵階段開展，且耳石標志永久保存[18]，常用于大規(guī)模標記[19]。至今已篩選出可用于標記的常用物質有土霉素（OTC）、鹽酸四環(huán)素、茜素絡合物（ALC）、茜素紅S（ARS）、鈣黃綠素等[19]，四環(huán)素類是使用時間最長的標記物質，但標記效果卻稍遜于ALC和ARS[20，21]，鈣黃綠素能較好地標記很多魚類，但其使用的安全濃度較小，作用時間不易掌握[22]。

標記途徑有注射、浸泡或投喂含有標記物的飼料，研究表明茜素投喂或注射的標記效果都不理想[23]，而浸泡標記效果明顯[24]，而鈣黃綠素通過注射的標記效果優(yōu)于浸泡[25]。選用何種標記物及標記手段一般主要根據(jù)標記魚的大小、生活史階段、標記數(shù)量及資金預算等綜合考慮[26]。

1.3.2 耳石熱標記 魚類耳石能準確記錄生活史中的經(jīng)歷事件，如溫度波動、攝食及饑餓、光周期等，通過閱讀耳石輪紋生成的周期性、寬度及光密度等信息即可推斷歷史背景[27]。耳石熱標記是通過人為短期地對水溫進行調控以改變耳石上的一個或多個生長輪紋的特征，形成終身可識別的標記[28]。Brothers[29]首先發(fā)現(xiàn)紅點鮭耳石生長紋特征與水溫變化密切相關，形成的特殊輪紋可被永久識別，Bergstedt等[30]對此進行了印證。隨后，耳石熱標記在大西洋鮭（Salmo salar）[31]、太平洋鮭（Oncorhynchus）[32]、胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）[33]等魚類上成功應用。僅僅通過人工調控溫度波動就能對胚胎、仔魚耳石進行有效地大規(guī)模標記，方法簡單，且費用低廉。該標記技術已在世界范圍內得到廣泛推廣使用[27]。

1.4 微衛(wèi)星DNA標記

微衛(wèi)星DNA又稱簡單重復序列，是由1～6個堿基組成的短串聯(lián)重復序列，其座位高度豐富，變異率高并且散布于整個真核生物基因組[34]。微衛(wèi)星技術是近年來廣泛應用的DNA標記技術，利用它制備的DNA指紋圖譜也具有極高的個體特異性，這些特點使得它尤其適合于親子鑒定和血緣關系分析方面的應用[35]。篩選出多態(tài)性高的微衛(wèi)星位點，并根據(jù)它們的序列設計出合適的PCR引物，就可對物種身份進行精準的無損鑒定分析。國內學者已對鳙（Aristichthys nobilis）[36]、長薄鰍（Leptobotia elongata）[37]、鱸鯉（Percocypris pingi）[38]、胭脂魚[39]等魚類的微衛(wèi)星位點進行了篩選，為應用微衛(wèi)星標記評估增殖放流效果奠定了基礎[40]。目前的微衛(wèi)星親子鑒定方法主要來源于對人類的研究，分析軟件對常規(guī)二倍體的物種支持率很高，而對鱸鯉等這樣的四倍體或其他多倍體物種的支持率較低。需要探索新的方法，而且需要降低成本。

2 常用魚類標記技術的比較

標記效果是衡量一種標記技術的重要指標，通常選取標記對象的存活率、生長情況及標志保持率等參數(shù)。不同魚類規(guī)格大小對標記效果影響甚大，因此，選擇合適的標記規(guī)格是某種標記技術成功應用的前提。相比耳石標記和微衛(wèi)星標記，掛牌和PIT標記主要針對大規(guī)格魚種，若對規(guī)格偏小的魚類，其存活率、標志保持率都將降低，且生長受抑制[15]，因需要對標記對象逐尾進行標記，勞動強度大，不宜大規(guī)模標記；但二者標記檢測相對簡單，都可做到無損、快速檢測。耳石標記最大的優(yōu)點就是可以大規(guī)模批量處理標記樣本，勞動強度低且標記效果好[19]，但標記檢測需要取出耳石，利用熒光顯微鏡或光學顯微鏡逐一識別，工作量大。而對于微衛(wèi)星標記，無需進行任何形式的物理標志，對魚體沒有傷害，并且終生存在而不影響魚類生活史[40]，但親本和子代遺傳信息提取耗時費錢，專業(yè)門檻高。表1對常用標記技術做了一簡單比較，為標記技術的選擇提供參考。

3 大規(guī)模標記技術研究及應用

本文主要以耳石標記為例，綜述當前大規(guī)模標記研究現(xiàn)況。

3.1 標記方法的建立

藥品濃度與浸泡時間是耳石化學標記方法建立的關鍵參數(shù)，與標記效果成正比[24]，通常是以最低死亡率和最好標記效果為依據(jù)[22]。研究表明不同魚類對藥品的敏感性不一致，藥品使用濃度差異較大，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）仔魚ALC的使用濃度超過20 mg/L就會有較高的死亡率[24]，而日本牙鲆ALC使用濃度可達到300 mg/L[41]。已有研究表明，對于不同種類的魚ALC使用濃度范圍為25～800 mg/L[20，42]，一般具體到某種魚類都需做預實驗。

熱標記可以通過降溫或升溫而實現(xiàn)耳石標記。一般水溫突然降低2 ℃，持續(xù)4～24 h就能在耳石上產(chǎn)生明顯的暗紋[32，43]，暗紋密度與降溫幅度和低溫持續(xù)時間高度相關，溫差變化越大，或低溫持續(xù)時間越長，耳石上暗紋的光密度就越大[44]。通過加熱使水溫高于環(huán)境水溫，期間形成一寬帶低光密度的耳石輪紋，與低環(huán)境水溫下產(chǎn)生的窄帶高光密度的輪紋差異明顯[45]。升溫2.5 ℃即可產(chǎn)生較好的標記效果[27]，Bergstedt等[46]報道12 h熱周期下可形成標記，但Volk等[27]認為小于24 h熱周期的標記效果都不好，延長熱周期至48 h能產(chǎn)生非常清楚的亮帶。

3.2 在人工增殖放流中的應用

耳石標記能一次性大規(guī)模標記仔稚魚及受精卵，在人工增殖放流中的應用前景廣闊。但不管是耳石化學標記或是熱標記，在放流標記前，都需要在實驗室建立標記方法，明確關鍵標記參數(shù)。Baer等[47]用150 mg/L的ARS成功標記放流褐鱒1萬尾，Caraguel等[48]也用150 mg/L的ARS標記放流歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）36萬尾，7個月后成功回捕檢驗了放流效果。相比耳石化學標記，熱標記在國外增殖放流中應用較多，Munk等[49]報道在1988～1998年期間，北太平洋沿岸國家熱標記放流大量鮭鱒魚苗，俄羅斯熱標記放流約880萬尾，加拿大標記約1.2億尾，而美國標記超過60億尾。楊君興等[1]報道在2007～2009年間，中國在近海海域和內陸重要江河湖泊放流各類重要水生生苗種636.6億尾（粒），2010年共放流苗種289.4億尾，但標志放流個體比例少。

近些年，國內科研院所在實驗室內也探索建立了大規(guī)模標記技術，但推廣應用至大型增殖放流實踐中的力度不夠，2012年雅礱江流域水電開發(fā)有限公司委托四川大學在錦屏·官地水電站魚類增殖放流站開展標記放流技術研究及應用，2013～2014年間應用熱標記技術成功標記出膜15 d后的短須裂腹魚（Schizothorax wangchiachii）仔魚約21萬尾，占當年放流魚苗總量的1/4；2015年使用20～40 mg/L的茜素紅S溶液先后分7批，成功浸泡標記短須裂腹魚苗約60萬尾，占放流魚苗總量的50%。

4 存在的問題及建議

魚類標記技術發(fā)展至今已有幾十種，有簡單的物理標記，也有復雜的分子標記。一種理想的標記技術至少應具備以下特點：①標記后魚苗死亡率低；②標記保留時間長；③標記易識別；④能大規(guī)模標記且勞動強度低；⑤標記費用低。但目前所有的標記技術在使用中都存在一定的缺陷，如掛牌、切鰭等傳統(tǒng)標記技術最大的缺陷就是對魚造成機械性損傷，勞動強度大，不宜大規(guī)模標記；而耳石標記或分子標記等大規(guī)模標記手段的標志又不易直接識別；分子標記價格較為昂貴，通常需要專業(yè)的科研人員才能實施，不利于大規(guī)模的推廣。尋找一種能夠從外觀上快速識別標記個體，又能夠包含豐富信息的標記技術，同時花費低廉，是魚類標記技術研究的目標，但事實上卻困難重重。因而，利用現(xiàn)有標記手段，針對不同的放流種類和研究目的，選擇合適的標記技術才是切實可行的。

對于繁殖親本或中華鱘等國家級珍稀魚類時，可以使用PIT標簽，便于追蹤和識別，能對個體進行精細化管理。而標記數(shù)十萬的放流個體，則應重點考慮適合大規(guī)模標記的方法。短期研究較大規(guī)格放流魚苗的生長情況，則可以在魚體皮下注射熒光染料，直接肉眼辨識即可。

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