松墨天牛分子生物學研究綜述

劉琪司+陳敬祥+林同

摘要：松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）是危害馬尾松等林木的重大森林害蟲，是松材線蟲的主要傳播媒介。從松墨天牛的分子生物學基礎(chǔ)研究、分子分類及鑒定、cDNA文庫與轉(zhuǎn)錄組的構(gòu)建、基因克隆、藥劑脅迫對基因表達的影響等5個方面綜述其在分子生物學領(lǐng)域的最新進展，以促進松墨天?；A(chǔ)研究，并為探索松墨天牛安全有效的防治方法提供參考。

關(guān)鍵詞：松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）；分子生物學；基因克??；基因表達；農(nóng)藥脅迫

中圖分類號：S763.38；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1201-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.001

Reviews on Molecular Biology of Monochamus alternatus Hope

LIU Qi-si， CHEN Jing-xiang， LIN Tong

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract： Monochamus alternatus is a major forest pest that damages trees such as Pinus massoniana and is the main medium of pine wood nematode. In the paper，the latest progresses in the field of molecular biology were reviewed from five aspects including fundamental research of molecular biology，molecular classification and identification，construction of cDNA library and transcriptome analyses，gene cloning and insecticides stress on gene expression of M. alternatus et al，which may provide new references for fundamental research and the control of M. alternatus.

Key words： Monochamus alternatus Hope； molecular biology； gene cloning； gene expression； pesticide stress

松墨天牛（Monochamus alternatus Hope），又名松褐天牛、松天牛，隸屬于鞘翅目（Coleoptera）天牛科（Cerambycidae）溝脛天牛亞科（Lamiinae），分布于中國的西藏自治區(qū)以東，河北省以南、東至臺灣省、南至廣東省區(qū)域；國外分布于日本、朝鮮、老撾等[1]。主要危害馬尾松（Pinus massoniana）、油松（P. tabulaeformis）、黑松（P. thunbergii）等生長衰弱的樹木或新伐倒樹木[2]，是中國南方松林的重要蛀干害蟲。同時，它又是松樹毀滅性病害松材線蟲[Bursaphelenchus xy-lophilus（Steiner et Buhrer） Nicle]的主要媒介昆蟲。在日本和中國，該病蟲主要通過羽化后的松墨天牛成蟲補充營養(yǎng)和產(chǎn)卵時造成的傷口侵入健康樹木進行自然傳播，給松樹造成重大損失[3，4]。因其為害嚴重且防治困難已被許多國家列為檢疫對象。近年來，松墨天牛分子生物學研究進展迅速，新的研究成果不斷涌現(xiàn)，本文綜述近3年來松墨天牛分子生物學研究的最新進展，以促進松墨天?；A(chǔ)研究，并為探索松墨天牛安全有效的防治方法提供參考。

1 分子生物學基礎(chǔ)研究

1.1 松墨天牛成蟲標本保存方法

DNA作為生物體重要的遺傳資源，包含著豐富的生物學信息，是生物進化史的重要記錄者，獲取高質(zhì)量的基因組DNA是開展任何DNA下游工作的前提和基礎(chǔ)。因此，研究昆蟲標本的妥善保存方法，以及基因組DNA提取方法，阻止或延緩其基因組DNA的降解，對深入開展其分子生物學研究具有重要意義。曲良建等[5]采用SDS-蛋白酶K消化法對液氮中冷凍保存、無水乙醇-20 ℃冷凍保存、無水乙醇室溫保存和干標本室溫保存且保存時間在2年以上的松墨天牛成蟲標本基因組DNA進行提取，并對不同保存方式提取的DNA樣本進行了質(zhì)量比較和分析。在上述常見的松墨天牛成蟲標本4種保存方式中，以液氮中冷凍保存效果最佳，其次為無水乙醇 -20 ℃冷凍保存，插針干標本室溫保藏效果最差。利用昆蟲線粒體基因COⅠ和COⅡ的通用引物從上述DNA中均能夠成功擴增出目的片段，測序結(jié)果證實擴增片段符合預期。研究結(jié)果表明液氮和無水乙醇-20 ℃冷凍保存適合松墨天牛成蟲標本長期保存，且不影響后續(xù)的PCR擴增和測序。

1.2 松墨天?；瘜W感受組織熒光定量PCR內(nèi)參基因的鑒定

實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）是分子生物學領(lǐng)域研究基因表達的最有效方法之一[6]。在RT-qPCR實驗過程中，需要引入內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進行校正和標準化處理。馮波等[7]從松墨天牛轉(zhuǎn)錄組中鑒定出9個候選內(nèi)參基因（Actin，TUB，18S rRNA，RPS27A，RPS3，RPL10，AK，GAPDH和EFlA），其中后7個候選內(nèi)參基因在松墨天牛中被首次鑒定。結(jié)果顯示最適合校正松墨天牛化學感受組織中基因表達數(shù)據(jù)的內(nèi)參基因為GAPDH和TUB，并且這樣的內(nèi)參基因組合可以用于不同發(fā)育階段和不同性別的不同化學感受組織。該研究結(jié)果為利用RT-qPCR技術(shù)分析松墨天?；瘜W感受組織基因相對表達量的內(nèi)參基因選擇提供了參考。但不同組織在不同條件下內(nèi)參基因的選擇還要視具體研究情況而定，需要進行實驗驗證。

2 分子分類方法及鑒定

2.1 核糖體28S rDNA基因和18S rDNA基因

張健等[8]對天?？?亞科32種天牛的28S rDNA基因部分序列進行測定和分析，結(jié)果證明了天牛科各亞科的單系性以及異天牛亞科應為較原始類群，并認為28S rDNA序列是一種有效的解析天?？聘呒壏诸愲A元系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分子標記。魏子涵等[9]采用18S rDNA（V4、V7區(qū)）分子標記，分析和測定了49種天牛基因序列，并對天牛總科3科6亞科的70種天?；蛐蛄袠?gòu)建進化樹，結(jié)果顯示溝脛天牛亞科（Lamiinae）、天牛亞科（Cerambycinae）、鋸天牛亞科（Prioninae）和瘦天?？疲―isteniidae）為單系性進化群，這與傳統(tǒng)形態(tài)學分類結(jié)果相似，證明18S rDNA（V4、V7區(qū)）是探討天牛高級階元分類有效的分子標記。在這兩項研究的基礎(chǔ)上魏子涵等[10]利用28S rDNA D2和D3區(qū)以及18S rDNA V4和V7區(qū)聯(lián)合序列成功構(gòu)建出了天?？偪聘唠A元的系統(tǒng)發(fā)育樹，表明聯(lián)合序列分析是探討天牛高階元分類的有效方法。

2.2 線粒體COⅠ基因和線粒體COⅡ基因

鄭斯竹等[11]測定分析了11種墨天牛線粒體DNA細胞色素氧化酶C亞基Ⅰ基因（COⅠ），構(gòu)建了墨天牛屬的分子進化樹，結(jié)果顯示分子結(jié)果與形態(tài)分類結(jié)果相似，本段COⅠ基因可以為墨天牛屬分類階元關(guān)系提供依據(jù)。李京等[12]研究測得了溝脛天牛亞科部分種類的COⅡ序列，發(fā)現(xiàn)族、屬、種各階元間序列差異適中，具有廣泛的適用性，并認為COⅡ基因是溝脛天牛亞科分子系統(tǒng)學研究的有效工具。

2.3 DNA條形碼在墨天牛鑒定中的應用

為了對進境口岸截獲的俄羅斯木材中的墨天牛屬（非中國種）害蟲進行準確、快速的鑒定，陳夢義等[13]利用DNA條碼試劑盒檢測技術(shù)，基于墨天牛線粒體COⅠ（線粒體細胞色素氧化酶亞基I）基因設(shè)計1對巢式引物，對截獲墨天牛屬中的8個種COⅠ進行擴增，將擴增序列上傳至有害生物信息網(wǎng)站，依據(jù)堿基位點在不同種間的排列和組成的差異，獲得不同種在相應位點上的特有堿基，即標記性堿基，以此作為區(qū)分墨天牛種的依據(jù)。通過這種墨天牛屬DNA條碼試劑盒檢測技術(shù)，可為口岸檢疫鑒定提供有效的技術(shù)手段。

3 轉(zhuǎn)錄組與cDNA文庫

3.1 松墨天牛轉(zhuǎn)錄組

Lin等[14]通過Illumina測序和從頭組裝共獲得48 787條Unigenes序列，平均長度為721 bp。NR注釋的結(jié)果表明，78.1%的序列與赤擬谷盜的序列相似性最高。Unigenes的GO分類顯示，共有13 485個轉(zhuǎn)錄本歸屬于至少一個GO條目，包括60個功能組，其中在生物過程中，“細胞過程”、“代謝過程”和“單生物過程”包含的基因較多；細胞學成分中，大多數(shù)基因集中在“細胞”、“細胞組分”或“細胞器”；在分子功能中，“催化活性”和“binding”中的基因最多。代謝通路分析結(jié)果顯示在KEGG中可顯著比對上18 915個Unigenes，歸屬于258個通路，代謝通路中的基因數(shù)量明顯多于其他通路。在NR比對上的序列中有9 005條歸屬于COG中，25個COG類別中，與基礎(chǔ)生理和代謝功能相關(guān)的基因最多。在此基礎(chǔ)上，鑒定出與殺蟲劑解毒和殺蟲劑靶標酶相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄本。上述研究結(jié)果為克隆和分析松墨天牛新的功能基因奠定了基礎(chǔ)。

3.2 松墨天牛觸角cDNA文庫

高雄[15]挑取2 052個單克隆進行測序，得到1 133條Unigenes，其中多拷貝contigs有276個，單拷貝singlets有857個。通過預測開放閱讀框，計算得到松褐天牛觸角cDNA文庫GC含量為41.8%。通過與COG功能比對350條Unigenes被分到了21個功能類群。

王娟[16]構(gòu)建了松褐天牛觸角轉(zhuǎn)錄組，共獲得85 869條contigs序列，平均長度為297 bp；獲得37 242條Unigenes序列，平均長度為669 bp。NR注釋的結(jié)果表明，94.3%的Unigenes與赤擬谷盜[Tribolium castaneum（Herbst）]和中歐山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae Hopkins）的Unigenes相似性最高。對Unigenes按照COG功能注釋，可分為25個功能群，其中一般功能預測類，復制、重組和修復類包含的Unigenes個數(shù)最多。進一步篩選比對共獲得OBPs基因全長序列25條，片段序列4條；化學感受蛋白（CSPs）全長序列8條，片段序列4條；氣味受體（ORs）全長序列1條，片段序列8條；1條感覺神經(jīng)元膜蛋白（SNMPs）全長序列。上述研究結(jié)果為開展松褐天牛氣味結(jié)合蛋白和嗅覺識別機制的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 基因克隆

4.1 氣味結(jié)合蛋白基因

利用引誘劑可以有效地防治松褐天牛。為進一步加強引誘劑和天敵的應用研究，研究人員開展了關(guān)于松褐天牛氣味結(jié)合蛋白的初步研究工作，以期通過對松褐天牛嗅覺識別機制的研究，為有效開發(fā)更加適合的引誘劑提供研究基礎(chǔ)。

錢凱等[17]通過配體結(jié)合位點推測Minus-C OBP蛋白亞家族的MaltOBP2和MaltOBP6兩個基因具有不同的生理功能；通過組織表達譜結(jié)果推測這兩個OBP基因在松墨天牛中的功能不僅僅局限于嗅覺識別，或還有味覺感受、化學感受等其他生理功能。該研究結(jié)果為兩個OBP蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了基礎(chǔ)，為探索松墨天牛的化學感受機制提供了條件。

Gao等[18]克隆得到了松墨天牛4個OBPs基因MaltOBP2、MaltOBP3、MaltOBP4和MaltOBP5的全長，成功構(gòu)建松褐天牛OBPs基因原核表達載體pGEX-6p-1-MaltOBPx，并通過競爭結(jié)合實驗以1-NPN為探針研究MaltOBP3和MaltOBP5與17種揮發(fā)物的結(jié)合能力。結(jié)果表明，MaltOBP3和MaltOBP5能特異性地結(jié)合部分寄主揮發(fā)物，它們可能與松墨天牛的寄主選擇和定位有關(guān)。但尚未涉及對其功能的研究[18]。

王娟[16]成功克隆了松褐天牛Malt OBP9、Malt OBP10、Malt OBP19、Malt OBP21、Malt OBP24基因，其中Malt OBP9和Malt OBP21屬于Minus-C OBPs，Malt OBP10屬于Classic OBPs，Malt OBP19和Malt OBP24屬于Plus-C OBPs。利用熒光競爭結(jié)合實驗測定這5個Malt OBPs在中性和酸性pH環(huán)境下與18種寄主植物揮發(fā)物單體的結(jié)合特性。結(jié)果顯示5個Malt OBPs在中性pH環(huán)境下與揮發(fā)物的結(jié)合能力高于酸性pH環(huán)境。在中性條件下，Minus-C OBPs家族的2個Malt OBPs結(jié)合特性方面表現(xiàn)較為一致；Plus-C OBPs家族的2個Malt OBPs結(jié)合特性方面表現(xiàn)出較大差異。

以上研究均在松墨天牛觸角cDNA文庫和轉(zhuǎn)錄組的構(gòu)建基礎(chǔ)上開展，為明確松褐天牛氣味結(jié)合蛋白的功能，研制行為調(diào)節(jié)劑，以及明確氣味結(jié)合蛋白在昆蟲體內(nèi)的功能奠定了重要基礎(chǔ)。

4.2 肌鈣蛋白基因與原肌球蛋白基因

肌鈣蛋白（Troponin，Tn）是與骨骼肌和心肌收縮有關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，主要調(diào)節(jié)肌肉的收縮和舒張。由于昆蟲飛行肌以很高的收縮頻率運行，肌鈣蛋白的激發(fā)和松弛的調(diào)節(jié)就發(fā)揮尤其重要的作用[19]。原肌球蛋白（tropomyosin，Tm）是細肌絲中與肌動蛋白的結(jié)合蛋白，在肌肉收縮中起重要調(diào)節(jié)作用。

吳華俊等[20]研究推測松墨天牛肌纖維中存在多種TnT轉(zhuǎn)錄本，它們與其他調(diào)控因子共同影響肌肉的收縮。但MaTnT有多少轉(zhuǎn)錄本，MaTnT轉(zhuǎn)錄的時空表達模式如何，以及MaTnT如何與原肌球蛋白互作等仍需要進一步研究。吳華俊等[21]還從已經(jīng)構(gòu)建的松墨天牛cDNA文庫中篩選并鑒定了一個肌球蛋白輕鏈2基因，命名為MaMLC-2。軟件預測發(fā)現(xiàn)MaMLC-2屬于肌鈣蛋白C超家族成員。該研究發(fā)現(xiàn)MLC-2蛋白具有保守地結(jié)合Ca2+的功能，其在成蟲足中的表達量最高，這與足是主要的運動器官，含有豐富的肌肉蛋白有關(guān)。羅淋淋等[22]研究推測松墨天牛在取食松科植物的時候，原肌球蛋白能夠促使松樹產(chǎn)生誘導性防御。

4.3 其他基因

許雯等[23]分析了松墨天牛表皮蛋白（MoalICP）基因在幼蟲各組織中的表達量，發(fā)現(xiàn)MoalICP在這些組織中均有表達，說明其表達產(chǎn)物可能參與相應器官的結(jié)構(gòu)形成、蛻皮與變態(tài)，也可能與阻止外來物質(zhì)（如農(nóng)藥）的侵入有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)體壁中表皮蛋白基因表達量不是最高的，在脂肪體中的表達量更高，推測脂肪中的表皮蛋白基因參與表皮滲透能力更加顯著，與抗藥性的產(chǎn)生關(guān)系密切。羅淋淋等[24]在松墨天牛鐵蛋白亞基中發(fā)現(xiàn)了1個糖基化位點。昆蟲鐵蛋白亞基在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和血淋巴中，通常糖基化，這可能增強其穩(wěn)定性，并且有助于在胞內(nèi)靶向目標和受體結(jié)合[25]。蔡紫玲等[26]研究發(fā)現(xiàn)松墨天牛葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（MaGP1）為親水蛋白，含有活性位點、變構(gòu)位點、活性部位蓋子和兩個多膚結(jié)合位點5個功能位點，為進一步研究MaGPI的分子功能提供了依據(jù)。

5 農(nóng)藥脅迫對松墨天牛基因表達的影響

5.1 肌肉LIM蛋白基因

昆蟲LIM蛋白具有許多類似于脊椎動物肌肉蛋白的特征，有調(diào)控昆蟲飛行的作用。羅淋淋等[27]通過PT-qPCR方法研究在農(nóng)藥脅迫下松墨天牛LIM基因（MaLIM）的相對表達量，發(fā)現(xiàn)噻蟲啉的抑制作用最大。研究推測，在農(nóng)藥亞致死劑量作用下，松墨天牛蛹期蛻皮過程和生長發(fā)育功能會受到顯著影響。

5.2 延伸因子2（EF-2）基因

延伸因子（elongation factor，EF）是參與蛋白合成過程中肽鏈延伸的蛋白因子，在所有多細胞生物體的新陳代謝過程中發(fā)揮著非常重要的作用，它包括延伸因子EF-1和延伸因子EF-2[28]。EF-2的正常表達關(guān)系到機體細胞的生長及蛋白質(zhì)的合成。羅淋淋等[29]檢測了經(jīng)農(nóng)藥脅迫后，EF-2 mRNA在松墨天牛成蟲中的表達情況，結(jié)果顯示該基因在啶蟲脒作用后的相對表達量最高，其次是殺蟲雙，綠僵菌和白僵菌的脅迫作用無顯著差異，毒死蜱和滅多威的作用效果較弱。不同殺蟲劑作用下均導致該基因上調(diào)表達，這可能是松墨天牛產(chǎn)生的自我保護反應。

5.3 包囊蛋白基因

包囊是無脊椎動物對抗外源物質(zhì)的主要防御反應，包囊蛋白（encapsulation-relating protein，ERP）是昆蟲產(chǎn)生包囊反應時最先在外來物周圍積聚的蛋白[30]。毛珊珊等[31]檢測發(fā)現(xiàn)松墨天牛ERP（MaERP）經(jīng)澳氰菊酷、磷化鋁、Bt、印楠素、綠僵菌脅迫后，上調(diào)表達；經(jīng)阿維菌素脅迫后，下調(diào)表達。該研究為進一步研究MaERP基因在松墨天牛防御過程中的作用奠定了基礎(chǔ)，可為探索松墨天牛免疫系統(tǒng)與分子毒理互作關(guān)系提供參考。

5.4 核糖體蛋白（RPS15A）基因

核糖體（Ribosome）是細胞內(nèi)負責蛋白質(zhì)合成的重要細胞器。核糖體蛋白（Ribosomal protein，RP）和核糖體研究一直是遺傳學研究的重要領(lǐng)域。羅淋淋等[32]利用RT-qPCR分析了松墨天牛成蟲核糖體蛋白（RPS15A）基因在農(nóng)藥脅迫下的表達量，結(jié)果表明，僅溴氰菊酯處理組上調(diào)表達。但核糖體蛋白表達量與殺蟲劑抗性的關(guān)系究竟如何，是通過核糖體蛋白與殺蟲劑結(jié)合起作用，還是通過核糖體蛋白質(zhì)間的作用而發(fā)揮抗性作用，抑或為其他作用機制還需進一步探究。

5.5 氯胺磷、吡蟲啉、溴氰菊酯脅迫下對基因表達的影響

氯胺磷低毒、高效、安全，是中國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的有機磷殺蟲劑創(chuàng)新品種；吡蟲啉是新煙堿類殺蟲劑，已成為中國取代劇毒有機磷殺蟲劑的骨干品種；溴氰菊酯是擬除蟲菊酯類殺蟲劑，能殺滅對有機磷農(nóng)藥等產(chǎn)生抗藥性的害蟲。Lin等[33-35]比較研究松墨天牛對這3種農(nóng)藥分子響應的差異，篩選出差異基因和分子靶標。研究結(jié)果表明，細胞色素氧化酶亞基I基因在解毒代謝中有特殊作用，表皮蛋白基因沒有參與對這3種農(nóng)藥的抗性；ATP合酶亞基D基因、線粒體?；d體蛋白1基因等氧化磷酸化通路基因下調(diào)，說明氧化磷酸化引發(fā)了毒理學變化，這些蛋白質(zhì)磷酸化的影響可能是有機磷農(nóng)藥、吡蟲啉、溴氰菊酯的毒性機制之一，改變昆蟲磷酸化水平的蛋白質(zhì)可能是這些殺蟲劑的非傳統(tǒng)靶標；吡蟲啉、氯胺磷脅迫下，編碼絲氨酸蛋白酶、細胞色素P450還原酶、保幼激素酯酶、過氧化物酶和硫氧還蛋白半胱氨酸蛋白酶的基因轉(zhuǎn)錄水平下降，表明這兩種農(nóng)藥可延緩抗藥性并阻礙松墨天牛的發(fā)育；GO富集比較分析表明，在3種農(nóng)藥脅迫下，分子功能中“催化活性”富集的基因最多，細胞成分中“細胞”和“細胞組分”富集的基因最多，而生物學過程中，3種農(nóng)藥富集的GO不一致，這表明3種農(nóng)藥在對松墨天牛的毒性機理上有較大差別。

上述研究使用基因芯片作為研究平臺，具有集約化、系統(tǒng)化和高通量分析的優(yōu)點，為鑒定新農(nóng)藥、確定農(nóng)藥的生物選擇性奠定理論基礎(chǔ)；對以不同類型農(nóng)藥的準確的分子靶標為基礎(chǔ)和依據(jù)，科學、經(jīng)濟、合理地選用和交替使用不同殺蟲機理的農(nóng)藥，有針對性地防治害蟲，避免或延緩害蟲的抗藥性，提高防治效果等具有重要意義。

6 展望

近3年來，松墨天牛分子生物學領(lǐng)域的研究從個別基因的克隆發(fā)展到轉(zhuǎn)錄組水平，為高通量研究基因奠定了基礎(chǔ)；從單純的生物信息學分析發(fā)展到結(jié)合生理學、毒理學及化學生態(tài)學等綜合研究，充分展示了分子生物學的研究優(yōu)勢。基因芯片作為一種研究平臺，可用于分子毒理學研究，有助于新型殺蟲劑的開發(fā)和推廣應用。此外，借助于分子分類方法，可對傳統(tǒng)形態(tài)分類學進行有益的佐證和完善；松墨天牛保存方法和RT-qPCR內(nèi)參基因的篩選等基礎(chǔ)研究對松墨天牛分子生物學起到一定的推動作用。

分子生物學既是一種研究手段，也是一個重要的研究方向。松墨天牛分子生物學的研究日益深入，必然會對松墨天牛生物學、生理生化、化學生態(tài)等起到重要的引領(lǐng)作用，并以此為基礎(chǔ)，為松墨天牛的綜合治理提供理論支撐和應用參考。

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