一種薤白中性多糖的結構鑒定及體外抗氧化活性研究

張占軍,王富花,葛 洪,張 軍,李海鳳

(1.揚州市職業(yè)大學工程研究中心,江蘇揚州 225009; 2.揚州工業(yè)職業(yè)技術學院,江蘇揚州 225127; 3.南京農業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

一種薤白中性多糖的結構鑒定及體外抗氧化活性研究

張占軍1,3,王富花2,葛 洪1,張 軍1,李海鳳1

(1.揚州市職業(yè)大學工程研究中心,江蘇揚州 225009; 2.揚州工業(yè)職業(yè)技術學院,江蘇揚州 225127; 3.南京農業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

采用分步醇沉和柱層析的方法,從薤白中分離純化得到一種中性多糖AMP60N,其重均分子量為11200 u,由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖構成,經紅外光譜分析,同時結合高碘酸氧化、Smith降解及GC分析等手段,通過甲基化以及核磁共振波譜分析,初步確定了AMP60N主要由Glc(1→2)和Ara(1→5)構成,以Gal(1→6)和Glc(1→6)為支鏈的分子結構組成。對AMP60N清除各種自由基的研究表明其具有一定的體外抗氧化活性，呈現明顯的量效關系，其抗氧化能力弱于VC。

薤白,多糖,結構鑒定,抗氧化活性

薤白(AlliummacrostemonBunge),為百合科蔥屬多年生草本植物,又名小根蒜、野白頭、山蒜、苦蒜、小么蒜、小根菜、野蒜、野蔥等,屬藥食兩用植物,我國大部分地區(qū)均有分布,其新鮮根莖葉均可作為蔬菜食用,中藥中使用的薤白為將其莖葉及須根除去后,經沸水煮透,曬干或烘干后的炮制品[1]。已有研究發(fā)現,薤白中含有揮發(fā)油、甾體皂甙、含氮化合物及多糖等多種活性成分,具有抗氧化、抑菌、抑癌、抑制血小板聚集、調血脂、抗動脈粥樣硬化、鎮(zhèn)痛和耐缺氧等多種生理活性[2]。

多糖是自然界中廣泛存在的一類生物大分子,因其具有的穩(wěn)定性、安全性、生物相容性和豐富的生物活性等優(yōu)勢,被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料和化妝品等領域,深受人們關注?？寡趸钚允嵌嗵侵匾纳砘钚灾?已從自然界中發(fā)現大量的具有明顯抗氧化作用的多糖。前期已對薤白粗多糖體外抗氧化活性及其對小鼠急性肝損傷的保護作用進行了研究[3],本研究擬對薤白多糖60%醇沉組分進行純化、結構鑒定及抗氧化活性進行研究,以期為薤白多糖基礎研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薤白(野白頭) 購于安徽慧隆中藥飲片有限公司,產地江蘇丹陽;氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、苯酚、硫酸、考馬斯亮藍G-250、無水乙醇、三氟乙酸、碘酸鈉、乙二醇、硫酸鈉、溴化鉀等試劑 均為國產分析純;吡啶、鹽酸羥胺、醋酸酐、肌醇、碘甲烷等試劑 均為國產色譜純;DEAE-纖維素-52、Sephadex G-100、Pullulan、牛血清白蛋白、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、還原型輔酶Ⅰ(NADH)、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、半乳糖等試劑 購自美國Sigma公司。

H8453紫外可見分光光度儀 美國惠普公司;BRUKER-VECTOR22型傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克光譜儀器;HP 1100高效液相色譜系統(tǒng)(配有示差折光檢測器和數據處理系統(tǒng)) 美國惠普公司;GC-16型氣相色譜儀 日本島津公司;722S型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;HL-2B恒流泵與DBS-100A型自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠;Alpha 1-2型冷凍干燥機 英國LABCONCO公司;Bruker DRX-600型核磁共振儀 瑞士Bruker公司;MS Varian Satum 2200型氣相-質譜聯(lián)用儀 美國Varian公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 薤白烘干后粉碎,取過60目篩后粉末加石油醚回流脫脂3 h,固液分離后烘干,90%乙醇回流1 h,殘渣經干燥粉碎,得薤白預處理樣品,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 薤白多糖的分步醇沉 取薤白預處理樣品置圓底燒瓶中,按質量體積比1∶12(g/mL)加入去離子水,87 ℃溫度下攪拌提取100 min,提取結束后離心(5000 r/min,10 min),收集上清液,殘渣重復提取2次。上清液合并后減壓濃縮至一定體積,加乙醇至最終體積分數為40%,5000 r/min離心10 min,取上清液,上清液濃縮至無醇后,加乙醇至終濃度為60%,離心取沉淀物,凍干得薤白60%醇沉組分為粗多糖(AMP60)。

1.2.3 薤白粗多糖AMP60的分離純化 薤白粗多糖經DEAE-纖維素-52交換柱色譜進行初步分離純化,再用葡聚糖凝膠Sephadex G-100色譜柱進行進一步純化[4]，得到中性多糖AMP60N。

1.2.4 薤白多糖的基本理化性質分析 多糖樣品采用苯酚-硫酸法[5]測定總糖含量,采用考馬斯亮藍法測定糖醛酸含量,采用氯化鋇-明膠比色法測定硫酸基含量。

1.2.5 薤白多糖結構分析

1.2.5.1 單糖組成分析 薤白多糖樣品的單糖組成分析,采用糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法[6]。色譜柱:HP-5(0.25 μm×0.32 mm×30 m);程序升溫:120 ℃保持3 min,以3 ℃/min升至210 ℃,保持4 min;進樣口溫度250 ℃,檢測器溫度280 ℃,進樣量1.0 μL。

1.2.5.2 分子質量測定 采用高效液相凝膠滲透色譜法[4],進行薤白多糖的純度鑒定及相對分子質量測定。色譜柱:TSK-Gel G3000 SWxl(7.8 mm×300 mm,5 μm);柱溫25 ℃,示差檢測器,流動相為含0.1 mol/L Na2SO4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8),流速0.7 mL/min,進樣量20 μL。

1.2.5.3 紅外光譜分析 采用KBr壓片法進行薤白多糖樣品的紅外光譜分析[7]。取薤白多糖樣品,按1∶100比例與KBr研磨后壓成薄片,以KBr為參照物,在4000～500 cm-1范圍內進行紅外光譜測定。

1.2.5.4 高碘酸氧化、Smith降解及GC分析 高碘酸氧化、Smith降解反應參照文獻[8]報道的方法經適當修改進行。即取25 mg薤白多糖,溶于NaIO4溶液,4 ℃暗處反應,間歇振蕩,至吸光值基本穩(wěn)定,計算NaIO4消耗量。加乙二醇還原過量的高碘酸,取反應液用NaOH溶液進行滴定,計算甲酸的生成量。反應液加硼氫化鈉,靜置反應,反應完全后加少量乙酸分解多余的硼氫化鈉,然后自來水流水透析24 h,去離子水透析24 h。收集透析液,50 ℃減壓蒸發(fā)至干,加入三氟乙酸水解,制備糖腈乙酸酯衍生物,最后用氣相色譜法進行檢測。

1.2.5.5 甲基化分析 薤白多糖樣品的甲基化及GC/MS分析,參照文獻[9]報道的方法稍作修改。具體如下:取20 mg干燥的薤白多糖樣品于帶塞離心管中,加入1.0 mL的二甲基亞砜,超聲波并漩渦振蕩,加入制備好的NaOH-DMSO混懸液及碘甲烷,加蓋密封,反應完全后加去離子水終止甲基化反應。反應液轉入透析袋,去離子水透析48 h,冷凍干燥得甲基化多糖產物。產物經紅外光譜檢測,應在3400 cm-1附近無羥基的特征吸收峰,否則,重復上述操作。將甲基化完全的薤白多糖制備成糖腈乙酸酯衍生物,進GC-MS分析。色譜條件:DB-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫,初溫80 ℃,保溫1 min,以8 ℃/min升至210 ℃,保溫1 min,再以20 ℃/min升至260 ℃,保溫1 min。載氣為氦氣,進樣口溫度250 ℃,分流比1∶50,柱流速1.0 mL/min,質荷比(m/z)掃描范圍30～450,掃描速率2.5 scan/s。

1.2.5.6 核磁共振波譜分析 稱取30 mg薤白多糖樣品,溶于D2O,經核磁共振波譜儀進行1H-NMR和13C-NMR光譜分析,以四甲基硅烷(TMS)為內標。

1.2.6 體外抗氧化活性研究 以VC作為對照品,對薤白多糖AMP60N清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基進行清除能力測定,所有數據均測定3次,以平均值±標準差方式表示。

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 清除DPPH自由基能力的測定參照Xu等[10]報道的方法稍作修改。即取0.4 mmol/L的DPPH乙醇溶液0.5 mL,加入3.0 mL不同濃度(0.5～6.0 mg/mL)AMP60N溶液,混勻后于 25 ℃溫度下避光反應 30 min,然后在 517 nm波長下測定其吸光度。

DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中：A0為去離子水代替多糖樣品的吸光值,A1為多糖樣品測定吸光值,A2為無水乙醇代替DPPH溶液的吸光值。

表1 AMP60N的基本理化性質Table 1 Preliminary characterization of AMP60N

注:-:未檢出。

1.2.6.2 羥基自由基(OH·)清除能力的測定 清除羥基自由基(OH·)能力的測定按照文獻報道的方法[11]并稍作修改。具體為1.0 mL不同濃度(0.5～6.0 mg/mL)的AMP60N樣品,與1.0 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L),1.0 mL 水楊酸乙醇溶液(9.0 mmol/L),混勻后加入1.0 mL H2O2溶液(0.025%,w/v),在25 ℃溫度下反應60 min,用分光光度計在波長510 nm下測定吸光值。

羥基自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中,A0為去離子水代替多糖樣品的吸光值,A1為多糖樣品測定吸光值,A2為去離子水替代H2O2溶液的吸光值。

超氧陰離子自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中,A0為去離子水代替多糖樣品的吸光值,A1為多糖樣品測定吸光值,A2為磷酸緩沖液替代NBT溶液的吸光值。

1.3 數據處理

實驗數據以平均值±標準差方式表示,采用Origin Pro 9.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 AMP60的分離純化

2.1.1 AMP60的DEAE-纖維素-52色譜法分離 將薤白多糖60%醇沉組分AMP60溶于適量去離子水中,進行DEAE-52纖維素柱層析,依次用去離子水、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脫,自動收集器10 mL/管分部收集,苯酚硫酸法檢測各管糖含量,繪制洗脫曲線,如圖1所示。

圖1 AMP60的纖維素色譜洗脫曲線Fig.1 Elution profile of AMP60 on DEAE cellulose-52 column

從圖1可以看出,薤白多糖60%醇沉組分AMP60經DEAE-52纖維素柱層析后,多糖主要集中在去離子水洗脫部分,為中性多糖組分FN,其占AMP60的比例為53.74%。

2.1.2 FN的Sephadex G-100凝膠柱純化 經DEAE-52纖維素色譜柱初步純化的組分FN經Sephadex G-100凝膠柱色譜進一步純化,得到1個純化組分,命名為AMP60N,純化得率為62.63%。

2.2 AMP60及AMP60N的基本理化性質

薤白多糖60%醇沉組分AMP60及其純化組分AMP60N的總糖、蛋白質、糖醛酸及硫酸基含量如表1所示。

2.3 單糖組成分析

將AMP60N制備成糖腈乙酰酯衍生物后進行GC分析,保留時間與標準單糖的氣相色譜圖對照,從圖2可以看出,薤白多糖AMP60N由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖構成,3種單糖的摩爾比為9.73∶1.10∶1.00。

圖2 標準單糖(a)、AMP60N(b)糖腈乙酰酯衍生物的氣相色譜圖Fig.2 GC chromatograms of derivatives of standard monosaccharide(a)and AMP60N(b)

2.4 純度鑒定及相對分子質量測定

通過高效液相凝膠滲透色譜法,對AMP60N進行純度鑒定及相對分子質量測定。

表2 AMP60N甲基化糖殘基的GC/MS數據Table 2 GC/MS date of methylated sugar residues of AMP60N

從圖3可以看出,在HPGPC譜圖上顯示峰形為一對稱單峰,說明AMP60N為均一多糖。其保留時間14.487 min,通過以普魯蘭多糖繪制的分子量標準曲線,計算得到AMP60N重均分子量為11200 u。

圖3 AMP60N的高效液相凝膠滲透色譜圖Fig.3 HPGPC spectrum of AMP60N

2.5 紅外光譜分析

將AMP60N采用KBr壓片法進行紅外光譜分析,結果如圖4所示。

圖4 AMP60N的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of AMP60N

從圖4可以看出,3369 cm-1處的強吸收峰為O-H鍵的伸縮振動吸收,2937 cm-1處出現多糖的C-H強伸縮振動峰,這兩組吸收峰為糖類化合物的特征吸收峰。1024 cm-1處出現吸收峰是由吡喃糖環(huán)的C=O伸縮振動造成的,931 cm-1處和601 cm-1處分別是由吡喃環(huán)的非對稱環(huán)伸縮振動和對稱伸縮振動產生的吸收峰[13],表明AMP60N主要為吡喃環(huán)糖苷連接。

2.6 高碘酸氧化、Smith降解及GC分析

AMP60N在高碘酸氧化過程中,每摩爾糖基消耗高碘酸鈉量為1.6176 mol,產生甲酸0.1197 mol,說明AMP60N可能含有1→6位鍵合的糖基或非還原末端糖基,由于高碘酸消耗量大于2倍的甲酸生成量,說明還可能存在只消耗高碘酸而不生成甲酸的1→2、1→2,6、1→4或1→4,6等連接鍵型。進一步對AMP60N的Smith降解產物進行氣相色譜發(fā)現,產物中有甘油生成,說明可能存在產生甘油的鍵型或1→5連接的戊糖,產物中無赤蘚醇,說明不含有1→4和1→4,6鍵型的己糖。產物中未檢測到阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖,說明這三種單糖都是以可被高碘酸氧化的鍵型存在。

2.7 甲基化分析

AMP60N的甲基化產物經紅外光譜分析,羥基吸收峰基本消失,甲基吸收峰有所增強,說明甲基化完全。甲基化樣品再通過酸水解、硼氫化鈉還原以及乙?；?得到部分甲基化糖醇乙酸酯(PMAA)產物,對其進行GC-MS分析,根據質譜圖和單糖組成,AMP60N的甲基化糖殘基、主要質譜碎片(m/z)、保留時間、摩爾比以及連接鍵型列于表2。

從表2可以看出,薤白中性多糖AMP60N中吡喃葡萄糖以1,2位連接吡喃葡萄糖和1,2,6位連接吡喃葡萄糖方式存在,阿拉伯糖以末端殘基和1,5位連接阿拉伯糖的方式存在,而半乳糖1,2,6位連接的半乳糖方式存在。

2.8 核磁共振波譜分析

多糖的1H-NMR主要用來確定多糖結構中糖苷鍵的構型。但由于糖環(huán)碳上大部分質子受羥基的屏蔽作用,使得化學位移集中大部分在3～4 ppm范圍內,造成嚴重的信號重疊交叉,解析困難[14]。圖5為AMP60N的13C-NMR譜,可以明顯看出,在δ 103～104 ppm范圍內出現的4個碳信號,均為β型糖苷異頭碳的共振信號;在δ78～85 ppm范圍內出現了兩個碳信號,表明C-2,C-3或C-4中有碳發(fā)生取代。

圖5 AMP60N的13C-NMR圖譜Fig.5 13C-NMR spectrum of AMP60N

結合上述各種方法可以推斷,AMP60N主要由Glc(1→2)和Ara(1→5)構成,以Gal(1→6)和Glc(1→6)為支鏈,分支點位于Glc(1→2)的C-6處,末端殘基為Ara,各糖苷主要以β-吡喃糖形式存在。

2.9 抗氧化活性

2.9.1 DPPH自由基清除活性 不同濃度的薤白多糖AMP60N清除DPPH自由基的活性測定結果如圖6所示。結果表明,中性多糖AMP60N具有一定的DPPH自由基清除能力,且清除率隨著濃度增加而升高,在測定范圍內呈明顯的量效關系。但與VC的清除能力相比較而言,清除能力較弱。

圖6 AMP60N清除DPPH自由基的活性Fig.6 Scavenging activity of AMP60N on DPPH·

2.9.2 羥基自由基清除活性 不同濃度的中性多糖AMP60N清除羥基自由基(OH·)的活性測定結果如圖7所示。結果發(fā)現,AMP60N對于羥基自由基的清除能力具有明顯的量效依賴關系。在多糖濃度達6000 μg/mL時,羥基自由基清除率可達38.53%。

圖7 AMP60N清除羥基自由基的活性Fig.7 Scavenging activity of AMP60N on OH·

圖8 AMP60N清除超氧陰離子自由基的活性

3 結論

通過分步醇沉的方法,從藥食兩用植物薤白的60%醇沉組分中分離純化了一種中性多糖AMP60N,AMP60N重均分子量為11200 u,由阿拉伯糖,葡萄糖和半乳糖構成,3種單糖的摩爾比為9.73∶1.10∶1.00,經紅外光譜分析,同時結合高碘酸氧化、Smith降解及GC分析等手段,通過甲基化分析,核磁共振波譜分析,初步確定AMP60N的分子結構中存在有以1,2位和1,2,6位連接的葡萄糖,以及1,5位連接的阿拉伯糖和阿拉伯糖末端殘基,同時還存在以1,2,6位連接的半乳糖,各糖苷主要以β-吡喃糖形式存在。通過對AMP60N清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的活性實驗測定表明,AMP60N具有一定的體外抗氧化活性,且呈現明顯的量效關系,但與VC相比較,其抗氧化能力較弱。

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Structural characterization andinvitroantioxidant activities of a neutral polysaccharide fromAlliummacrostemonBunge

ZHANG Zhan-jun1,3,WANG Fu-hua2,GE Hong1,ZHANG Jun1,LI Hai-feng1

(1.Engineering Research Center,Yangzhou Vocational University,Yangzhou 225009,China; 2.Yangzhou Polytechnology Institute,Yangzhou 225127,China; 3.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

By using the method of stepwise ethanol precipitation and column chromatography,a neutral polysaccharide named AMP60N was isolated fromAlliummacrostemonBunge. The molecular weight of AMP60N was estimated to be 11200 u,which was composed of arabinose,glucose and galactose. AMP60N was characterized by using the periodic acid oxidation,Smith degradation,methylation,FT-IR,GC,GC-MS,NMR,etc. Theinvitroantioxidant assay of AMP60N showed that it had certain antioxidant activitiesinvitro,which showed dose-effect relationship,oxidation vesistance was weaker than VC.

AlliummacrostemonBunge;polysaccharide;structural characterization;antioxidant activities

2016-09-22

張占軍(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：moutaidc@163.com。

江蘇省基礎研究計劃(自然科學基金)項目(BK20141269)；江蘇省高校“青藍工程”中青年學術帶頭人資助[蘇教師(2016)15號]；江蘇省第五期“333高層次人才培養(yǎng)工程”資助。

TS201.2

A

1002-0306(2017)08-0077-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.007