一株明亮發(fā)光桿菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶的培養(yǎng)基優(yōu)化

劉彩琴,王 楠,陳薇青,金建昌,項(xiàng)麗艷

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州 310015)

一株明亮發(fā)光桿菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶的培養(yǎng)基優(yōu)化

劉彩琴,王 楠,陳薇青,金建昌,項(xiàng)麗艷

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州 310015)

通過(guò)響應(yīng)面方法對(duì)明亮發(fā)光桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)部分因子實(shí)驗(yàn)對(duì)葡萄糖、牛肉膏、氯化鉀、七水硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、MgSO4·7H2O、初始pH進(jìn)行系統(tǒng)考察,篩選出兩個(gè)影響較顯著的因素MgSO4·7H2O和葡萄糖添加量,然后通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化,建立以褐藻膠裂解酶酶活力為響應(yīng)值的二次回歸方程模型,獲得了最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/100 mL):葡萄糖1.211 g、牛肉膏0.2 g、氯化鉀0.5 g、七水硫酸亞鐵0.05 g、磷酸氫二鉀0.02 g、七水硫酸鎂0.005 g,初始pH8.6,在該優(yōu)化的培養(yǎng)條件下,褐藻膠裂解酶酶活為69.05 U/mL。與基礎(chǔ)培養(yǎng)基比,褐藻膠裂解酶產(chǎn)酶量提高了14.5倍,說(shuō)明本優(yōu)化工藝具有可行性。

褐藻膠裂解酶,響應(yīng)面優(yōu)化法,明亮發(fā)光桿菌,培養(yǎng)基

褐藻膠裂解酶通過(guò)β消去機(jī)制將褐藻膠催化降解,產(chǎn)生含有不飽和鍵的糖醛酸寡糖和不飽和鍵的糖醛酸單體[1-2]。按其底物特異性將其分為三類,第一類能降解甘露糖醛酸(PM),稱為PM酶(EC 4.2.2.3);第二類能降解古羅糖醛酸(PG),稱為PG酶(EC 4.2.2.11);第三類為雙功能酶,既能降解PM,也能降解PG[3]。近年來(lái)研究表明:褐藻膠裂解酶有助于抗生素殺死引起囊腫性纖維化病的粘液型銅綠假單胞菌[4];褐藻寡糖能刺激人內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng),刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[5-6],含有硫酸鹽基團(tuán)的褐藻膠衍生物有抑制腫瘤的活性[7]。由于褐藻寡糖具有多種生理活性,可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[8],尤其在新藥開(kāi)發(fā)、保健食品等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值[9],因此市場(chǎng)急需不同性質(zhì)的褐藻膠裂解酶,以便于應(yīng)用。

目前,褐藻膠裂解酶產(chǎn)生量偏低、分離難度較大、貯藏穩(wěn)定性差[9],這極大的限制了在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。前期研究中,獲得一株分泌褐藻膠裂解酶的嗜冷細(xì)菌,本文就該株菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,為褐藻膠裂解酶的理論研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明亮發(fā)光桿菌(Photosbacteriumphosphoreum) 本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏;胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉 杭州微生物試劑有限公司;葡萄糖、甘油、蔗糖、褐藻酸鈉、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、硫酸銅、氯化鈉、七水硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸銨、氯化銨 天津市北辰方正試劑廠;淀粉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;以上試劑均為分析純。

IS-RDD3搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YM30Z滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;LRH-250恒溫培養(yǎng)箱 國(guó)華儀器有限公司;PHS-25酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠;PL303電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Biofuge Primo R;UV-124型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津(香港)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(100 mL):胰蛋白胨2 g、酵母提取物0.5 g、NaCl 3 g、甘油1 g、瓊脂粉1.5 g[10]。

液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(100 mL):褐藻酸鈉0.5 g,蛋白胨0.2 g,氯化鈉0.5 g,磷酸氫二鉀0.2 g,七水硫酸鎂0.01 g,起始pH6.6。

1.3 培養(yǎng)方法

發(fā)酵條件:溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,250 mL三角瓶中裝液量30 mL,接種量為2%,種子培養(yǎng)時(shí)間24 h,發(fā)酵時(shí)間24 h。

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1.1 碳源實(shí)驗(yàn) 以0.5%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的褐藻酸鈉作為碳源,考察碳源對(duì)褐藻膠裂解酶產(chǎn)量的影響。

1.4.1.2 氮源實(shí)驗(yàn) 以1.4.1.1確定的最佳碳源為碳源,以0.2%的酵母提取物、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨作為氮源,考察氮源對(duì)褐藻膠裂解酶產(chǎn)量的影響。

1.4.1.3 無(wú)機(jī)鹽實(shí)驗(yàn) 以1.4.1.1確定的最佳碳源為碳源、1.4.1.2確定的最佳氮源為氮源,以0.5%的氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、硫酸銅和0.05%的七水硫酸亞鐵代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氯化鈉,考察無(wú)機(jī)鹽對(duì)褐藻膠裂解酶產(chǎn)量的影響。

1.4.1.4 pH實(shí)驗(yàn) 在1.4.1.1、1.4.1.2、1.4.1.3確定的最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)上,初始pH分別為6.6、7.6、8.6、9.6和10.6時(shí),考察初始pH對(duì)褐藻膠裂解酶產(chǎn)量的影響。

1.4.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、培養(yǎng)基初始pH為實(shí)驗(yàn)因素,以褐藻膠裂解酶活性為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),設(shè)計(jì)了部分因子實(shí)驗(yàn)(FFD)和中心組合實(shí)驗(yàn)(CCD),其水平編碼表見(jiàn)表1和表2。

表1 部分因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因子及編碼值Table 1 The coded and uncoded values of factors in FFD

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)因子及編碼值Table 2 Levels of variables used in the central composite design

1.5 褐藻膠裂解酶測(cè)定方法

改良的DNS(3,5-二硝基水楊酸)法:由于褐藻酸鈉的熱不穩(wěn)定性,對(duì)DNS 法進(jìn)行適當(dāng)改良。0.1 mL酶液加入1 mL 1%褐藻酸鈉溶液(0.05 mol/L、pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制)中,40 ℃ 反應(yīng)20 min后,加入1 mL DNS溶液,沸水浴反應(yīng)3 min,迅速冷卻后定容至10 mL,用紫外分光光度計(jì)于520 nm下測(cè)定吸光值[11]。通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0386A+0.0008(A代表吸光度,R2=0.9981)確定還原糖含量,根據(jù)還原糖的產(chǎn)生判斷褐藻膠裂解酶的活力。

1個(gè)酶活力單位(U)定義為:1 mL酶液在上述條件下,每分鐘產(chǎn)生1 μg還原糖所需要的酶量。

1 U=還原糖含量×10×稀釋倍數(shù)×1000/20

式中:10表示0.1 mL酶液與1 mL酶液的換算系數(shù),1000表示mg與μg換算系數(shù),20表示反應(yīng)時(shí)間。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三個(gè)重復(fù)的平均值,數(shù)據(jù)經(jīng)Excel和SAS 8.0分析和處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 碳源對(duì)褐藻膠裂解酶合成的影響 由圖1可知,明亮發(fā)光桿菌能利用不同碳源合成褐藻膠裂解酶,尤其是葡萄糖作為碳源時(shí),發(fā)酵液中褐藻膠裂解酶的活性達(dá)到13.0 U/mL,而以蔗糖為碳源時(shí)褐藻膠裂解酶的活性最低,為3.96 U/mL。由此也可以看出,明亮發(fā)光桿菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶并非受到褐藻酸鈉的誘導(dǎo),這與菌株QZ-4[12]誘導(dǎo)產(chǎn)酶不同。

圖1 碳源對(duì)褐藻膠裂解酶合成的影響Fig.1 The effect of carbon on alginate lyase production

圖2 氮源對(duì)褐藻膠裂解酶合成的影響Fig.2 The effect of nitrogen on alginate lyase production

2.1.2 氮源對(duì)褐藻膠裂解酶合成的影響 由圖2可見(jiàn),明亮發(fā)光桿菌能利用牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨合成褐藻膠裂解酶,其中牛肉膏為氮源時(shí)活性最高,達(dá)47.7 U/mL,而以酵母提取物和氯化銨為氮源時(shí),幾乎不合成褐藻膠裂解酶。資料顯示,中華黃海桿菌(Gilvimarinuschinensis)QM42產(chǎn)酶的最適氮源為蛋白胨[13],假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)產(chǎn)酶的最適氮源為氯化銨[14],這說(shuō)明不同菌屬產(chǎn)酶所利用的最佳氮源種類差別較大。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)褐藻膠裂解酶合成的影響 由圖3可知,明亮發(fā)光桿菌能利用氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀和七水硫酸亞鐵合成褐藻膠裂解酶,其中氯化鉀時(shí)活性最高,達(dá)52.1 U/mL,培養(yǎng)基中添加0.05%的七水硫酸亞鐵時(shí)酶活30.3 U/mL,而培養(yǎng)基中有氯化鈣時(shí),幾乎不合成褐藻膠裂解酶。研究發(fā)現(xiàn):BacillusweihaiensisAlg07能利用氯化鉀和氯化鈣產(chǎn)酶[15],鈣離子對(duì)AcinetobacterX8產(chǎn)褐藻膠裂解酶有抑制作用[9],假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)不能利用七水硫酸亞鐵合成褐藻膠裂解酶[14]。這說(shuō)明不同菌屬產(chǎn)酶所利用的無(wú)機(jī)鹽種類差別較大。

圖3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)褐藻膠裂解酶合成的影響Fig.3 The effect of inorganic salt ions on alginate lyase production

鑒于明亮發(fā)光桿菌利用氯化鉀產(chǎn)酶量最高,0.05%的七水硫酸亞鐵時(shí)產(chǎn)酶較高,所以需進(jìn)一步考察氯化鉀和七水硫酸亞鐵對(duì)產(chǎn)酶的影響。

2.1.4 pH對(duì)褐藻膠裂解酶合成的影響 由圖4可知,培養(yǎng)基初始pH從6.6～10.6變化時(shí),酶活先升高,后降低,以8.6時(shí)酶活最高。所以初始pH宜為8.6。由此看來(lái),偏堿性環(huán)境利于明亮發(fā)光桿菌發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶。

圖4 pH對(duì)褐藻膠裂解酶合成的影響Fig.4 The effect of pH on alginate lyase production

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 部分因子實(shí)驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)中獲得的最適條件為基礎(chǔ),將其值確定為中心值,并進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄U(kuò)充而成為自變量的取值范圍,以褐藻膠裂解酶為指標(biāo),以期找到培養(yǎng)基對(duì)酶活影響顯著的因素。部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The design and results of FFD

注:x1=(X1-0.5)/0.5;x2=(X2-0.2)/0.2;x3=(X3-0.5)/0.5;x4=(X4-0.05)/0.05;x5=(X5-0.2)/0.2;x6=(X6-0.01)/0.01;x7=(X7-8.6)/2。

表4 部分因子實(shí)驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA) for selected factorial model

對(duì)部分因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析表明:葡萄糖(X1)對(duì)褐藻膠裂解酶合成影響顯著(95%的水平),MgSO4·7H2O(X6)對(duì)褐藻膠裂解酶合成影響極顯著(99%的水平),而牛肉膏(X2)、KCl(X3)、FeSO4·7H2O(X4)、K2HPO4(X5)和pH(X7)對(duì)褐藻膠裂解酶合成影響不顯著(90%的水平),各因子間沒(méi)有交互作用。因此,將牛肉膏(X2)、KCl(X3)、FeSO4·7H2O(X4)、K2HPO4(X5)和pH(X7)確定在中心點(diǎn),對(duì)葡萄糖(X1)和MgSO4·7H2O(X6)作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。

由回歸分析結(jié)果可得培養(yǎng)基成分對(duì)褐藻膠裂解酶合成的一次擬合線性回歸方程:

Y=39.8110+7.53438x1+1.9393x2+1.9568x3+1.8518x4-2.06813x5+10.4643x6-4.35312x7

式(1)

對(duì)方程(1)進(jìn)行方差分析,F=2.48,p=0.0801,說(shuō)明模型在概率α=0.05水平上足夠擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

從分析結(jié)果還可以看出:葡萄糖(X1)、牛肉膏(X2)、KCl(X3)、FeSO4·7H2O(X4)和MgSO4·7H2O(X6)對(duì)褐藻膠裂解酶活性影響是正面的,而K2HPO4(X5)和pH(X7)對(duì)褐藻膠裂解酶活性影響是負(fù)面的。有研究報(bào)道,Mg2+對(duì)褐藻膠裂解酶合成具有一定的影響,是菌體產(chǎn)酶不可或缺的元素[16-17]。

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值與中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行t-檢驗(yàn),T統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)結(jié)果表明,在方差相等和方差不等的條件下,中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)褐藻膠裂解酶(43.90)和部分重復(fù)實(shí)驗(yàn)褐藻膠裂解酶(38.79)差異極顯著(p<0.01),說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)點(diǎn)在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)范圍之內(nèi)。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化 以褐藻膠裂解酶活性為指標(biāo),利用中心組合設(shè)計(jì)對(duì)影響顯著的這兩個(gè)獨(dú)立的過(guò)程變量的濃度進(jìn)行優(yōu)化,即對(duì)葡萄糖(X1)和MgSO4·7H2O(X6)濃度進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 中心組合設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experimental designs and the results of central composite design(CCD)

注:x1=(X1-0.5)/0.3536;x6=(X6-0.01)/0.007。

表6 中心組合實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面分析結(jié)果Table 6 Regression coefficients and their significance from the results of CCD

表7 中心組合實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance(ANOVA)for the model

從表6和表7分析結(jié)果可知,該模型在63.08%概率水平上回歸顯著。用多項(xiàng)式回歸技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合所得二次多項(xiàng)式方程(3)為:

Y=46.789774+16.876086x1-1.574334x6- 3.366378x12-2.205000x1x6-6.234664x62

式(3)

對(duì)方程(3)求導(dǎo),可以得到模型的極大值處,當(dāng)x1=2.011,x6=-0.668,即葡萄糖為1.211 g,MgSO4·7H2O為0.005 g。此時(shí)模型預(yù)測(cè)的褐藻膠裂解酶酶活為70.08 U/mL。

為了證實(shí)模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的擬合程度,在上述兩因子的取值處進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),其響應(yīng)量結(jié)果為69.05 U/mL(N=3),預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間具有良好的擬合性,表明了模型的有效性。

經(jīng)響應(yīng)面分析獲得的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為(g/100 mL):葡萄糖1.211 g、牛肉膏0.2 g、氯化鉀0.5 g、七水硫酸亞鐵0.05 g、磷酸氫二鉀0.02 g、七水硫酸鎂0.005 g,初始pH8.6。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面方法對(duì)明亮發(fā)光桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,利用部分因子實(shí)驗(yàn)確定了影響產(chǎn)酶量的主要因素是MgSO4·7H2O(X6)和葡萄糖(X1),針對(duì)MgSO4·7H2O(X6)和葡萄糖(X1)進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn),建立了MgSO4·7H2O(X6)和葡萄糖(X1)與褐藻膠裂解酶之間的數(shù)學(xué)模型,由響應(yīng)面確定了明亮發(fā)光桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為(g/100 mL):葡萄糖1.211 g、牛肉膏0.2 g、氯化鉀0.5 g、七水硫酸亞鐵0.05 g、磷酸氫二鉀0.02 g、七水硫酸鎂0.005 g,初始pH8.6,最后經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明明亮發(fā)光桿菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶酶活為69.05 U/mL。與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比,褐藻膠裂解酶產(chǎn)酶量提高了14.5倍。

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[17]劉航,曹海龍,李曙光,等.紫色鏈霉菌產(chǎn)褐藻膠裂解酶培養(yǎng)條件的初步研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(22):13282-13284.

Optimization of culture medium for alginate lyase byPhotosbacteriumphosphoreum

LIU Cai-qin,WANG Nan,CHEN Wei-qing,JIN Jian-chang,XIANG Li-yan

(College of Biology and Environment Engineering,Zhejiang Shuren University,Hangzhou 310015,China)

In order to enhance the production of alginate lyase byPhotosbacteriumphosphoreum,response surface methodology was applied to optimize the culture medium. Based on the single factor experiment,a fractional factorial design was used to investigate the main factors affecting alginate lyase yield. The results showed that two factors played important roles in the production of alginate lyase. Central composite design and response surface analysis were applied to establish a second-order regression equation model for the yield of alginate lyase. At last,the optimal fermentation medium were obtained by response surface analysis as follows:glucose 1.211 g,beef extract 0.2 g,KCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.05 g,K2HPO40.02 g,MgSO4·7H2O 0.005 g,initial pH8.6. Under the optimal conditions,the activity of alginate lyase reached 69.05 U/mL. By optimization of culture medium,production of alginate lyase was improved 14.5 times compared to basic culture medium.In conclusion,the optimized process has good reliability.

alginate lyase;response surface methodology;Photosbacteriumphosphoreum;culture medium

2016-09-01

劉彩琴(1975-),女,副教授,研究方向:食品科學(xué),E-mail:sailor603@126.com。

浙江樹(shù)人大學(xué)中青年學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)；浙江樹(shù)人大學(xué)環(huán)境工程重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目。

TS201.3

A

1002-0306(2017)08-0156-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.022